Metaboliti primari e secondari Enzimi Prodotti complessi Prodotti di biotrasformazione Biotecnologie Biomasse microbiche

Biomasse microbiche

Metaboliti primari e

secondari

Enzimi

Prodotti complessi

Prodotti di

biotrasformazione

Sfruttando il metabolismo e le diversificate capacita’ biosintetiche dei microrganismi appartenenti ai diversi gruppi microbici, si puo’

ottenere un’ampia gamma di prodotti

Biotecnologie

Le biomasse possono essere utilizzate integralmente per l’alimentazione umana o animale o dopo estrazione come fonte di diverse macromolecole quali enzimi, lipidi, RNA. Le biomasse possono essere utilizzate in

forma vitale per la loro attivita’ su substrati complessi o ambienti particolari.

1) Biomasse

microbiche

Contenuto

Attivita’

Applicazione delle biomasse microbiche

Per il contenuto:

come fonte

proteica non

convenzionale e

per l

’

estrazione di

metaboliti

particolari.

Per l

’

attivita

’

:

su

substrati

complessi e su

molecole

particolari.

Accumuli metabolici di interesse industriale

I prodotti del metabolismo

aerobio

Costituenti cellulari: acidi organici, amminoacidi,

nucleotidi, vitamine, enzimi, peptidi, lipidi etc.

Metaboliti (secondari): antibiotici, alcaloidi, polisaccaridi, enzimi extracellulari. I prodotti del metabolismo anaerobio

Acido lattico, butirrico,

propionico. Essendo il prodotto finale del metabolismo

primario, sono

spontaneamente accumulati anche a livelli significativi!

Le differenze metaboliche tra microrganismi aerobi e anaerobi sono alla base delle strategie per l’ottenimento di elevati livelli

di metaboliti microbici.

Nel metabolismo anaerobio, lo sviluppo microbico e’

generalmente limitato, si ottiene la generazione di bassi livelli di energia ed un cospicuo

accumulo di metaboliti finali.

Nel metabolismo aerobio, i livelli di energia prodotti sono molto piu’

elevati rispetto al metabolismo anaerobio e solitamente non c’e un

significativo accumulo di intermedi metabolici.

1) Biomasse da batteri:

- Crescita a pH compreso tra 5 e 7 (possibilita’ di

contaminazione!).

-  Velocita’ di crescita elevata.

- Alto contenuto di proteine ed acidi nucleici.

- Eventuali problemi di separazione.

2) Biomasse da lieviti:

- Velocita’ di crescita inferiore rispetto ai batteri.

-  Crescita a pH compreso tra 3.5 e 5 (ridotta

possibilita’ di contaminazione).

-  Medio contenuto di proteine e acidi nucleici.

2) Biomasse da muffe:

- Velocita’ di crescita inferiore rispetto ai batteri e ai lieviti.

-  Crescita a pH compreso tra 3 e 8.

-  Buon contenuto di proteine e acidi nucleici.

- Eventuali problemi per la produzione di micotossine.

Terreno sintetico costituito da CO₂, sali minerali, acqua e luce.

Tempo di duplicazione: 24 h.

Resa di fermentazione: 1-2 g/L.

Produzione annua: 50-500 t/anno.

Il processo puo’ essere anche condotto in acqua di mare per la produzione di biomasse destinate all’acqua-coltura (pesci). Richiede in questo caso solo CO₂.

Lievito per panificazione

S.cerevisiae e’ dotato di doppio metabolismo ossidativo e

fermentativo. Produzione di biomassa durante il metabolismo ossidativo, produzione di etanolo e CO₂ nella fase fermentativa. Il processo di produzione e’ del tipo multistadio in cui i primi stadi sono in condizione di semianaerobiosi e gli ultimi stadi sono in totale aerobiosi.

Coltura di laboratorio in agar malto Coltura in liquido Fermentatore 100 L Prestadi successivi Stadio finale 250-450 m3_{, melasso in feed} Y=0.5 Sosta 2h (maturazione cellule) Separazione per centrifugazione. Lavaggio cellule. Crema (17-18% s.s.) Confezionamento Filtrazione sottovuoto in presenza di NaCl (0.5%). Lievito compresso.

