Materiali e metodi

(1)

Materiali e metodi

I materiali necessari utilizzati per l’applicazione di questo studio sono: -‐Cappa Biohazard a flusso laminare

-‐Incubatore a 36 ± 1°C e 5 ± 1% in CO2

-‐Bagnomaria

-‐Pipetta multicanale -‐Microscopio invertito

-‐Micropiastre sterili a 96 pozzetti

-‐Terreno di crescita per colture cellulari Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1X) -‐Tripsina (1X)

-‐Siero Fetale Bovino -‐Cellule Verocells -‐Cellule KB -‐Virus Polio

-‐Virus del morbillo

-‐Concentrati di immunoglobuline -‐Siero di pazienti

(2)

Caratteristiche generali dei concentrati di immunoglobuline

I concentrati di immunoglobuline appartengono alla categoria farmaceutica dei sieri immuni e immunoglobuline, umane normali, per somministrazione endovenosa.

Tali soluzioni vengono prodotte a livello industriale a partire da plasma di origine umana destinato al frazionamento per la produzione di medicinali plasma derivati; per tale categoria farmaceutica il pool di plasma destinato alla lavorazione è costituito da non meno di 1000 donazioni. Per questo motivo i concentrati di immunoglobuline umana normale contengono anticorpi IgG presenti nella popolazione normale ed il livello di distribuzione di sottoclassi di immunoglobuline G è strettamente proporzionale a quella nel plasma umano nativo secondo la seguente tabella:

Indice Indice

Ig vena 50 g/l soluzione per infusione

Riassunto delle Caratteristiche del Prodotto – (Fonte: A.I.FA.)

INDICE DEI PARAGRAFI

Ultimo aggiornamento pagina: 10/06/2016

01.0 DENOMINAZIONE DEL MEDICINALE

-Ig VENA 50 g/l Soluzione per infusione

02.0 COMPOSIZIONE QUALITATIVA E QUANTITATIVA

-Immunoglobulina umana normale (IVIg). Un ml di soluzione contiene:

Immunoglobulina umana normale ……….. 50 mg (purezza: almeno il 95% di IgG)

Un flaconcino da 20 ml contiene: 1 g di immunoglobulina umana normale Un flaconcino da 50 ml contiene: 2,5 g di immunoglobulina umana normale Un flaconcino da 100 ml contiene: 5 g di immunoglobulina umana normale Un flaconcino da 200 ml contiene: 10 g di immunoglobulina umana normale

Distribuzione delle sottoclassi di IgG (valori approssimativi):

IgG1 62,1 %

IgG2 34,8 %

IgG₃ 2,5 %

IgG4 0,6 %

Il contenuto massimo di IgA è 50 microgrammi/ml. Prodotto da plasma di donatori umani.

Eccipienti con eﬀetti noti:

Il prodotto contiene 100 mg di maltosio per ml.

Questo prodotto medicinale contiene 3 mmol/litro (o 69 mg) di sodio. Da tenere in considerazione per i pazienti che seguono

≡

Menu

Questo sito utilizza cookie. Proseguendo nella navigazione acconsenti all'utilizzo dei cookie. Ulteriori informazioni Ok

Un ml di soluzione può contenere 50 mg o 100 mg di immunoglobuline con una purezza di almeno il 95% di IgG al profilo elettroforetico e con con un contenuto massimo di IgA rispettivamente di 50 microgrammi/ml o 100 microgrammi/ml.

La soluzione appare limpida o leggermente opalescente, incolore o giallo pallido.

L’immunoglobulina umana normale contiene principalmente immunoglobulina G (IgG) con un ampio spettro di anticorpi contro agenti infettivi.

Infine il prodotto contiene maltosio come eccipiente e acqua per preparazioni iniettabili. Per lo studio sono stati selezionati otto lotti industriali non destinati all’immissione in commercio costituiti da soluzioni di immunoglobuline al 10% (10 g/100 ml o 100 mg/ml).

