3. MATERIALI E METODI
3.1 Campioni utilizzati
I campioni utilizzati in questo studio sono sieri di pazienti HCV positivi in fase cronica, infettati con il genotipo 1a e reperiti presso l’Unità Operativa Gastroenterologia diretta dal Prof. Marchi dell’Azienda Universitaria Ospedaliera Pisana (AUOP).
I sieri sono stati siglati con una numerazione da 1 a 10 e sono stati usati per l’allestimento di un test di neutralizzazione finalizzato a verificare la presenza di NAb anti-HCV. Per il saggio sono state prodotte particelle virali pseudotipizzate con le glicoproteine E1 ed E2 di HCV usando sia costrutti FIV-derivati che costrutti MLV-derivati utilizzati come controllo positivo.
3.2 Pseudovirus MLV-derivati esprimenti GFP
Per produrre particelle MLV pseudotipizzate con E1 E2 ed esprimenti GFP come gene reporter sono stati utilizzati i seguenti costrutti (gentilmente forniti dal Dr. François-Loïc Cosset; Laboratoire de Vectorologie Rètrovirale et Therapie Gènique, Ecole Normale Supèriere de Lyon): packaging denominato packMLV esprimente i geni gag e pol codificanti per le proteine strutturali ed enzimatiche di MLV, vettore chiamato MLVgfp che veicola GFP ed envelope detto pE1E2 codificante le glicoproteine E1 E2 di HCV (Bartosch et al., 2003). Gli pseudovirus così prodotti verranno chiamati MLVgfpE1E2 (FIG. 3.1).
In modo analogo sono state prodotte anche particelle pseudotipizzate con la proteina G del virus della stomatite vescicolare (VSV) (chiamate MLVgfpVSV) mediante l’utilizzo degli stessi costrutti packaging e vettore ma come costrutto envelope non più pE1E2 ma un altro plasmide codificante per questa proteina detto pVSV-G. Questi pseudovirus usano per entrare nelle cellule target un recettore
cellulare ubiquitario (un fosfolipide di membrana) e quindi grazie all’elevato tropismo d’ospite vengono utilizzati come controlli positivi nei saggi di trasduzione.
(Immagine tratta da: Bartosch et al., 2003, modificata)
FIG. 3.1: Rappresentazione dei costrutti utilizzati per formare pseudovirus
MLV-derivati: packaging (A), vettore (B) ed envelope (C).
3.3 Pseudovirus FIV-derivati esprimenti GFP
Per produrre particelle FIV pseudotipizzate con E1 E2 ed esprimenti GFP come gene reporter sono stati utilizzati dei costrutti FIV-derivati già sviluppati nel nostro laboratorio. I costrutti si basano analogamente ai precedenti su un sistema split-component nel quale vengono usati tre costrutti: packaging denominato pΔenv (derivante dal p34TF10, un clone molecolare di FIV contenente l’intero genoma dell’isolato Petaluma), vettore indicato con la sigla vΔenvGFP veicolante GFP come gene reporter ed alternativamente due costrutti envelope. Il primo chiamato pE1E2 contenente le sequenze codificanti per E1 ed E2, il secondo chiamato pVSV-G codificante la proteina G (FIG. 3.2).
Le particelle virali FIV-derivate pseudotipizzate con E1 E2 sono state denominate FIVgfpE1E2 mentre quelle pseudotipizzate con la proteina G, FIVgfpVSV.
E1E2 oppure VSV E1E2 oppure VSV--GG GFP GFP Gag
Gag PolPol
A.
C.
B.
E1E2 oppure VSV E1E2 oppure VSV--GG GFP GFP GagGag PolPol
A.
C.
A.
B.
C.
FIG. 3.2: Rappresentazione dei costrutti utilizzati per formare pseudovirus
FIV-derivati esprimenti GFP: packaging pΔenvGFP (A), vettore vΔenvGFP (B) ed i due costrutti envelope (C), pE1E2 a sinistra e pVSV-G a destra.
