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.MATERIALI E METODI
7.1.
Materiale vegetale e condizioni di crescita (pre-harvest)
Le analisi sono state condotte su pomodori di due genotipi differenti: il wild type cv Money Maker (MM) ed il mutante fotomorfogenico High Pigment-1
(Hp-1).
Le piante sono state fatte germinare in ammendante torboso per poi essere trasferite in vasi più capienti contenenti lo stesso substrato. Infine hanno trovato definitiva collocazione in vasi del diametro di 22 cm contenente pomice e fertilizzante NPK (24:8:16) a rilascio controllato, pari a 2 grammi/litro.
Le piante sono state messe definitivamente a dimora sotto due tunnel plastici (Figura 1) caratterizzati da diverse condizioni di luce. Nel primo era permesso il passaggio dell’intero spettro luminoso, si trattava quindi di una condizione di controllo, mentre nel secondo tunnel tramite uno speciale film plastico in polietilene (UV-B adsorber benzofenone), era schermato il passaggio della radiazione UV-B e costitutiva perciò il trattato.
Le condizioni luminose applicate sono state analizzate mediante spettroradiometro UV-Vis ( Spectrometer UV-Vis Fly-by S.r.l., Livorno). La disposizione delle piante all’interno dei tunnel è stata condotta in maniera completamente randomizzata, in modo da limitare il più possibile le eventuali interferenze rappresentate dalle posizioni relative occupate dalle singole piante.
Le bacche, scelte tra quelle che non presentassero difetti esterni e fossero cresciute ben esposte alla luce solare, sono state prelevate a tre stadi di maturazione ,ovvero allo stadio verde (V) (35-40 giorni dopo l'impollinazione (DPA)), all'invaiatura (3 giorni dopo lo stadio di breaker) ed alla maturità completa (M) (7 giorni dopo lo stadio di breaker) seguendo le modalità riportate
da Grierson e Kader (1986) in cui frutti del diametro di 1 cm sono presi come riferimento corrispondente a 7 DPA.
Figura1 I due tunnel plastici di controllo e trattamento( -UVB) utilizzati nell’esperimento
7.2.
Campionamento pomodori destinati ad analisi
spettrofotometriche
Il prelievo dei frutti da sottoporre ad analisi è stato compiuto a due diversi stadi di maturazione, precisamente allo stadio verde (mature green), allo stadio dell’invaiatura (turning) ( Figura 2) allo scopo di valutare quantitativamente e qualitativamente il “potere antiossidante” dei pomodori appartenenti alle due linee in esame, in funzione non solamente delle differenti condizioni luminose, ma anche del diverso stadio di maturazione.
Figura 2: Bacche di pomodoro della cv Money Maker e del mutante High Pigment-1 a tre
diversi stadi di maturazione.
Una volta raccolte, le bacche sono state poste all’interno di celle climatiche (0,48 m3) in cui luce e temperatura erano controllate mediante sistemi automatici ( Temperatura: 18 ±1 °C; luce prodotta da lampade ad incandescenza poste all’esterno delle celle ). Il tenore idrico all’interno delle celle era mantenuto costante a circa 75-80% grazie all’inserimento ogni giorno nelle celle di vaschette piene d’acqua. All’interno di una delle due celle sono state posizionate tre lampade emittenti radiazioni UV-B ( Philips Ultraviolet B, TL 20W-12RS), poste ad una distanza di circa 45 cm dalla superficie dei pomodori, i quali subivano un trattamento giornaliero +B di 30 minuti (irradianza totale delle lampade UV-B: 1,34 W/m2; dose giornaliera: 2,412 KJ/m2). Parallelamente una uguale quantità di pomodori veniva posta nella seconda cella in condizioni di totale assenza di radiazione UV-B. Le bacche sono rimaste all’interno delle celle fino al raggiungimento del completo stadio di maturazione red ripe.
Successivamente i tessuti della buccia e della polpa sono stati separati accuratamente e congelati in azoto liquido per essere conservati a -80°C fino al momento dell’analisi.
7.3.