(3)

Caratteristiche generali della popolazione di pazienti

Nel corso dello studio sono stati selezionati i sieri di 19 pazienti che sono stati oggetto del test di neutralizzazione in vitro. Il titolo anticorpale di dieci pazienti nei confronti del virus polio 1, 2 e 3 era già stato precedentemente determinato; questi campioni sono stati utilizzati per la verifica della comparabilità di protocolli.

Dei dieci pazienti selezionati, 3 erano individui maschi in età pediatrica (età < 5 anni), 7 pazienti erano di sesso femminile, 4 in età pediatrica (età < 5 anni), 1 in età adolescenziale (età < 15 anni) e due soggetti adulti (età > 45 anni), di seguito i dettagli:

ID paziente Anno di nascita Sesso Reparto Test Ab polio 1 Ab polio 2 Ab polio 3 Titolo Ab Esito <1:8 negativo 1:16-‐1:32 medio basso 1:64-‐1:128 medio 1:256-‐>1:512 medio alto #1 2011 Maschio Onco-‐ematologia pediatrica

Ab polio 1 > 1:512 Medio-‐alto

Ab polio 2 1:256 Medio-‐alto

Ab polio 3 1:256 Medio-‐alto #2

2011 Maschio

Pediatria

Ab polio 1 1:32 Medio-‐basso

Ab polio 3 1:32 Medio-‐basso #3

1975 Femmina

Nefrologia Trapianti-‐Dialisi

Ab polio 1 < 1:8 Negativo

Ab polio 3 < 1:8 Negativo #4

2008 Femmina

Pediatria

1968 Femmina

Nefrologia Trapianti-‐Dialisi

(4)

#6 2011 Femmina

Pediatria

Ab polio 3 1:128 Medio #7

2015 Femmina

Pediatria

Ab polio 1 1:64 Medio

Ab polio 3 1:32 Medio-‐basso #8

2015 Maschio

Pediatria

2015 Femmina

Onco-‐ematologia pediatrica

Ab polio 3 > 1:512 Medio-‐alto #10

2001 Femmina

Centro Prelievi

Ab polio 3 1:64 Medio

Inoltre sono stati selezionati i sieri di nove pazienti in età adulta (6 uomini e 3 donne) dei quali era noto il titolo di IgG calcolato con il metodo ELISA che sono stati sottoposti al test di neutralizzazione in vitro per la determinazione degli anticorpi neutralizzanti contro il virus del morbillo al fine di verificare un eventuale correlazione tra i valori di IgG ed il titolo di anticorpi neutralizzanti.

(5)

Procedura operativa protocollo FDA-‐approved applicato a concentrati di immunoglobuline

A partire da colture cellulari di cellule Verocells vengono allestite micropiastre a 96 pozzetti, in cui sono seminati 100 microltri/pozzetto di sospensione cellulare alla concentrazione di 1 x 10^5 cellule/ml. Le piastre vengono poi incubate fino a quando la coltura cellulare non raggiunge una confluenza compresa tra il 70-‐95 %, tipicamente a seguito di un incubazione overnight a 36 ± 1°C e 5 ± 1% in CO2.

Il giorno successivo vengono eseguite diluizioni scalari del materiale oggetto del test su micropiastre a 96 pozzetti e poi si aggiunge in tutti i pozzetti una sospensione di virus alla concentrazione pari a 2 x 10^3 TCID50/ml. Per ciascuna piastra si allestisce almeno un

controllo negativo, costituito solo dal terreno di crescita per le cellule, ed un controllo positivo, rappresentato dalla sospensione di virus priva del materiale oggetto del test (siero o immunoglobuline).

La piastra contenente la sospensione materiale test/sospensione di virus viene mantenuta in incubazione per 1 h e 30 minuti alla temperatura di 36 ± 1°C e 5 ± 1% in CO2.

Tale periodo di incubazione permette agli eventuali anticorpi neutralizzanti di formare il complesso antigene-‐anticorpo neutralizzando appunto l’agente patogeno con effetto protettivo per le cellule Verocells.

