Valutazione Clinica

Cinquanta cani sono stati valutati in questo studio: 18 nel gruppo miltefosine-allopurinolo (Gruppo A), 14 nel gruppo difloxacin-metronidazolo (Gruppo B) e 18 nel gruppo Antimoniato di N-metilglucamina (AnM)-allopurinolo (Gruppo C). Durante il follow up di 2 anni 8 soggetti sono deceduti: 4 cani del gruppo A ,1 del gruppo B e 3 del gruppo C.

Valutazione Clinica

Monitoraggio segni clinici

Prima del trattamento i principali segni clinici sono stati dimagrimento, linfoadenomgalia periferica, pallore delle mucose e lesioni cutanee.

I risultati mostrano che l’anemia, l’ipoalbuminemia, l’iperproteinemia e l’iperglobulinemia sono i principali segni riscontrati al giorno 0 nei soggetti analizzati. La variabilità e il grado delle alterazioni clinicopatologiche dipendono principalmente dalla progressione della malattia (Ciaramella et al.,1997) e dall’area geografica in cui vive il soggetto. Nel nostro studio, all’inizio del trattamento, i cani affetti da leishmaniosi, avevano alterazioni dei parametri di laboratorio paragonabili ai risultati ottenuti da altri autori (Strauss-Ayali and Baneth 2000; Koutinas et al.,

2000, Bianciardi 2004, Mateo et al., 2009, Mirò et a.l 2009).

Dopo l'inizio delle tre tipologie di trattamento si è verificato un costante e significativo miglioramento del clinical score (P<0..05)(Grafico 5.1). Dopo un mese dall’inizio delle terapie circa il 50% dei soggetti non presentavano segni clinici e al giorno 90 la riduzione dei segni clinici era presente in circa il 70% dei cani.

Al termine del follow up questa riduzione è presente nella quasi totalità dei soggetti analizzati (Tabella 5.1).

Un altro parametro da considerare è stata la riduzione di volume dei linfonodi, soprattutto i poplitei (anche perché analizzati più scrupolosamente), che si è evidenziata nella totalità dei casi.

Percentuale di riduzione punteggio clinico (media, 95% IC) Giorni Gr. A Gr. B Gr. C p* G30 55.4 (43.5-66.3) 51.6 (40.2-62.2) 49.6 (36.3-65.4) 0.16 G90 75.4 (66.3-84,5) 74.3 (68.6-84.3) 69.9 (61.3-79.8) 0.42 G180 83.5 (77.1-88.2) 84.7 (78.1-95.6) 82.6 (75.6-92,7) 0.53 G360 87.1 (80.3-95.2) 85,6 (77.6- 94.5) 83,1 (76.5-92.1) 0.17 G720 88.6 (82.3-96.1) 87.4 (79.3-96.1) 85.2 (80.2- 95.7) 0.21

Tab5.1:Percentuale di riduzione del punteggio clinico totale nei tre gruppi terapeutici dopo 2 anni di follow up.

* t-test: comparazione tra i tre gruppi. Differenze non statisticamente significative (P>0.05) 0 2 4 6 8 10 12 0 30 90 180 360 720 Giorni P u n te ggi o c li n ic o

Gruppo A

Gruppo B

Gruppo C

Effetti collaterali evidenziati

La valutazione degli effetti collaterali è avvenuta in corrispondenza delle visite cliniche effettuate per il follow up terapeutico oppure nel caso in cui il proprietario osservasse un peggioramento dei segni clinici del soggetto sotto terapia.

Gruppo A

Partendo dal Gruppo A su 18 soggetti arruolati a giorno 0, 14 cani sono rimasti in vita fino alla fine dei due anni. I 4 soggetti deceduti presentavano segni riferibili a insufficienza renale, legato a un peggioramento dei parametri di emocromo e dell’elettroforesi delle proteine, nonché ad un peggioramento dei parametri biochimici di funzionalità renale (aumento urea e creatinina). In 2/18 (11%) sono stati evidenziati segni generali quali letargia e depressione del sensorio e 1/18 (5%) segni gastrointestinali (vomito, diarrea, anoressia).

