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Riassunto 1 Abstract 5 Capitolo 1 INTRODUZIONE 8 Le cellule staminali 9Il sistema modello: le planarie 10
I neoblasti e la rigenerazione 11
Localizzazione dei neoblasti 13
I raggi X ed eliminazione selettiva dei neoblasti 15
Sottopopolazioni di neoblasti 15
Analisi del profilo genetico dei neoblasti mediante la metodica
dei microarray 18
RbAp48 19
RbAp48 e la via di trasduzione mediata da Ras 20
RbAp48 e le cellule staminali 20
Le proibitine 21
Regolazione trascrizionale di PHB2 mediata da recettori
per gli estrogeni 21
Ruolo di PHB2 nel differenziamento muscolare 22 Protezione della coesione tra cromatidi fratelli mediata da PHB2 23
PHB2 e le cellule staminali 23
Scopo della tesi 25
Capitolo 2
RISULTATI E DISCUSSIONE 27
Processo di ripopolamento dei neoblasti in seguito a trattamento
con 5 Gy 28
Identificazione della minima dose letale di raggi X 28 Effetti del trattamento con 5 Gy sulla rigenerazione della planaria 28
II Effetti del trattamento con 5 Gy sui neoblasti 29 Effetti del trattamento con 5 Gy sulle diverse popolazioni di neoblasti 38 Effetti dei trattamenti con 1, 2, 3 Gy sui neoblasti 40
Discussione 42
RbAp48 è coinvolto nella biologia delle cellule staminali adulte di planaria
Isolamento e analisi dell’espressione di DjRbAp48 46
Ruolo di DjRbAp48 nella rigenerazione 49
Ruolo di DjRbAp48 in planarie intatte 55
Effetto del silenzia mento di DjRbAp48 sull’architettura della
cromatina 63
Discussione 66
Ruolo di DjPHB2 nel mantenimento delle cellule staminali di
planaria 70
Isolamento del gene DjPHB2 e analisi della sua espressione 70
Ruolo di DjPHB2 durante la rigenerazione 74
Ruolo di DjPHB2 in planarie intatte 80
Discussione 84
Conclusioni e prospettive 87
Capitolo 3
MATERIALI E METODI 89
Animali 90
Irradiamento con raggi X 90
Isolamento di DjPHB2 e DjRbAp48 90
Clonaggio dei prodotti di amplificazione in plasmide e screening
bianco/blu delle colonie 91
Estrazione di DNA plasmidico su piccola scala mediante
lisi alcalina (miniprep) 93
Estrazione di DNA plasmidico su media scala (midiprep) 93
III Estrazione di RNA totale e produzione di cDNA 94
Esperimenti di interferenza genica 94
Protocolli di iniezione di RNA a doppia elica (dsRNA) 96
Produzione sonde 96
Ibridazione in situ su sezioni 99
Trattamento con colchicina 101
Analisi delle mitosi 101
Colorazione preparati istologici con ematossilina ed eosina 101 Analisi ultrastrutturale al microscopio elettronico a trasmissione 102 Inclusione in paraffina ed esperimenti di immunoistochimica 103
Trattamento con spantide 105
Analisi al FACS 105
Diffusion assay 105
Real-time RT-PCR 106
Analisi dei nuclei 106
Isolamento di estratti nucleari e saggio dell’attività delle deacetilasi 107
Rivelazione di cellule marcate con BrdU 107
Capitolo 4
BIBLIOGRAFIA 109
Allegato 1 Allegato 2