3.4 Pseudovirus FIV-derivati esprimenti luciferasi
Per la produzione di particelle virali FIV-derivate esprimenti luciferasi (luc), oltre ad utilizzare il costrutto packaging e i due costrutti envelope mostrati in FIG.
3.2 (A e C) è stato necessario produrre un costrutto vettore avente le sequenze
codificanti luc. Le particelle virali esprimenti luc pseudotipizzate con E1 E2 vengono denominate FIVlucE1E2 mentre quelle pseudotipizzate con la proteina G vengono denominate FIVlucVSV.
3.4.1 Produzione del costrutto vettore esprimente luc
AMPLIFICAZIONE GENE REPORTERLa sequenza genica codificante per la luciferasi è stata amplificata a partire dal plasmide commerciale pGL3 (Promega, Milano, Italia) mediante PCR. Questa ha
previsto l’utilizzo di primer senso (NruI S : 5’
TCCTCGCGAATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGC 3’) e antisenso (SacII AS: 5’ rev gag pol vif ORF A Δenv Δ Δψψ CMV RRE polyABGH CMV VSV-G gag CMV R U5 CMV GFP U3 R U5 rev vif ORF A Δenv RRE ψ ψ E1 (Genotipo 1a) (Genotipo 1a) CMV E2 rev gag pol vif ORF A Δenv Δ Δψψ CMV
CMV RRE polyApolyABGHBGH
CMV VSV-GVSV-G gag CMV CMV RR U5U5 CMVCMV GFPGFP U3U3 RR U5U5 rev vif ORF A Δenv RRE ψ ψ E1 (Genotipo 1a) (Genotipo 1a) CMV E2
TCCCCGCGGTTACACGGCGATCTTTCCGCCCTTC 3’) che presentano una coda aggiuntiva al 5’ contenente un sito di taglio per uno specifico enzima di restrizione, NruI o SacII.
Per la PCR 1μg di campione è stato aggiunto alla miscela di reazione costituita da: tampone di reazione 10X (Tris-HCl 10mM, pH 0,9; KCl 50mM; Triton X-100 0,1%) MgCl2 1,5mM, primer S e AS 0,4μM, dNTP’s 20 μM, 1U di Taq DNA polimerasi (Polymed, Firenze, Italia). La miscela viene portata ad un volume di 50ul con H2O.
La reazione di PCR prevede varie fasi:
1 ciclo 94°C per 30’’ (fase di denaturazione iniziale) 94°C per 30’’ (fase di denaturazione)
25 cicli 58°C per 30’’ (fase di annealing) 72°C per 1’50’’ (fase di estensione) 1 ciclo 72°C per 5’ (fase di estensione finale)
Per verificare eventuali contaminazioni è stato effettuato anche un controllo negativo in cui al posto del campione viene utilizzata H2O.
Il prodotto di amplificazione di 1600 bp è stato in seguito controllato su gel d’agarosio all’1% mediante corsa elettroforetica.
DIGESTIONE ENZIMATICA
L’amplificato ottenuto è stato quindi purificato con il NucleoSpin kit (MACHEREY-NAGEL, Dϋren, Germania) secondo le indicazioni fornite dal protocollo.
L’amplificato e il costrutto vettore vΔenvGFP (vedi FIG. 3.2) sono stati digeriti con gli enzimi di restrizione NruI e SacII (Fermentas, Milano, Italia). Per valutare l’efficienza della digestione, per ogni campione è stato incluso un controllo negativo costituito da tutti i componenti della reazione escluso l’enzima.
La reazione di digestione è stata effettuata per 1h e 30 minuti a 37°C e disattivata a 65°C per 10 minuti.
I prodotti della digestione sono stati poi controllati mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1%.
LIGATION
L’inserto è stato purificato mediante estrazione da banda con NucleoSpin kit (MACHEREY-NAGEL), mentre il vettore è stato purificato mediante precipitazione con sodio acetato ed etanolo. In breve, il plasmide è stato addizionato di acetato di sodio 3M a pH=5.5 ed etanolo assoluto, raffreddato a -20°C, nelle proporzioni rispettivamente di 0.1 e 3 volumi per 1 volume di plasmide.
