I
Sommario
Abbreviazioni ... 1 Riassunto ... 2 Abstract ... 4 Prefazione ... 6 1. Introduzione ... 81.1 Le specie attivate dell’ossigeno e lo stress ossidativo ... 8
1.2 Difese antiossidanti contro le specie reattive dell’ossigeno... 15
1.2.1 Meccanismi di difesa enzimatici... 15
1.2.2 Difese antiossidanti non enzimatiche... 17
1.3 Il glutatione ... 20
1.3.1 Azione pro-ossidante della gamma-glutamiltranspeptidasi ... 25
1.4 Lo stress ossidativo in coltura ... 29
1.5 Il sangue del cordone ombelicale... 31
1.5.1 La raccolta... 31
1.5.2 Le cellule del sangue di cordone ombelicale ... 34
1.5.3 Caratteristiche delle cellule staminali di sangue cordonale: le cellule mesenchimali ... 35
1.6 La citofluorimetria ... 42
1.6.1 Generalità ... 42
1.6.2 Funzionamento del citofluorimetro... 42
1.6.3 Emissione di segnali generati da composti fluorescenti ... 46
1.7 La marcatura fluorescente del glutatione ... 50
2. Scopodella tesi ... 54
3. Materiali e metodi ... 55
3.1 Linea cellulare Jurkat ... 55
3.2 Preparazioni linfomonocitarie... 56
3.3 Determinazione del glutatione intracellulare con CMFDA ... 57
3.4 Studi di deplezione del GSH intracellulare con dietilmaleato ... 59
II
3.6 Colture cellulari... 64
3.7 Studi morfologici ... 65
3.7.1 Procedura per la colorazione dei preparati fissati su vetrino ... 65
3.8 Analisi HPLC dei tioli intracellulari ed extracellulari ... 67
3.8.1 Estrazione dei tioli liberi del medium ... 67
3.8.2 Estrazione dei tioli liberi intracellulari... 67
3.8.3 Preparazione degli standard, dei campioni e loro derivatizzazione... 68
3.8.4 Lettura dei campioni ... 69
3.9 Determinazione della concentrazione proteica ... 71
4. Risultati ... 73
4.1 Determinazione del GSH intracellulare con CMFDA ... 73
4.2 Saggi di deplezione del GSH intracellulare con dietilmaleato... 76
4.3 Confronto tra diversi metodi di deplezione del GSH intracellulare... 78
4.4 Immunofenotipizzazione delle cellule sottoposte a determinazione del GSH intracellulare con CMFDA... 80
4.5 Colorazione citochimica per l’enzima gamma-glutamiltranspeptidasi su strisci di sangue di cordone ombelicale e di midollo ... 81
4.6 Coltivazione di cellule staminali mesenchimali... 81
4.7 Analisi citochimica per la GGT nelle colture di sangue cordonale ... 82
4.8 Determinazione dei livelli dei tioli intra ed extracellulari sulle colture di sangue cordonale in presenza di alte tensioni di ossigeno ed in condizioni di ipossia relativa... 83
Figure e tabelle: Figura 1: contenuto di GSH nei campioni di sangue intero neonatale e materno dopo incubazione con CMFDA ... 85
Figura 2a: tracciato citofluorimetrico di campione di sangue intero materno all’inizio e dopo 120 minuti dall’incubazione con CMFDA ... 86
Figura 2b: tracciato citofluorimetrico di campione di sangue intero fetale al termine dell’incubazione con CMFDA e dopo 120 minuti... 87
III Figura 3a: tracciato citofluorimetrico di preparazione linfomonocitaria di
sangue materno al termine dell’incubazione con CMFDA e dopo 120 minuti dalla fine del trattamento ... 88 Figura 3b: tracciato citofluorimetrico di preparazione linfomonocitaria di
sangue fetale al termine del trattamento con CMFDA e dopo 120 minuti ... 89 Figura 4a : tracciato citofluorimetrico di linfomonociti di sangue fetale
trattati o non trattati con DEM e successivamente incubati con CMFDA... 92 Figura 4b: tracciato citofluorimetrico di linfomonociti di sangue fetale
dopo 120 minuti dalla fine del trattamento con DEM e CMFDA ... 93 Figura 5a: tracciato citofluorimetrico di linfomonociti di sangue di
adulto dopo deplezione con DEM e trattamento con CMFDA... 94 Figura 5b: tracciato citofluorimetrico di linfomonociti di sangue di
adulto dopo 120 minuti dalla fine del trattamento con la CMFDA ... 95 Figura 6: effetto della deplezione con DEM sulla determinazione del
GSH intracellulare con CMFDA in cellule Jurkat ... 96 Figura 7a: effetto della deplezione mediante coltura in terreno
RPMI-SAF sulla determinazione del GSH intracellulare con CMFDA in cellule Jurkat ... 97 Figura 7b: fluorescenza intracellulare e del sovranatante delle cellule
Jurkat dopo trattamento con CMFDA... 98 Figura 8: immunofenotipizzazione di linfomonociti di sangue cordonale
dopo marcatura con CMFDA... 99 Figura 9: striscio di sangue di cordone ombelicale... 100 Figura 10: striscio di sangue di cordone ombelicale... 100 Figura 11: dimostrazione citochimica dell’attività di GGT su striscio di
sangue di cordone ombelicale ... 101 Figura 12: dimostrazione citochimica dell’attività di GGT su striscio di
IV Figura 13:determinazione citochimica dell’attività di GGT su striscio di
sangue di cordone ombelicale ... 102
Figura 14: dimostrazione citochimica dell’attività di GGT su striscio di sangue midollare ... 102
Figura 15: colture da cellule di buffy-coat di cordone ombelicale, 2 settimane di coltura ... 103
Figura 16: colture da cellule di buffy-coat di cordone ombelicale, 1 settimana di coltura ... 103
Figura 17: colture da cellule di buffy-coat di cordone ombelicale, 8 settimane di coltura ... 104
Figura 18: dimostrazione citochimica dell’attività di GGT in cellule coltivate da sangue di cordone ombelicale ... 105
Figura 19: dimostrazione citochimica dell’attività di GGT in cellule coltivate da sangue di cordone ombelicale... 106
Tabella 1: Contenuto di tioli intra ed extracellulari in colture di buffy-coat cordonale mantenute in alte tensioni di ossigeno ed in condizioni di ipossia relativa... 107
Grafico 1: livelli di GSH intracellulare totale in preparazioni linfo-monocitarie di sangue di adulto e di sangue fetale dopo trattamento con DEM e successiva incubazione con CMFDA... 90
Grafico 2: livelli di GSH intracellulare in preparazioni linfomonocitarie di sangue materno e fetale durante e dopo l’incubazione con CMFDA ... 91
5. Discussione e conclusioni ... 108
6. Letteratura citata... 115