Colture insetticide da Bacillus

L’impiego indiscriminato di pesticidi nel settore agrario, oltre a presentare rischi non piu’ sottovalutabili per la salute umana, puo’ modificare in misura significativa i gia’ precari equilibri a livello ambientale. Nell’ambito delle colture insetticide, le tossine ottenibili da Bacillus sono state oggetto di studi approfonditi e nello specifico l’impiego di Bacillus thuringensis e’ largamente diffuso.

Terreno colturale di costo moderato, contenente corn-steep, amido o glucosio, idrolizzato di caseina. I principali prodotti commerciali contengono sia la δ-endotossina, sia

le spore. Le preparazioni sono distribuite in forma di spray, per irrigazione, per dispersione sul terreno.

La δ-endotossina non e’ tossica per l’uomo e per gli animali poiche’ viene degradata dal pH dello stomaco.

Nell’ambiente basico dell’intestino delle larve la tossina viene attivata provocando la distruzione delle cellule

L i m i t a z i o n i n e l l

’

_{u s o d e l l e b i o m a s s e}

microbiche:

- Il substrato rappresenta fino al 50-60 % dei costi totali.

- Il contenuto in acidi nucleici puo’ essere molto variabile e creare problemi nel metabolismo sia dell’uomo che degli animali.

- Presenza di sostanze tossiche che residuano dal substrato. - Limitata digeribilita’.

2) Metaboliti

secondari

primari

Sono essenziali per la vita e la riproduzione della

cellula: acidi organici, aminoacidi e loro intermedi, carboidrati, vitamine, nucleotidi, lipidi,

proteine etc.

Non sono essenziali per lo sviluppo e la riproduzione della

cellula (spesso prodotti di biosintesi a partire dai

metaboliti primari). Molecole ad attivita’ antimicrobica,

immunomodulanti, antitumorali, inibitori dell’attivita’ proteasica

3) Enzimi:

Enzimi extracellulari. Bacillus (amilasi, proteasi)

Enzimi intracellulari. E.coli (penicillina acilasi)

4) Prodotti complessi:

Prodotti non isolabili, generalmente (non sempre) costituiti dall’insieme d e l s u b s t r a t o t r a s f o r m a t o , contenente gli stessi microrganismi

responsabili della modificazione yogurt

birra

5) Prodotti ottenibili per biotrasformazione:

I microorganismi vengono impiegati come biocatalizzatori in reazioni di modificazione di molecole in posizione e con stereoselettivita’ specifiche.

Prodotti ad alto valore aggiunto quali steroidi, antibiotici,

Su quali settori produttivi si concentra oggi l’ingegneria metabolica? -  biomateriali -  solventi -  polisaccaridi -  proteine -  antibiotici -  alimentari -  biogas - alcoli - acidi organici - vitamine - aminoacidi - cellulasi batteriche - lipidi - pigmenti

L

’

ingegneria metabolica riveste un ruolo

fondamentale nelle bioconversioni!

Precursore

Intermedio 1

Intermedio 2

Composto finale

E1 E2 E3

Le biosintesi si stanno rivelando delle ottime alternative alle sintesi chimiche soprattutto in campo farmaceutico. Spesso e’ necessario utilizzare piu’ enzimi per catalizzare gli step necessari alla sintesi del composto finale.

La problematica generale per l’accumulo di metaboliti di

interesse industriale risiede nel fatto che la cellula

normalmente dispone di meccanismi di regolazione molto efficienti atti ad impedire l’accumulo di intermedi metabolici in

eccesso rispetto alle normali esigenze cellulari.

Strategie per accumulare metaboliti:

Utilizzo di un terreno sbilanciato.

Es. L’esaurimento della fonte di azoto, in presenza di carboidrati

in eccesso, provoca l’arresto dello sviluppo e l’accumulo di

lipidi e/o polisaccaridi, se il microrganismo in analisi e’ metabolicamente predisposto (attenzione all’esaurimento della

fonte di carbonio!!!)