Dopo l’incubazione a -20°C overnight oppure a -80°C per 3h, il DNA precipitato è stato centrifugato a 12000 rpm per 30’ a 4°C. Dopo aver eliminato il sovranatante, è stato effettuato un lavaggio con etanolo al 70% e successiva centrifugazione a 12000 rpm per 10’ a 4°C. Infine, il pellet formatosi è stato risospeso in 25μl di acqua sterile.
Le quantificazioni dell’inserto e del vettore sono state effettuate mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1%.
Prima di clonare l’inserto nel vettore, questo è stato defosforilato con 1 unità di Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) (Promega) per μg di DNA in Buffer SAP 1X (Promega). La reazione è mantenuta per 30 minuti a 37°C e disattivata a 65°C per 15 minuti.
A questo punto, plasmide ed inserto così preparati sono stati ligati usando l’enzima T4 DNA ligasi (Fermentas) partendo da 100-200ng di plasmide e utilizzando una quantità di inserto che può variare da un rapporto di 1:5 a uno di 1:30. Il tutto è stato incubato a 16°C overnight e successivamente per 10’ a 65°C per disattivare l’enzima.
TRASFORMAZIONE
Il prodotto della ligation è stato usato per trasformare cellule competenti di E. Coli del ceppo JM109. La trasformazione è stata eseguita aggiungendo 50ng di DNA alle cellule batteriche incubando la miscela in ghiaccio per 15 minuti. Dopodiché le cellule sono state sottoposte a shock termico mantenendole per 50’’ a 42°C per favorire l’entrata del DNA e trasferite velocemente in ghiaccio per 2 minuti.
Le cellule batteriche così trasformate sono state messe a crescere in 1ml di terreno SOC (2% Triptone, 0,5 estratto di lievito, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10mM, MgSO4 10 mM e glucosio 20 mM) e poste in agitazione per 1h a 37°C.
Infine esse sono state piastrate su piastre Petri contenenti il terreno LB Agar (1% Triptone, 0,5% estratto di lievito, 1% NaCl a pH 7,0, 1,5% agar batteriologico) addizionato di ampicillina (50μg/ml) per permettere la crescita soltanto delle cellule trasformate. Successivamente le piastre sono state incubate overnight a 37 °C.
SCREENING DA COLONIE
Per verificare l’avvenuta inserzione del frammento di interesse nel vettore, le colonie ottenute sono state sottoposte a screening mediante PCR usando come primer NruI S e SacII AS .
La miscela di reazione per la PCR è stata preparata come descritto precedentemente aumentando solo il tempo della prima denaturazione (10’ anziché 2’) per ottenere la lisi cellulare ed il rilascio del plasmide. Lo screening è stato controllato su gel di agarosio all’1% e solo gli amplificati di lunghezza compatibile con quella dell’inserto sono considerati buoni.
ESTRAZIONE DNA PLASMIDICO
Le colonie risultate positive per amplificazione sono state incubate in 50ml di terreno liquido LB (1% Triptone, 0,5% estratto di lievito, 1% NaCl a pH 7.0) più ampicillina e lasciate crescere in agitazione a 37°C overnight. La crescita è stata in seguito centrifugata a 3000 rpm per 30’ a 4°C e dal pellet batterico è stato estratto il DNA plasmidico seguendo il protocollo Plasmid Midi Kit (QIAGEN, Milano, Italia).
Il DNA estratto è stato in seguito quantificato mediante lettura spettrofotometrica alla lunghezza d’onda di 260 nm ed un’aliquota è stata corsa su gel di agarosio all’1% per verificare l’integrità.