Gruppo B

Il Gruppo trattato con l’associazione difloxacina-metronidazolo non ha avuto particolari effetti negativi legati al trattamento. Un soggetto è morto dopo circa 6 mesi ma per cause non imputabili alla leishmania (incidente automobilistico). Solo un soggetto presentava segni gastrointestinali comunque autolimitanti e quindi scomparsi con la sospensione momentanea della terapia.

Gruppo C

Come nei precedenti gruppi anche nel gruppo C tutti i soggetti non presentavano alterazioni di laboratorio riconducibili a insufficienza renale o epatica a giorno 0 visto che si trattava di uno dei criteri di esclusione ai protocolli terapeutici valutati. Dopo tre mesi dalla somministrazione di AnM-allopurinolo 3/18 (17%) soggetti sono deceduti con segni clinici e parametri di laboratorio riconducibili a insufficienza renale. Dei restanti 15, 2 (13%) hanno riportato segni gastroenterici quali vomito e diarrea; migliorano comunque dopo essere stati trattati con una terapia sintomatica di supporto. (Tabella 5.2).

Tab. 5.2: Effetti collaterali nei tre trattamenti valutati. Legenda: †: soggetti rimasti in vita

Monitoraggio Emocromo

Prima dell’ inizio del trattamento circa il 50% dei soggetti di ogni gruppo valutato presentavano anemia. Alla fine del follow up i soggetti rimasti, presentavano un miglioramento del emocromo, in particolare un aumento dell’Hct e del numero dei RBC statisticamente significativo (P<0.05)(Grafico 5.2).

Gruppo A

Nove cani (9/18, 50%) del gruppo A al giorno 0 presentavano anemia valutata con la diminuzione di almeno due parametri tra numero di globuli rossi, ematocrito e emoglobina. Dopo il trattamento con l’associazione miltefosine-allopurinolo hanno evidenziato un miglioramento dell’emocromo in 5/9 (55%), considerando però che 2 soggetti sono andati incontro a morte per insufficienza renale (Grafico 5.3).

Gruppo B

A conferma dei risultati ottenuti da altri autori, che hanno sperimentato una terapia anti-leishmania con altri chinoloni (Bianciardi et al., 2004), l’ematocrito nei cani del gruppo B è migliorato in tutti (13/13), ed è rientrato pienamente nei valori in 4/8 (50%) dei soggetti colpiti da anemia (Grafico 5.4).

Gruppo

N. Soggetti con effetti collaterali

Effetti collaterali Note

A 4/18 Insufficienza renale, morte Dopo 3-6 mesi

2/14† Letargia 1/14† Diarrea Migliora dopo sospensione del trattamento B 1/13† Diarrea, vomito Migliora dopo sospensione del trattamento C 2/15† 3/18

Diarrea, vomito, anoressia

Insufficienza renale, morte

Migliora con trattamento Sintomatico

Gruppo C

Dieci cani (10/18,55%) del gruppo C presentavano anemia. Sette (7/10, 70%), sono rientrati nei valori di riferimento. Dei restanti 3 soggetti, 2 sono andati incontro a morte con segni di anemia, 1 è rimasto leggermente sotto i limiti dell’intervallo di riferimento (Grafico 5.5). 0 1 2 3 4 5 6 7

Gruppo A Gruppo B Gruppo C

RBC

G 0 G 360 G 720

Grafico 5.2: Media del valori dei globuli rossi nei tre gruppi a giorno 0, 360, 720.

La linea tratteggiata indica il valore minimo del range dei globuli rossi.