Campionamento e misurazione dell’emissione di etilene
Durante il periodo vegetativo è stata misurata l’emissione di etilene endogeno da parte dei pomodori delle due linee Money Maker, e High Pigment-1, valutati a tre stadi maturativi diversi: mature green, turning, red ripe. L’emissione di etilene è stata determinata mediante un gascromatografo equipaggiato con un detector a ionizzazione di fiamma. I singoli frutti sono stati incubati all’interno di contenitori a tenuta d’aria (1,1L) per 1/2 h a temperatura ambiente. Due ml di gas campione sono stati quindi recuperati mediante una siringa ipodermica ed iniettati in colonna. Successivamente i pomodori allo stadio di MG e TU sono stati portati a completa maturazione all’interno delle celle climatiche sopra citate, subendo quindi in post-harvest un trattamento +UV-B o –UV-B. Una volta raggiunto lo stadio red ripe è stata nuovamente misurata l’emissione di etilene di tali bacche.
Figura 3: Stadi di maturazione del pomodoro
7.4. Dosaggio spettrofotometrico dell’attività antiossidante totale
tramite ABTS
Con questa procedura viene dosata l’attività antiossidante totale dei fenoli di buccia e polpa di pomodoro tramite la riduzione del catione radicalico ABTS+. (radicale monocationico dell’acido 2,2’-azinobis -3- etilbenzotiazoline -6- sulfonico) come indicatore indiretto della attività antiossidante posseduta dal frutto di pomodoro.
Il monocatione radicale ABTS.+ si forma dall’ossidazione dell’ABTS tramite
persolfato di potassio (K2S2O8 ) e viene ridotto dalla presenza di antiossidanti donatori di idrogeno. L’ABTS in forma cationica ha un colore azzurro-verde e la sua assorbanza può essere letta a 734 nm allo spettrofotometro. Invece l’ABTS in forma non cationica non può essere letto a tale lunghezza d’onda, quindi l’interazione con i fenoli del pomodoro che sono antiossidanti, riducono parte dell’ ABTS.+ facendo diminuire il valore di assorbanza. La reazione tra ABTS e K
persolfato per dare il catione avviene dopo circa 6 ore, per cui la soluzione, va
preparata prima di cominciare l’esperimento. Da protocollo, l’ ABTS.+ a 734 nm deve dare un’assorbanza di 0.7, quindi si fanno le appropriate diluizioni.
Retta di taratura con Trolox
Il Trolox è un antiossidante standard.
Preparare una soluzione con 0,00626 g di Trolox in 10 ml di Etanolo in modo che la soluzione sia 2,5 m M .
Poi diluire 0,35 ml di tale soluzione con 4,65 ml di etanolo in modo da raggiungere una molarità di 176 μ M. Poi fare diluizioni progressive 1:2 della soluzione precedente (2 ml di etanolo e 2 ml di Trolox della soluzione precedente) in modo da arrivare ad avere soluzioni della concentrazione di 88 μ M, 44 μ M, 22 μ M e 11 μ M. Quindi si legge l’assorbanza del bianco (etanolo), e delle soluzioni a diversa concentrazione; le misure vengono effettuate a 4 minuti.
Nella retta di taratura (y=4,317x) in ascissa riportiamo la molarità delle soluzioni di trolox e in ordinata la % di inibizione dell’assorbanza, che si calcola
con la seguente formula:
% inibizione = 1 – (abs Campione/ abs Bianco) × 100 Si ottiene quindi una retta simile alla sottostante
Figura 4: Retta di taratura Trolox
Preparazione della soluzione di ABTS
Per preparare tale soluzione, aggiungere 88 μl di K persolfato (140 m M ) a 5 ml di ABTS ( 7 m M in acqua). Tale soluzione deve essere preparata 12-16 ore prima del saggio e mantenuta al buio a temperatura ambiente. Rimane stabile almeno 2 giorni. Diluire quindi la soluzione con etanolo fino a che l’assorbanza a 30 ˚C sia 0,700 circa ( diluzione 1:88 circa).
Misura del potere antiossidante dell’estratto
Si miscelano 100 μl di estratto puro con 1 ml di soluzione ABTS diluita. Poi si fanno diluizioni successive della soluzione precedente con metanolo all’80%, per
esempio 1:5, 1:10. Quindi si misurano le assorbanze delle soluzioni a diversa concentrazione dopo 4 minuti. Tramite un foglio di calcolo apposito vengono quantificate le inibizioni di assorbanza e la concentrazione relativa di Trolox che viene riportata come millimoli/100 g di peso fresco; le concentrazioni di trolox vengono paragonate a quelle ipoteticamente presenti nell’estratto e responsabili della riduzione del catione e della relativa minore assorbanza rilevata.