Trascorso il periodo di incubazione la miscela materiale test/sospensione di virus viene aggiunta alle piastre contenenti il tappetto cellulare secondo tale schema:

(6)

dove per R176 e R177 e TM sono indicati rispettivamente tre tipologie di materiale sottoposto ad analisi; NC e PC indicano rispettivamente il controllo negativo e positivo. Ciascuna diluizione è testata in singolo.

Le piastre così trattate vengono incubate alla temperatura di 36 ± 1°C e 5 ± 1% in CO2 per sei

giorni, quando viene valutato l’eventuale presenza dell’effetto citopatico. Infine il titolo anticorpale protettivo viene determinato utilizzando la formula di Spearman-‐Karber

M = xk + d [0.5 – (1/n) (r)]

dove:

xk = dose della più alta diluzione

r = somma delle risposte negative “-‐“, inteso come assenza di effetto citopatico d = distanza tra le diluizioni

n = numero dei pozzetti per diluzione

(7)

Procedura operativa protocollo AOUP applicato a sieri di pazienti

Il saggio di neutralizzazione viene applicato a scopo diagnostico per la determinazione del titolo anticorpale di eventuali anticorpi neutralizzanti diretti contro differenti virus, quali HSV-‐1, HSV-‐2, Poliovirus 1, 2, 3 e Coxsackie A e B.

Il protocollo prevede almeno due fasi: preparazione e titolazione del virus e la reazione di neutralizzazione.

(8)

Preparazione delle cellule

L’allestimento di una coltura cellulare prevede lo scongelo di un’aliquota di cellule e la semina in fiasche per colture cellulari contenenti il terreno di crescita (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) contenente L-‐glutammina, penicillina, streptomicina e siero bovino fetale al 2% in un volume finale di 20 ml.

Le fiasche vengono incubate alla temperatura di 36 ± 1°C e 5 ± 1% in CO2 fino a quando la

coltura cellulare non raggiunge una confluenza compresa tra il 80 ed il 90%; successivamente la soluzione della fiasca viene rimossa ed il tappeto cellulare lavato almeno una volta con 5 ml di terreno di coltura ed il liquido nuovamente rimosso; si tratta poi il tappetto cellulare con una soluzione di tripsina 1X; il volume da aggiungere deve essere tale da garantire la formazione di un film di soluzione su tutta la superficie della fiasca. Le cellule così trattate vengono incubate per alcuni minuti alla temperatura di 36 ± 1°C e 5 ± 1% in CO2 fino a quando

l’intero tappetto cellulare non risulta più adeso al fondo della fiasca; si aggiunge poi alla fiasca un volume di 5 ml di terreno di coltura e si recupera l’intero contenuto contenente tutte le cellule.

Titolazione del virus

L’allestimento della produzione virale viene realizzata attraverso l’infezione con una dose massiccia di virus in fiasche per colture cellulari in cui erano state precedentemente seminate un substrato cellulare permissive e suscettibili al virus da titolare.

Le fiasche così trattate vengono monitorate al microscopio invertito fino alla completa manifestazione dell’effetto citopatico virus-‐specifico che denota una replicazione virale.

Successivamente l’intero contenuto cellulare viene raccolto e pellettato ed il sovranatante contenente le particelle virali viene aliquotato e congelato alla temperatura di < -‐70°C; il processo di recupero delle particelle virali può essere più efficace sottoponendo ad uno o più

(9)

step di congelamento/scongelamento l’intero contenuto della fiasca, in modo che lo step di congelo/scongelo determini la rottura di eventuali cellule rimaste integre con il conseguente rilascio di ulteriori particelle virali.

Prima di procedere con l’allestimento devono essere tenuti in considerazione almeno tre parametri utili: dose infettante, tempo di lettura dell’effetto citopatico e volume di soluzione virale, per ottenere ad esempio una dose infettante di 100 TCID50 in 75 microlitri a 5 giorni di

incubazione.