Utilizzo dell’ingegneria genetica per la sovraespressione di enzimi commercialmente utili.

Modificazione genetica del microrganismo di interesse per

“rilassare” i sistemi di controllo

che impediscono l’accumulo di un detreminato metabolita.

Vogliamo ottenere metaboliti microbici ad elevata concentrazione?? Dobbiamo intervenire

per deregolare questi sistemi all’interno della cellula!!!

Possiamo ad esempio utilizzare un ceppo

mutante auxotrofo che non riesce a sintetizzare il prodotto P a causa di un blocco metabolico

prodotto da una mutazione. Aggiungendo piccole quantita’ di P possiamo ottenere l’accumulo dell’intermedio che precede il blocco metabolico.

CONTROLLO Sintesi  degli  enzimi

A5ivita’  degli  enzimi

-­‐‑  Enzimi  costitutivi.

-­‐‑  Enzimi  inducibili  (sopra5u5o  fase   catabolica).  Induzione  sequenziale. -­‐‑  Enzimi  reprimibili  (sopra5u5o  fase   anabolica).

VIA  METABOLICA  RAMIFICATA

Nel  caso  di  una  via  metabolica  ramificata  I   meccanismi  di  controllo  agiscono  in  modo    piu’  

complesso

A E1 B E2 C E3 P

VIA  METABOLICA  LINEARE

Nel  caso  di  una  via  metabolica  lineare  l’equilibrio   relativo  ai  sistemi  di  controllo  e’  basato  su  

meccanismi  piu5osto  semplici.

A B C P1 E1 E D P2 E2 E3

Inibizione  da  feedback Repressione  da  feedback

Avviene  a  livello  genico   quando  la  presenza  di  un   prodo5o  influisce  sulla   sintesi  degli  enzimi  

coinvolti.

Avviene  quando  il  

prodo5o  interferisce  con  il   sito  allosterico  degli  

enzimi  coinvolti.

I  meccanismi  di  inibizione  e  repressione  generalmente   agiscono  in  modo  sinergico.

 1)  Feedback  concertato  o   multivalente:  

Avviene  quando  il   controllo  e’  dovuto   all’azione  della  somma  

dei  prodo5i  sul  primo   enzima  della  catena  

(P1+P2).

 2)  Feedback  cooperativo:   In  questo  caso  l’inibizione  e’  

dovuta  all’effe5o  di  livelli  

significativi  di  un  singolo  prodo5o   (P1  o  P2).  Si  ha  inoltre  un  effe5o  di   inibizione  dei  singoli  prodo5i    su  E2  

o  E3.

3)  Feedback  cumulativo:   Ciascuno  dei  prodo5i  finali  di   una  via  metbaolica  ramificata   inibisce  parzialmente  il  primo   enzima  in  misura  indipendente   dalla  concentrazione  degli  altri  

prodo5i.

 4)  Feedback  sequenziale:   Ciascun  prodo5o  finale  P1  e  P2   esercita  un’azione  sul  primo  enzima  

dopo  la  ramificazione  inibendo  la   conversione  di  un  intermedio  il  che  

produce  a  sua  volta  un  effe5o  di   inibizione  sul  primo  enzima  della  

via  metabolica  (  inibizione  con   meccanismo  sequenziale)

Acido glutammico Acido N-acetil-glutammico ORNITINA N-acetil-ornitina Acido argininsuccinico Citrullina Arginina Blocco da mutazione Accumulo

L’ornitina, e’ una molecola utilizzata nelle terapie epatiche. Viene prodotta

utilizzando un ceppo auxotrofo di Corynebacterium glutamicum

Ricerca e sviluppo nei processi industriali

Screening di biocatalizzatori con migliori proprietà

Miglioramento dei ceppi industriali

Ottimizzazione della

composizione dei terreni di coltura

Miglioramento delle procedure di recupero del prodotto

Screening primario

Screening secondario

La procedura di ricerca e sviluppo di una nuova

sostanza o di un nuovo processo metabolico

prevede:

-

Screening primario

, la cui finalita’ e’

l’isolamento e la caratterizzazione del ceppo

produttore.