3.5 Linee cellulari utilizzate nello studio
La linea cellulare 293T, fibroblasti renali embrionali umani trasformati con l’antigene T del simian virus 40 (SV40), è stata mantenuta in terreno DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Sigma, St. Louis, USA) addizionato di siero bovino fetale (FBS) (Sigma) al 10% inattivato a 56°C per 35’, di L-glutammina 2mM
(Sigma), penicillina 1000U/ml (Sigma), 100μg/ml di streptomicina (Sigma), 1% di aminoacidi non essenziali (Sigma).
Le linee cellulari di epatocarcinoma umano HepG2 ed Huh-7 (quest’ultima ingegnerizzata per esprimere il CD81) sono state mantenute in coltura con DMEM completo addizionato con 1% di D-Glucosio (Sigma).
Raggiunta la confluenza, per permettere un’ulteriore espansione cellulare, le cellule sono state lavate con PBS 1X (PBS 10X: 80 g di NaCl, 2g di KCl, 14 g di Na2HPO4, 2,4 g di KH2PO4, HCL a pH 7,4), tripsinizzate (Tripsina/EDTA, Sigma) e messe di nuovo in coltura in terreno fresco in diluizioni opportune nelle fiasche a 37°C in atmosfera umidificata con il 5% di CO2 .
3.6 Trasfezione con il metodo Calcio Fosfato
Mediante la co-trasfezione dei tre costrutti, packaging, vettore ed envelope, sono stati prodotti vettori MLV-derivati o FIV-derivati pseudotipizzati con le glicoproteine E1 E2 di HCV oppure con la proteina G di VSV; inoltre i vettori FIV-derivati possono alternativamente esprimere GFP o luc.
Ventiquattro ore prima della trasfezione sono state seminate 2.5X106 cellule 293T in piastre Petri per colture cellulari da 100mm contenenti 10ml di terreno.
Per la trasfezione sono stati utilizzati 20µg totali di DNA distribuiti in un rapporto di 10:8:2 tra i tre costrutti (rispettivamente packaging, vettore ed envelope). Al DNA sono stati aggiunti 50µl di Cloruro di Calcio (CaCl2 250mM) e TE (Tris 1mM, EDTA 0,1mM) a pH 8.0 fino al raggiungimento di 500µl totali. Il tutto è stato trasferito in una falcon contenente 500µl di HEPES (280mM NaCl, 10mM KCl, 1.5mM Na2HPO4, 12mM destrosio, 50mM Hepes). E’ stato inoltre preparato un controllo negativo contenente i reagenti per la trasfezione ma privo di DNA. Dopo aver miscelato, le soluzioni sono state fatte riposare per 20-30 minuti a temperatura ambiente e poi aggiunte goccia a goccia sulle cellule da trasfettare in maniera omogenea. Dopo circa sei ore il terreno è stato sostituito con del terreno fresco.
A due giorni dalla trasfezione il surnatante delle cellule trasfettate contenente lo pseudovirus è stato prelevato, chiarificato a 1800 rpm per 10 minuti e
purificato mediante filtrazione con membrane da 0,45μm. Successivamente lo pseudovirus è stato concentrato mediante ultracentrifugazione a 25000 rpm per 2 ore (optima L-90k ultracentrifuge, Beckman Coulter, Milano, Italia); il pellet viene risospeso in un centesimo del volume iniziale, aliquotato e conservato a -80°C.
3.7 Lettura al citofluorimetro
Quando la trasfezione è stata allestita con un costrutto vettore esprimente GFP, la percentuale di cellule trasfettate è stata valutata mediante lettura citofluorimetrica. Le 293T trasfettate sono state lavate con PBS, staccate con tripsina e centrifugate a 1200 rpm per 5 minuti. Il pellet cellulare è stato poi lavato con FACS buffer (2g BSA 0.2%, 1g Sodio azide 0.1%, PBS), centrifugato nuovamente, risospeso e fissato con FACS FIX (50ml FACS buffer, 500mg paraformaldeide 1%). L’analisi al FACScan (Becton-Dickinson, Milano, Italia) è stata eseguita sfruttando la metodica della citofluorimetria a flusso. La percentuale di cellule trasfettate è stata valutata come percentuale di cellule GFP positive.