A partire dalla soluzione stock di virus preparare un adeguato numero di diluizioni in base 10 in terreno di crescita per colture cellulari, ad esempio da 10-‐1_{fino
a
10}-‐10_{.
Successivamente
un}

adeguato volume di ciascuna diluizione (ad esempio 75 microlitri) viene aggiunta ai pozzetti della micropiastra da 96 precedentemente riempiti con pari volume di terreno di coltura; a seconda dello schema di semina impostato, ciascuna diluizione può prevedere fino a 12 repliche. Si deve prevedere anche un controllo negativo che è costituito solo da cellule.

Successivamente si allestisce una soluzione contenente una concentrazione di 9000-‐10000 cellule/ml permissive e sensibili per la tipologia di virus da titolare in una miscela finale di 50% di terreno di coltura e 50% di siero fetale bovino. Tale soluzione viene adeguatamente omogeneizzata ed aggiunta ai pozzetti della micropiastra.

La piastra così preparata viene incubata alla temperatura di 36 ± 1°C e 5 ± 1% in CO2 fino al

tempo di lettura stabilito pari a cinque giorni di incubazione.

Allo scadere del tempo di incubazione si procede alla lettura della piastra e all’interpretazione del risultato: man a mano che le diluizioni della soluzione di virus è spinta verso diluzioni maggiori la dose infettante e la capacità di dare effetto citopatico diminuisce fino a risultare assente.

(10)

Si registrano quindi i risultati e si determina il titolo anticorpale utilizzando la seguente formula di Reed Muench:

DISTANZA PROPORZIONALE = (% delle cellule infette immediatamente sopra il 50% -‐ 50 %) / (% delle cellule infette immediatamente sopra il 50% -‐ % delle cellule infette immediatamente sotto il 50%).

Applicare tale indice alla diluzione immediatamente sopra il 50% (ad esempio se la distanza è 0,6 e la diluizione sopra il 50% è 10-‐7_{,
allora
la
TCID50
è
10}-‐7,6_{/volume
in
ml)}

Reazione di neutralizzazione

Il primo step della reazione di neutralizzazione prevede l’inattivazione del sistema del complemento presente nei sieri di pazienti attraverso il trattamento termico a 56°C in bagnomaria per almeno 30 minuti.

Successivamente i sieri dei pazienti vengono diluiti con il terreno di coltura 1/8 e seminati su micropiastre da 96 pozzetti eseguendo diluizioni scalari fino a 1/512 (4 diluizioni 1 a 4): ciascuna diluzione viene eseguita in doppio.

I sieri così preparati sono poi vengono mescolati ad una preparazione virale a concentrazione standard, pari a 100 TCID50.

La piastra contenente la sospensione materiale test/sospensione di virus viene mantenuta in incubazione per 1 h alla temperatura di 36 ± 1°C e 5 ± 1% in CO2.

Tale periodo di incubazione permette agli eventuali anticorpi neutralizzanti di formare il complesso antigene-‐anticorpo neutralizzando appunto l’agente patogeno con effetto protettivo per le cellule KB.

(11)

Trascorso tale periodo di incubazione viene aggiunta ai pozzetti della piastra una soluzione contenente una concentrazione di 9000-‐10000 cellule/ml in una miscela finale di 50% di terreno di coltura e 50% di siero fetale bovino. La piastra così preparata viene incubata alla temperatura di 36 ± 1°C e 5 ± 1% in CO2 fino al tempo di lettura stabilito pari a cinque giorni

di incubazione. Allo scadere del periodo di incubazione si determina il titolo anticorpale utilizzando la formula di Reed Muench.

Premessa -‐ strategia applicata per la verifica di comparabilità dei protocolli

L’analisi dei protocolli applicati a sieri di pazienti e concentrati di immunoglobuline ha fatto emergere le seguenti differenze, che sono state oggetto di indagine al fine di valutare la comparabilità degli stessi:

In linea generale la strategia di comparabilità si è basata sulla riproduzione presso il laboratorio dell’U.O. di Virologia di test sui sieri di pazienti applicando il protocollo FDA-‐

approved ed in parallelo sono state riprodotti risultati di neutralizzazione applicando invece il

protocollo AOUP su concentrati di immunoglobuline precedentemente testati con il protocollo FDA-‐approved.