-

Screening secondario

, finalizzato al

miglioramento della produttivita’.

Screening primario

Raccolta di campioni e isolamento delle colture.

Eventuale saggio preliminare di attivita’ in solido.

Saggi di valutazione di attivita’ in liquido.

Saggi di inibizione enzimatica.

Caratterizzazione del ceppo produttore ed eventuale brevettazione del

A) Isolamento delle colture: colture ufficiali o isolamento in situ (teniamo conto in quest’ultimo caso degli habitat preferenziali!); l’impiego di terreni specifici o selettivi agevola l’isolamento di certe specie; possiamo impiegare un antibiotico se vogliamo isolare specificamente un batterio o un fungo. Anche la temperatura e’ un importante fattore discriminante!

B) Saggi di attivita’: Possono essere in solido o in liquido. Possiamo evidenziare la presenza di numerose attivita’: produzione di antibiotici, produzione di fattori di crescita, attivita’ proteasica, amilasica, produzione di acidi organici.

Un esempio di saggio in solido per la rivelazione dell’attivita’ antibiotica

1-Microrganismo produttore di antibiotico, striscio

2-Microrganismo produttore di antibiotico, incubazione e sviluppo

3-Striscio microorganismi test 4-Incubazione e valutazione sensibilita’dei ceppi test

N.B. A sviluppo avvenuto si distribuiscono sulla piastra pochi mL di reattivo di Lugol, una soluzione contenente iodio che reagendo con l’amido produce una colorazione blu/viola del

Indicatore utilizzato: verde di bromocresolo.

Carta da filtro imbevuta con i campioni da analizzare

Incubazione

Alone di inibizione dello sviluppo del microorganismo test

Saggio di attività in liquido

Dopo il saggio in liquido puo’ essere

opportuno allestire una

bioautografia

.

Bioautografia

Cromatografia dei campioni

A B C D A B C D

Evidenziazione delle molecole separate

Alla bioautografia

D C B A

Piastra inoculata con microorganismo test

Cromatografia a contatto per 1-4h

Bioautografia

D C B A

A incubare

D C B A

Aloni di inibizione

Risultati: nei campioni B e D sono presenti molecole in grado di inibire lo sviluppo del

Screening secondario

Selezione di ceppi alto-produttori.

Messa a punto delle condizioni colturali. Isolamento e valutazione della sostanza isolata.

Analisi dei costi.

Selezione di ceppi alto-produttori: mutazioni spontanee o indotte. N.B. Spesso puo’ risultare difficile identificare la natura della modificazione genetica avvenuta perche’ alcuni mutageni agiscono

Miglioramento dei ceppi industriali

Gli strumenti impiegabili per il miglioramento sono legati a quante e quali informazioni possediamo sul

microorganismo e sul processo.

informa

zioni

-  Tecniche di mutagenesi random

(mutagenesi non ricombinante)

-  Ricombinazione (naturale o indotta)

del materiale genetico -  Metodi ricombinanti

-  Metodi-omici

Alterare i controlli di regolazione.

Il concetto di manipolazione m e t a b o l i c a f i n a l i z z a t a all’ottenimento di microorganismi con caratteristiche desiderate è un concetto “antico”. Per molti anni la manipolazione dei pathway e’ stata affidata a eventi “random”.

Produzione  di   solventi Produzione  di   antibiotici Produzione  di   vitamine Produzione  di   amminoacidi

Definizione di Mutazione

Mutazioni

Spontanee (avvengono naturalmente, senza l’uso di agenti mutageni chimici o fisici)

Indotte (trattamento con un agente fisico o chimico che aumenta in modo significativo la frequenza degli eventi mutazionali al di sopra del tasso di mutazioni spontanee)

La differenza principale tra mutazioni spontanee e indotte è la frequenza

di mutazione Totale della popolazione

Numero di eventi mutazionali (cellule o individui)

=

Le mutazioni indotte hanno una frequenza di

mutazione superiore a quella che si osserva

Mutazioni indotte

E’ possibile classificare gli agenti mutageni in due classi: fisici e chimici. Un esempio di agenti mutageni fisici sono i raggi X, γ e UV.