7.5. Estrazione e determinazione del contenuto di Acido
Ascorbico e Deidroascorbico
L’ acido ascorbico esiste in due forme enantiomere, ma solo una di esse, l’enantiomero (5R) -5- [ (1S) -1,2- diidrossietil ] -3,4- diidrossifurano -2 (5H) -one è la vitamina C. E’ un composto molto idrosolubile, spiccatamente acido, che si presenta sotto forma di cristalli inodori e insapori con pH circa 2,5 e rotazione ottica spacifica di circa +20 gradi. La vitamina C possiede una forte azione riducente a seguito della presenza di un gruppo enediolico, infatti in presenza di ossigeno e metalli, tende ad ossidarsi e a formare l’acido deidroascorbico e acqua ossigenata. Grazie alla forte azione riducente, la vitamina C è utilizzata in molte reazioni di ossidoriduzione, in particolare è in grado di donare un elettrone, formando cosi l’acido semideidroascorbico, il quale può donare un secondo elettrone, generando cosi l’acido deidroascorbico. Il prodotto finale delle reazioni descritte, l’acido deidroascorbico, può venir ridotto ad opera di un enzima dipendente dal glutatione, la deidroascorbato reduttasi, rigenerando, cosi, l’acido ascorbico. Solamente l’enantiomero L è biologicamente attivo.
Quest’analisi permette di determinare l’acido ascorbico ridotto e quello totale e, per esclusione anche a quello ossidato.
L’analisi si basa sulla riduzione del Fe 3+ a Fe 2+ da parte dell’acido ascorbico a cui fa seguito la determinazione spettrofotometrica dello ione Fe 2+ complessato
con 2,2- dipiridile. L’acido deidroascorbico è ridotto ad ascorbico mediante incubazione con DTT; la determinazione dell’acido ascorbico totale avviene previa rimozione dell’eccesso di DTT con NEM ( N-etilmaleimide).
Mentre l’acido ascorbico ridotto è misurabile, al deidroascorbico si aggiunge DTT, un agente riducente capace di sostituirsi all’acido ascorbico nella riduzione del Fe3+. Sommando i due valori trovati otteniamo la concentrazione totale.
La concentrazione di acido deidroascorbico è poi calcolata dalla differenza di acido ascorbico totale e acido ascorbico senza pretrattamento.
Per l’estrazione si è omogeneizzato polpa e buccia di pomodoro in un mortaio con l’aggiunta di azoto liquido e acido metafosforico al 5% in rapporto 1:2,5 (p:v).
Successivamente il materiale pestato viene posto in tubi e centrifugato a 15000 g per 30 minuti a 4°C. Il surnatante viene recuperato e annotato il volume, dopodiché viene neutralizzato a pH 7.0 con l’aggiunta di NaOH 1,5 M ( circa 250 µl ogni ml di estratto).
Per il dosaggio si sono preparate 3 eppendolf, rispettivamente per il bianco, il campione tal quale e la diluizione 1:2. In ognuna sono stati messi i reagenti e acqua come riportato in tabella 1.
BIANCO CAMPIONE CAMPIONE 1:2
H2O 600 µl 0 300 µl
CAMPIONE 0 600 µl 300 µl
TCA 300 µl 300 µl 300 µl
AGITARE E LASCIARE INCUBARE IN GHIACCIO PER 5 MINUTI
NaOH 15 µl 15 µl 15 µl
AGITARE CON VORTEX E CENTRUFARE A 4000 RPM 2 MINUTI RECUPERARE IL SURNATANTE
Per la determinazione dell’acido ascorbico (ASA) e dell’acido ascorbico totale (ASA+DHA) sono stata fatte tre repliche per i bianchi (sia il bianco ASA che il bianco totale), e per ogni campione ( ASA e ASA+DHA con le rispettive diluizioni).
Per il dosaggio dell’ASA si aggiungono a 100 µl di surnatante, 100 µl di tampone Na-K-PO4 150 mM pH 7,4 e 100 µl di H2O.
Per determinare il contenuto di acido ascorbico totale (ASA+DHA) si aggiungono a 100 µl di surnatante, 100 µl di tampone e 50 µl di ditiotreitolo (DTT) 10 mM e, dopo agitazione ed incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, 50 µl di N-etilmaleimide (NEM) allo 0,5%.