In particolare il protocollo di studio è stato applicato in accordo a quanto indicato nelle linee guida ICH: Validation of Analitycal Procedures: Text and Methodology Q2(R1) e nel capitolo della USP 39 dedicato alla validazione dei test biologici (USP <1033>), secondo i quali sono stati verificati e confrontati parametri i seguenti parametri: accuratezza, specificità, precisione. Altre caratteristiche dei test come il detection limit ed il limite di quantizzazione non vengono inclusi poiché non sono solitamente rilevanti ai saggi biologici che riportano la potency come risultato, in questo specifico caso il titolo neutralizzante.

(12)

Accuratezza

Determinare l’accuratezza significa valutare quanto il metodo è capace di ottenere risultati prossimi al valore vero su campioni a contenuto di analita noto, fornendo una indicazione degli errori sistematici.

L’accuratezza del metodo si esprime come valore di recupero, cioè come rapporto percentuale fra il risultato ottenuto e il valore atteso dei campioni di analisi standard.

In linea generale ci sono almeno tre approcci che possono essere intrapresi per determinare l’accuratezza:

1. L’esecuzione dell’analisi su campioni a concentrazione nota o di una definita purezza. 2. Attraverso l’applicazione della procedura analitica con preparazioni fatte in

laboratorio nei quali sono presenti quantità precise di componenti da analizzare. 3. Il confronto tra i risultati ottenuti su uno stesso campione dal metodo in validazione

con un altro già validato.

Quest’ultimo punto rappresenta la strategia utilizzata per la verifica dell’accuratezza del test di neutralizzazione in vitro.

L’accuratezza deve essere espressa come percentuale di recupero dell’analita nella soluzione paragonando i risultati dei test contro valori noti. Si può calcolare l’accuratezza come errore relativo o recupero percentuale:

Recupero % = 100 x ( Potenza misurata / Potenza teorica )

con un range di accettazione del recupero tra 80-‐120 %.

Nel corso di questo studio sono stati valutati i valori di recupero percentuali considerando come titolo noto, ovvero il valore di potency del 100%, il titolo dei concentrati di immunoglobuline ed il titolo del siero noto.

(13)

Specificità

Determinare la specificità significa valutare la capacità del metodo analitico nel misurare specificamente l’analita in presenza di altri componenti, che possono essere presenti nella matrice del campione da analizzare come eccipienti e/o prodotto/i di degradazione e/o impurità ed eventualmente influenzare l’analisi stessa.

In altri termini, i test di specificità richiedono la dimostrazione della mancanza di interferenza delle componenti della matrice; il saggio può essere eseguito facendo diluizioni in parallelo con il materiale test con e senza le componenti. In breve, in questo lavoro è stata fatta una prova di specificità eseguendo il test di neutralizzazione in parallelo utilizzando un concentrato di immunoglobuline ed una soluzione priva del principio attivo, costituita di fatto da una soluzione di maltosio in acqua per preparazioni iniettabili verificando di fatto l’effetto matrice del campione. Nel caso in cui la risposta al test fosse stata simile il test è considerato specifico per il composto.

Precisione

La precisione o riproducibilità di un test esprime il grado di dispersione tra una serie di misure ottenute da una campionatura multipla dello stesso campione omogeneo sotto condizioni prescritte. La precisione fornisce un indicazione di errori casuali. Obiettivo della riproducibilità è quello di valutare la ripetibilità del metodo, ovvero il grado di precisione dei risultati analitici, quando la procedura analitica in esame è applicata in laboratori diversi su uno stesso campione omogeneo.

Poiché il test di neutralizzazione in vitro rientra tra le tecniche diagnostiche sierologiche per le quali è richiesto un elevato livello di expertise degli operatori, sia di tipo tecnico nelle preparazione delle piastre e nell’esecuzione del test, sia nel corso dell’interpretazione del

(14)

risultato, per questo tipo di studio si è ritenuto necessario valutare il livello di riproducibilità impostando come criterio di accettazione che una differenza non superiore ad una diluzione non è considerata significativa visto la variabilità del test.