I raggi X e γ hanno la capacità di penetrare nei tessuti generando ioni e radicali liberi i quali sono in grado di rompere i legami chimici che costituiscono il DNA. Quindi le radiazioni ionizzanti possono indurre rotture dei cromosomi,

riarrangiamenti cromosomici e danni al DNA, tra cui mutazioni puntiformi.

Generalmente i raggi X e γ sono usati a scopo terapeutico grazie alla loro capacità di penetrare nei tessuti. E’ importante sottolineare che le radiazioni di questi raggi sono cumulativi e che vi è una relazione tra il tempo di esposizione alle radiazioni e la frequenza di mutazioni ottenute.

Impiego di radiazioni: ionizzanti (X e γ) e non ionizzanti (UV)

Raggi UV Formazione di dimeri delle _{pirimidine, incorporazione}

di nucleotidi errati durante la replicazione cellulare

Attenzione alla

fotoriattivazione!!! _{Coltura di cellule}

irradiate (5-10 % di sopravvissuti)

Le radiazioni ionizzanti sono molto pericolose e poco disponibili a livello di laboratorio!!!!

Impiego di mutageni di tipo chimico

Azione in fase di replicazione del DNA:

1)  Analoghi delle basi- Se questi analoghi sono incorporati nel DNA possono verificarsi errori in fase di r e p l i c a z i o n e , p e r e f f e t t o dell’incorporazione di una base sbagliata nell’elica replicata.

2)  Acridine- Sono agenti intercalanti che, inserendosi tra due paia di basi del DNA in fase di replicazione, causano l’inserzione o la delezione di poche paia di basi. L’azione delle acridine produce mutazioni da scivolamento dello schema di lettura.

Azione in assenza di replicazione del DNA:

1)  A c i d o n i t r o s o - P r o d u c e l a deamminazione dell’adenina a ipoxantina e della citosina a uracile. Tale modificazione produce alterazione a livello di appaiamento.

2)  Agenti alchilanti- Introducono nelle basi un gruppo alchilico che ha come diretta conseguenza errori di appaiamento in fase di replicazione

In seguito all’impiego di tali mutageni la produzione puo’ risultare modificata

(positivamente o negativamente rispetto al ceppo genitore) in senso quantitativo, oppure qualitativo, oppure in entrambi i sensi. Cio’ in misura piu’ o

La mutagenesi random può non dare i risultati attesi perché:

-  Frequenza di mutazione non omogenea lungo tutto il genoma;

-  Scarsa efficienza dei sistemi di riparo (tossicità elevata del mutageno);

-  Ulteriori mutazioni a soppressione. Soppressori intragenici (nello stesso gene in cui è avvenuta la mutazione primaria). Soppressori extragenici (i più frequenti generano t-RNA mutati).

A) Resistenza all’antibiotico prodotto Terreno con antibiotico Terreno senza antibiotico S o s p e n s i o n e c e l l u l a r e inoculata per striscio sulla superficie della piastra. Le colonie che cresceranno verso il gradiente maggiore di antibiotico probabilmente sono degli alto-produttori

Indipendentemente dalle tecniche mutagene impiegate, la successiva fase di selezione costituisce un punto critico nell’isolamento dei ceppi, facciamo qualche esempio…

C) Resistenza all’antimetabolita:

Gli antimetaboliti sono molecole che confondono e antagonizzano specificamente, in modo competitivo, l’azione o la funzione biologica di un determinato metabolita provocando la deregolazione dell’attivita’ metabolica e successivamente la morte cellulare. Sono molecole che consentono di isolare mutanti la cui sopravvivenza e’ spesso associata ad un’elevata produzione del corrispondente metabolita non per diretta mutazione dell’enzima chiave ma come conseguenza dell’alterazione dei meccanismi di controllo (ad es. Rimozione dell’inibizione).