Grafico 5.3: Monitoraggio RBC nel Gruppo A (miltefosina-allopurinolo) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 M / u L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Casi

RBC Gruppo A

Grafico 5.4: Monitoraggio RBC gruppo B (difloxacina- metronidazolo)

Grafico 5.5: Monitoraggio RBC gruppo C (AnM-allopurinolo)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 M / u L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Casi

RBC Gruppo B

RBC Gruppo C

Riassumendo, i tre gruppi valutati hanno evidenziato un miglioramento dell’emocromo ,con aumento sia dei globuli rossi che dell’ematocrito. Tra i tre gruppi non ci sono inoltre differenze statisticamente significative (P>0.05) sull’entità di questo miglioramento.

Da evidenziare il volume piastrinico medio (MPV) che è aumentato in tutti i soggetti trattati, ed è rimasto tale anche dopo la terapia. Questo valore non era comunque accompagnato da macropiastrine e quindi non significativo dal punto di vista ematologico.

Singolare la trombocitosi in 3 soggetti osservata nel gruppo A; probabilmente legata a infiammazione cronica o a mielodisplasia per la presenza di leishmanie nel midollo. (Carol et al 2000).

Poco significativo il rilievo dei globuli bianchi in quanto risultano nella norma sia al giorno 0 che al mese 24 in tutti i soggetti esaminati, a parte una leggera leucocitosi rilevata in due soggetti del gruppo A e del gruppo C.

Monitoraggio parametri biochimici

Durante il follow up sono stati eseguiti esami di laboratorio mirati a valutare la funzionalità epatica e renale. A giorno 0 nessuno dei soggetti reclutati presentava segni di danno renale o epatico.

Gruppo A

Nel Gruppo A 4 soggetti sono morti per insufficienza renale. Inoltre 8 cani dei restanti (8/14) dopo 6 mesi di terapia presentano un aumento dell’urea e della creatinina pur restando nei range fisiologici. Da notare che probabilmente la terapia utilizzata, anche se non risulta dannosa per i reni, non ostacola neanche la formazione degli immunocomplessi.

Gruppo B

I parametri di funzionalità renale ed epatica sono rimasti nella norma per tutta la durata della terapia nel gruppo trattato con l’associazione chinolone-metronidazolo. Gruppo C

Il gruppo C ha evidenziato un peggioramento della funzionalità renale in 5 soggetti (5/18), tre dei quali sono andati incontro a morte mentre i restanti due cani hanno evidenziato miglioramenti con una terapia di supporto.

La funzionalità epatica è stata valutata con il dosaggio di due enzimi: le Alt, indicatore di danno epatico ad alta specificità e le GGT indice di colestasi. Inoltre la valutazione delle proteine sieriche totali e del rapporto A/G descritti successivamente completano la valutazione di organo.

Per quanto riguarda i due enzimi sopracitati in tutti e tre i gruppi valutati non sono state riscontrate alterazioni in tutti i soggetti compresi quelli che non sono riusciti a completare il follow up.(Tabella 5.3).

Monitoraggio siero-elettroforesi delle proteine

L’elettroforesi delle proteine sieriche, pur essendo un test diagnostico aspecifico, nel follow up dei casi clinici, ha rispecchiato l’andamento della malattia: l’aumento dell’albumina insieme alla diminuzione delle gamma globuline è stato indice di miglioramento sia clinico che sierologico.

Parametri di laboratorio (cut-off) Gr. A N(%) Gr. B N(%) Gr. C N(%) Creatinina (0.8-1.5 mg/dL) e Urea (20-60 mg/dL) Normale Normale Normale Patologico Patologico Normale Patologico Patologico Tot. Cani 14(78) 4(22) 0 (0) 0 (0) 18 14 (100) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 14 13(72) 5(28) 0 (0) 0 (0) 18 Alt (31-95U/L) GGT(2-15U/L)

Normale Normale Tot cani 18(100) 18 14 (100) 14 18(100) 18

Le altre frazioni invece variano in modo molto individuale, e quindi sono scarsamente significative al fine di valutare un loro cambiamento associato alla terapia in atto.