Per entrambe le determinazioni, si agitano i campioni con vortex e si aggiungono 200 ml di TCA al 10%, 200 ml di H3PO4 al 44%, 200µl di α-α’ dipyridil al 4% (in etanolo 70%) e 100 µl di FeCl3 al 3% (quest’ultimo in agitazione sul vortex per impedire la precipitazione).
Dopo vigorosa agitazione si incubano i campioni a 37°C per 30-60 minuti in un bagnetto d’acqua.Successivamente si effettuano le letture dell’assorbanza ad una lunghezza d’onda di 525 nm. Per entrambe le determinazioni, si sottrarre il valore di assorbanza del bianco rispettivamente dell’ ASA e del totale al valore determinato per ogni campione. Il contenuto di acido ascorbico singolo e totale (ASA+DHA) viene calcolato sulla base di una retta di taratura ottenuta con soluzioni standard di ASA (madre 3 mM) in concentrazioni note. La retta di taratura corrisponde a quella sottostante.
Figura 5: retta di taratura ascorbato
Preparazione delle soluzioni
KOH 1.5M 0.84 g in 10 ml Acido metafosforico 5 g in 100 ml TCA 3 g in 30 ml NaOH 3 g in 25 ml Tampone fosfato pH 7,4: K-fosfato monobasico 0.51 g in 25 ml Na-fosfato bibasico 0.53 g in 25 ml H3PO4 (85%) 12.95 ml in 25 ml
DTT 0.0156 g in 10 ml (preparare fresco ogni due settimane) NEM 0.05 g in 10 ml (preparare fresco ogni due settimane)
FeCl3 0.3 g in 10 ml (ogni giorno fresco, tenere al buio)
Bypiridil 0.4 g in 7.3 ml di etanolo e poi portare a 10 ml con H2O (ogni giorno fresco, tenere al buio)
7.6. Analisi spettrofotometriche UV/VIS
Fenoli totaliI fenoli totali sono stati quantificati tramite il metodo del Folin- Ciocalteu, adattato ai nostri campioni, in accordo con Barbolan et al. 2003.
In una provetta di vetro si aggiungono: - 25 µl di campione;
- 125 µl di reagente Folin-Ciocalteu; - attendere 8 minuti;
- 600 µl di acqua distillata;
- 500 µl di una soluzione di sodio carbonato al 20%; per un volume finale di circa 2,4 ml.
Dopo 30 minuti di attesa, durante i quali la reazione si realizza e si stabilizza, il contenuto in fenoli totali è stato determinato come mg equivalenti di acido gallico, dopo aver misurato l’assorbanza a 750 nm in cuvette apposite per leggere lunghezze d’onda nel visibile.
Flavonoidi totali
I flavonoidi totali sono stati quantificati in accordo con metodo di Kim et al. 2003.
In una provetta eppendorf si aggiungono - 100 µl di campione estratto;
- 60 µl NaNO2 al 5% (attendere 5 minuti); - 40 µl di AlCl2 al 10% (attendere 5 minuti); - 400 µl NaOH 1 M;
- 200 µl di acqua distillata.
Il contenuto di flavonoidi è stato misurato tramite lettura dell’assorbanza a 510 nm ed espresso come mg equivalenti di catechina in cuvette apposite per leggere lunghezze d’onda nel visibile.
Flavonoli
Il contenuto di flavonoli è stato determinato in accordo al metodi proposto da Romani et al., 1996.
In una provetta eppendorf sono stati aggiunti: - 25 µl di campione estratto;
- 225 µl di etanolo al 10%;
- 250 µl di una soluzione di HCl 0,1% in etanolo 95%; - 1 ml di HCl 2%.
Il contenuto in flavonoli è stato determinato tramite lettura a 360 nm ed espresso come mg equivalenti di quercitina. La lettura dell’assorbanza è avvenuta in cuvette apposite per leggere lunghezze d’onda nell’ultravioletto.
7.7. Analisi statistica
I valori ottenuti dalle nostre analisi, eseguite in tre repliche, sono stati valutati tramite analisi della varianza (ANOVA) con il Tuckey-Kramer test per stabilire la significatività dei dati ottenuti.