B) Isolamento di ceppi auxotrofi

Tecnica del replica-plating

I ceppi auxotrofi possono presentare modificazioni dei sistemi di controllo a livello metabolico, con conseguente alterata capacita’ biosintetica sia in

L’applicazione della tecnica di mutazione e selezione

al problema della produzione di penicillina…

Per antibiotico si intende una molecola naturale, metabolita secondario di Eubatteri, Actinomiceti e Funghi inferiori, prodotta in coincidenza della differenziazione di strutture cellulari specializzate per la sopravvivenza microbica quando il substrato è esaurito. Non tutti sono esclusivamente antibatterici, actinomicina e mitomicina ad esempio, ottenibili da Streptomyces, sono agenti antitumorali

Sviluppo Biomassa (stadio vegetativo) trofofase Fase biosintetica (stadio di produzione) idiofase

Miglioramento dei ceppi produttori di antibiotici

•  uso di radiazioni ionizzanti o agenti mutageni

2) Approccio molecolare (gene-specifico)

•  identificazione dei geni codificanti la via biosintetica •  analisi flussomica ed identificazione degli step lenti

•  sovra-produzione degli E che catalizzano gli step lenti o introduzione di nuovi catalizzatori (nuovi prodotti)!

Un approccio non esclude l’altro anche se possiamo identificare l’approccio “molecolare” come quello tipico

Produzione di aminoacidi per via fermentativa

Tale produzione coinvolge approcci diversi:

Modifica dei processi esistenti (ad es. impiego di nuovi substrati); -  Ottimizzazione dello scale-up

-  Semisintesi, combinazione di microbiologia, enzimologia e chimica - Tecnica del DNA ricombinante, che ha consentito di incrementare le rese.

L-glutammico (400,000 t/ anno)

Molti microorganismi producono aminoacidi, ma non in quantità tali da rendere il processo fermentativo economico. Le quantità naturalmente presenti a livello cellulare dipendono dall’azione dei sistemi di controllo, generalmente molto efficienti. Per ottenere l’accumulo si può intervenire con approcci diversi, che possono portare alla deregolazione dei sistemi di controllo:

-  Impiego di mutanti auxotrofi, ceppi esigenti per un intermedio di una catena metabolica, con conseguente produzione e accumulo dell’intermedio che precede il blocco;

-  Impiego di un mutante regolatore, non sensibile ai meccanismi di regolazione. In una via biosintetica si può avere produzione di un eccesso di prodotto finale con un ceppo insensibile all’inibizione da feed-back;

-  Impiego di ceppi ottenuti per ricombinazione genetica, ad esempio ricombinazione tra due ceppi di mutanti auxotrofi o mutanti regolatori;

-  Impiego della tecnologia del DNA ricombinante, per ottenere l’amplificazione dei geni che codificano la sintesi degli enzimi limitanti le velocità delle reazioni biosintetiche.

Tutte queste procedure possono essere chiaramente impiegate singolarmente o in combinazione!

Production of L-lysine

essential amino acid for most mammals

supplement cereal-based animal feed

other amino acids (methionin and threonine/isoleucine)

share the same synthetic pathway

The yields usually obtained now are around 20 g per 1 litre of the growth medium. Current production:

Il caso della produzione di lisina

La lisina, amminoacido essenziale, presente in bassa concentrazione nelle proteine vegetali, trova largo impiego come integratore nell’alimentazione a base di cereali, sia per l’uomo che per gli animali. La D,L-lisina è potenzialmente ottenibile per via chimica, ma essendo attiva la sola forma L, occorre separare le due forme con procedure chimiche o enzimatiche, generalmente a costo elevato. La via fermentativa per ottenere L-lisina risulta più economica rispetto ad altre procedure.

La L-lisina e’ ottenuta attraverso una via metabolica ramificata che porta a L-lisina, L-metionina, L-treonina, e L-isoleucina.