3.8 Lettura al luminometro
Quando la trasfezione è stata effettuata con il costrutto vettore esprimente luc, l’efficienza del saggio è stata valutata mediante lettura al luminometro. Alle piastre contenenti le 293T, una volta rimosso il terreno di coltura sono stati aggiunti 200μl di soluzione Britelite Plus (Luminescence Reporter Gene Assay System, Perkin Elmer, Waltham, USA) ed incubate per 2 minuti (step necessario per la lisi cellulare e per fornire il substrato della luciferasi) a temperatura ambiente. Il campione è stato quindi trasferito in una specifica piastra per la lettura al luminometro (Microbeta Trilux, Perkin Elmer) che viene effettuata grazie al software Microbeta Windows Workstation. In questo caso l’efficienza di trasfezione viene valutata come espressione di luciferasi (RLU).
3.9 Western blotting
Per valutare la capacità delle cellule trasfettate di esprimere correttamente le glicoproteine E1-E2 di HCV è stato effettuato un Western blotting. Con questo scopo le cellule trasfettate sono state lavate, staccate e centrifugate a 1200 rpm per circa 5 minuti. Il pellet è stato risospeso in 100µl di lysis buffer (Tris 10mM, EDTA 2mM, NaCl 0,15mM, Nonidet 0,5%) e addizionato di 100µl di sample buffer 2X (Tris-HCl 0.5M pH 6.8, glicerolo 10%, SDS 10%, β-mercaptoetanolo, blu di bromofenolo 0.05%). I campioni sono stati quindi bolliti per 5 minuti e caricati sul gel avente una porzione superiore denominata stacking gel ed una porzione inferiore chiamata runnnig gel.
Lo stacking gel contiene 10% di mix acrilammide/bisacrilammide (Acrilamide/Bis Solution, 29:1 Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA); per preparare 10ml di gel sono stati utilizzati, oltre all’acrilammide, 2,5ml Tris-HCl 0,5mM pH 6.8, 0,1ml di SDS al 10%, 0,1ml di APS al 10%, 4μl di TEMED (Sigma). Il running gel contiene invece, oltre al 30% di mix acrilammide/bisacrilammide (Bio-Rad Laboratories), 0,67ml di Tris-HCl 0.5mM pH 8.8, 40μl di SDS al 10%, 40μl di APS al 10%, 4μl di TEMED. La corsa elettroforetica è stata effettuata in running buffer 1X (Tris base 25mM, 0,1% SDS, 1,44% glicina, pH 9) per circa 1 ora e 30 minuti applicando una differenza di potenziale di circa 90V. Le varie proteine, non marcabili su gel, sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa (Whatman, Dassel, Germania).
Per il trasferimento il gel e la membrana sono stati racchiusi da fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento (0,3% Tris base, 1,44% glicina, 20% metanolo) e mantenuti a 4ºC per 1h e 30 minuti ad un voltaggio di 100V. Successivamente la membrana è stata incubata overnight con PBS Tween-skim milk al 3% e dopo una serie di lavaggi con PBS-Tween è stato aggiunto l’anticorpo monoclonale anti HCV AP33 che riconosce un epitopo lineare altamente conservato tra i diversi genotipi di HCV, diluito 1:500 (gentilmente concesso dal Dr Arvind Patel; Institute of Virology, University of Glasgow) in skim milk al 1% e incubato per 1 ora a temperatura ambiente.
Dopo ulteriori lavaggi con PBS-Tween è stato aggiunto l’anticorpo secondario antimouse coniugato a perossidasi diluito 1:1000 in skim milk al 0,5% ed incubato per circa 1 ora a temperatura ambiente. Per la rivelazione viene utilizzato un substrato contenente diaminobenzidina (DAB) 40mg/ml, Tris-HCl 100mM pH 7.5, perossido di idrogeno, NiCl2 80mg/ml.