Lisina

Asparagina

Omoserina Metionina

Treonina Isoleucina Ossalacetato Aspartato

Pathways leading to amino acids are much simpler

in their regulation when compared to E. Coli:

--

very few enzymes are feedback controlled

-- no isoenzymes detected

-- genome sequenced

Corynebacterium glutamicum

Gram-positive, non-pathogenic, fast growing soil bacterium

Problems:

1) vector system are far from ideal (E.coli vectors will not work)

Biochimismo in Corynebacterium glutamicum

Processo Inibizione Repressione

- L’aspartato chinasi e’ un unico enzima e subisce

inibizione da feedback multivalente da treonina e L-lisina

-  L’omoserina deidrogenasi e’ un unico enzima ed e’

represso da L-metionina e inibito con meccanismo feed-back da L-treonina Ossalacetato Acido L-aspartico Semialdeide L-aspartica L-omoserina L-metionina L-treonina L-isoleucina Omoserina deidrogenasi Aspartato chinasi Tetraidropicolinato L-Lisina Aspartil-fosfato Acido diamminopimelico Diidropicolinato

Biochimismo in Escherichia coli Ossalacetato Acido L-aspartico Semialdeide L-aspartica L-omoserina L-metionina L-treonina L-isoleucina Omoserina deidrogenasi Processo Inibizione Repressione Aspartato chinasi Acido diamminopimelico L-Lisina

In E.coli l’aspartato chinasi è costituita da tre isoenzimi, ognuno dei quali è responsabile della sintesi dei tre amminoacidi, ed è regolata dai livelli del corrispondente aminoacido prodotto. La forma I subisce repressione da L-metionina, la II da L-treonina e L-isoleucina, unitamente a inibizione da feed-back da L-treonina, la III è soggetta sia a repressione sia a inibizione da feed-back da lisina. L’omoserina deidrogenasi è costituita da 2 isoenzimi, repressi da L-metionina e inibiti con meccanismo feed-back da L-treonina e L-metionina. Grazie a questa particolare tipologia di regolazione E.coli e’ in grado di “rispondere” ad una miscela sbilanciata di prodotti del pathway

Come abbiamo risolto il problema?

-  Mutanti auxotrofi per omoserina, privi di omoserina deidrogenasi, producono lisina perche’ viene a mancare l’inibizione da treonina sull’aspartato chinasi. Metionina e treonina vanno addizionate in bassa concentrazione, perche’ essendo il ceppo mutante auxotrofo per omoserina, esso non e’ in grado di produrre treonina e metionina. Tali amminoacidi sono tuttavia indispensabili, anche se a bassi livelli, per lo sviluppo cellulare.

-  E’ stato creato un ceppo in cui il gene lysC, codificante per la versione mutata dell’aspartato chinasi non più inibita dalla lisina, è iper-espresso.

La disponibilità della sequenza del genoma di C. glutamicum ha aperto recentemente la strada a nuovi approcci d’ingegneria genetica

basati su analisi di genomica comparativa tra mutanti iperproduttori di lisina e il ceppo selvatico allo scopo di identificare le mutazioni responsabili dell’accresciuta capacità produttiva. Una volta

identificate, queste mutazioni sono state introdotte una ad una nel ceppo selvatico, ricostruendo in questo modo un ceppo alto-produttore privo dei problemi associati alle mutazioni secondarie.

Come è stato isolato il mutante auxotrofo di

Corynebacterium?

- Il ceppo mutante nella regolazione della biosintesi della lisina è stato ottenuto utilizzando un analogo della lisina, l’S-amminoetilcistina (AEC). Al pari della lisina questo analogo inibisce l’attività dell’ aspartato chinasi inibendo conseguentemente la crescita del batterio wild type.

I mutanti resistenti all’AEC, hanno probabilmente un qualche tipo di alterazione nella aspartato chinasi come ad esempio un’alterazione del sito regolatorio allosterico. Quest’ultimo potrebbe ad esempio mostrare un’affinità minore per l’AEC e conseguentemente anche per la lisina, che non è più in grado di effettuare correttamente il meccanismo di regolazione tramite feedback. Attraverso successivi cicli di selezione sono stati ottenuti ceppi mutanti in grado di accumulare una concentrazione di lisina pari a 60g/L.

Corynebacterium glutamicum fluxes

Questo succede perché la maggiore attività piruvato carbossilasica aumenta il flusso di carbonio che entra nel TCA e favorisce il rifornimento

di precursori per la crescita cellulare

Aggiungiamo allora l’iper-espressione del gene codificantel’

La produzione di lisina puo’ avvenire anche

per biotrasformazione!

La L-lisina puo’ essere ottenuta per biotrasformazione, a partire da D,L-ammino-caprolattame, substrato a basso costo ottenibile da cicloesano. La reazione porta alla formazione di L-lisina a opera di un’idrolasi stereospecifica di Cryptococcus laurentii, che converte l’L-isomero del substrato in L-lisina. Il D-isomero non modificato viene sottoposto a racemizzazione ad opera di un ceppo di E.coli. D-ammino-caprolattame Racemizzazione (E.coli) D,L-ammino-caprolattame L-amminocaprolattame idrolasi (C.laurentii) D-ammino-caprolattame _L-lisina

Nonostante la loro notevole complessità, i sistemi biochimici sono caratterizzati dalla loro capacità di raggiungere lo stato stazionario grazie a complessi ed efficaci sistemi di controllo.

In ogni via metabolica vi è almeno una reazione che è lontana dall’equilibrio a causa della bassa attività dell’enzima che la catalizza. La velocità di questa reazione non è limitata dalla disponibilità del substrato ma soltanto dall’attività dell’enzima. La reazione viene indicata come la tappa limitante della via metabolica. In genere queste tappe sono rappresentate da reazioni molto esoergoniche -e quindi essenzialmente irreversibili nelle condizioni intracellulari- e che sono quindi solitamente il bersaglio delle regolazioni metaboliche.

Si è ormai consapevoli del fatto che alcuni composti funzionano sia come intermedi metabolici che come regolatori metabolici di enzimi-chiave.

Una distinzione fondamentale tra i diversi meccanismi della regolazione metabolica riguarda la diretta modulazione che può avvenire o sull’attività dell’enzima presente nella cellula oppure

sui meccanismi secondari che alterano la velocità netta di sintesi di quel particolare enzima. Esistono chiaramente meccanismi di regolazione che si basano su modifiche covalenti, ma ciò che è più comune nella cellula sono graduali variazioni dell’attività enzimatica attraverso l’associazione reversibile con un’altra molecola.

Cellule differenziate e piante superiori Organismi unicellulari Natura specializzata Regolazione enzimatica

Regolazione della concentrazione dell

’

enzima

analizzati fino ad ora comportano a livello cellulare risposte estremamente rapide.

Esiste pero’ un altro sistema per alterare l’attivita’ di un enzima che agisce sulla quantita’ totale dell’enzima

presente in un dato momento nella cellula.

Trascrizione del DNA Traduzione del RNA

Non dimentichiamo che esistono nella cellula enzimi costitutivi ed enzimi inducibili; la regolazione di questi ultimi si puo’ basare soprattutto sulla variazione della concentrazione intracellulare.

Le cellule possono anche regolare la quantita’ di enzima presente, generalmente modificando la velocita’ di sintesi dell’enzima. L’aumento o la diminuzione della sintesi dell’enzima fa modificare la popolazione complessiva di siti attivi e l’efficienza delle molecole di enzima gia’ esistenti non ne e’ influenzata. Molti degli enzimi la cui sintesi e’ soggetta a una regolazione sono quelli necessari soltanto in un determinato stadio dello sviluppo o in particolari condizioni fisiologiche

Stabilita’ dell’RNA messaggero Frequenza di inizio della traduzione Velocita’ della sintesi proteica

La regolazione traduzionale e’ ad esempio comune in diversi operoni che codificano per proteine ribosomali. Un altro schema di regolazione importante per l’rRNA e’ quella che viene definita risposta stringente. Se una coltura in attiva crescita viene depleta di un determinato amminoacido, si ha la formazione di un tRNA non carico che induce il gene relA. Il prodotto del gene relA è una proteina nota con il nome di “fattore stringente” (localizzata esclusivamente nel ribosoma 50S), responsabile per la produzione del ppGpp. La produzione del segnale ppGpp (guanosina tetrafosfato) provoca l’interruzione della sintesi proteica che a sua volta produce la cessazione della sintesi dell’ rRNA.

La traduzione puo’ essere regolata da fattori specifici che competono

con il ribosoma per il legame alla rbs