3.10 Trasduzione
Per verificare la capacità infettante degli pseudovirus prodotti viene allestito un saggio di trasduzione. Il giorno precedente il test sono state contate e seminate in piastre da 48 pozzetti, 8x104/w Huh-7 o HepG2 e 1x104/w 293T in 500μl di terreno. Il giorno successivo 150μl di pseudovirus sono stati aggiunti alle cellule ed incubati per 6 ore, al termine delle quali il mezzo di coltura è stato sostituito con terreno fresco. A 48 ore, l’avvenuta trasduzione è stata rilevata mediante lettura al FACS o luminometro come descritto precedentemente (§ 3.4, 3.5) e quindi l’efficienza del test è stata valutata come percentuale di cellule GFP positive o espressione di luciferasi.
3.11 Suscettibilità dello pseudovirus all’azione
anticorpale
Per verificare la corretta conformazione ed esposizione delle glicoproteine E1-E2 sulla superficie dei virioni prodotti è stata valutata la suscettibilità degli pseudovirus eprimenti GFP all’attività neutralizzante dell’Ab monoclonale AP33.
In breve, diverse dosi di Ab (5, 1 e 0.5 μg/ml) sono state aggiunte a 150μl di pseudovirus. La miscela è stata incubata a 37°C per 1 ora per permettere all’AP33 di legarsi alle glicoproteine virali E1E2 e poi aggiunte a cellule suscettibili all’infezione.
L’infettività residua dello pseudovirus viene verificata dopo 72 ore mediante lettura al citofluorimetro.
3.12 Titolazione
Prima di allestire il test di neutralizzazione è stato necessario effettuare una titolazione del virus.
Il giorno precedente la titolazione, 8x104/w cellule Huh-7 sono state seminate in 500μl di terreno di coltura.
Lo pseudovirus precedentemente concentrato mediante ultracentrifugazione è stato utilizzato in diluizioni scalari (da 10 a 10-5) che sono state testate in quadruplicato per trasdurre le cellule. Dopo 48 ore la percentuale di trasduzione è stata rilevata mediante lettura al FACS ed è stata effettuata una media dei valori ottenuti alla stessa diluizione. Per il calcolo delle unità trasducenti (TU) è stata considerata la diluizione più bassa nella quale è stata osservata una percentuale di trasduzione. Questo valore moltiplicato per il fattore di diluizione indica le TU/ml.
3.13 Test di neutralizzazione
L’allestimento di un saggio di neutralizzazione per HCV consta di varie fasi. Nel primo step quantità fisse di pseudovirus sono state incubate con diluizioni scalari (1:10, 1:50 e 1:100) del siero da testare (vedi § 3.1) per 1h a 37°C per permettere il legame degli NAb alle glicoproteine E1-E2. In particolare i campioni di siero sono stati precedentemente scomplemetati a 56°C per 40’. Le miscele sono state poste a contatto con cellule Huh-7 (seminate il giorno precedente circa 8x104/w in piastre da 48) ed incubate per 4 ore 37°C. Dopo aver effettuato un lavaggio e stato aggiunto terreno fresco e le cellule sono state incubate a 37°C per altre 72 ore.
Nel saggio sono stati utilizzati vari controlli:
- le sole cellule (Kc) per determinare un eventuale background di fluorescenza
- cellule incubate con il virus e siero HCV-negativo per valutare eventuali inibizioni aspecifiche (Ks)
- cellule incubate con il virus e AP33 per testare l’efficienza della neutralizzazione
Campioni e controlli sono testati in triplicato per minimizzare variazioni inter-saggio. A 72 ore dalla trasduzione le cellule sono analizzate al citofluorimetro per contare il numero di cellule trasdotte, riconoscibili perché GFP-positive.
A questo punto viene calcolata la diminuzione del numero di cellule fluorescenti pre-incubate con i campioni di siero (test well) rispetto ai controlli (Kc e Kv). La capacità neutralizzante del campione viene espressa come percentuale di riduzione dell’entry. Il 50% di riduzione di infettività viene considerato come cut-off per attività neutralizzante.
test well – Kc Kv – Kc
% neutralizzazione = 1 –