Gruppo A

Nel gruppo A tra i 14 cani sopravvissuti, 13 presentano ipoalbuminemia al giorno 0, che tenderà a risolversi al 6 mese soltanto in 3 cani (Ambrogio, Gino e Braco); negli altri il valore rimane sotto la media. Zico, Napoleone e Beau sono stati controllati fino al 24° mese, soltanto in Napoleone il valore torna nella norma. Il rapporto A/G risulta inferiore a 0,60 al mese 0 in 11 soggetti); di questi soltanto 4 (Ambrogio,Gino,Braco e Napoleone), presentano valori normalizzati al 6 mese. Al 12° mese anche Braco e Zico presentano il rapporto con valore superiore a 0,60. Luna e Dante risultano per tutto il periodo di osservazione disprotidemici. Da notare che la terapia ha permesso di mantenere costante, in alcuni soggetti (Titta, Ianto, Beau), il rapporto A/G, in altri ha favorito un miglioramento tra i 6 (Ambrogio,Gino,Braco e Napoleone) e i 12 (Zico e Braco) mesi. Nel complesso non risultano migliorati Randa, Luna e Dante. Cinque soggetti hanno riscontrato un peggioramento del rapporto A/G dall’inizio della terapia (Grafico 5.6).

Gruppo B

Su 14 cani valutati 8 (57%) presentavano prima del trattamento ipoalbuminemia con aumento delle gamma globuline con una conseguente diminuzione del rapporto A/G. Dopo un anno dal primo trattamento in 10 /13 dei soggetti rimasti si osserva una normalizzazione del rapporto A/G che rimane pressoché invariato fino al termine del monitoraggio (Grafico 5.7).

Gruppo C

Questo gruppo presentava il numero maggiore di soggetti con il rapporto A/G alterato (13/18, 72%).

Quello che si osserva è un netto miglioramento del parametro valutato ma più graduale nel tempo. Solo infatti con un secondo ciclo di terapia e dopo 2 anni di floow up si è ottenuto un miglioramento in 11/13 soggetti. Nei due restanti si è invece notato un peggioramento del rapporto forse dovuto ad un inizio di nefropatia

con conseguente perdita di albumina e riacutizzazione della malattia in atto (Grafico 5.8).

L’andamento delle gamma globuline è stato simile a quello del rapporto A/G, nei tre gruppi. Infatti questa frazione elettroforetica è correlata con un aumento degli anticorpi circolanti non protettivi nei confronti di Leishmania quindi al suo aumentare corrisponde una diminuzione del rapporto A/G.

Come per il rapporto A/G quindi i miglioramenti sono stati più sensibili nel gruppo B e C e a lungo termine il gruppo C ha mantenuto i valori nel range di normalità in 14/15 (93%) soggetti. Nel Gruppo A invece non si è osservato un miglioramento significativo della frazione globulinica cioè i valori sono rimasti sopra i limiti di riferimento in 10/14 cani (Tabella 5.4).

Un altro valore da prendere in considerazione per valutare il miglioramento clinico dell’animale, è il dosaggio delle proteine totali; questo valore tende a diminuire rientrando nel range normale nei soliti soggetti in cui si ha miglioramento del rapporto albumine/globuline.

In 5 soggetti analizzati (2 gruppo A ,1 gruppo B e 2 gruppo C) le proteine totali all’inizio della terapia erano basse pur ritrovando segni clinici e analisi laboratorio alterate. Questo calo potrebbe forse essere correlato al forte deperimento iniziale.

Parametri di laboratorio (cut-off) Gr. A N(%) Gr. B N(%) Gr. C N(%) Rapp A/G (X>0.6) Normale Normale Normale Patologico Patologico Normale Patologico Patologico Tot. cani 5 (28) 2 (11) 5 (28) 6 (33) 18(4†) 6 (43) 0 (0) 5 (36) 3 (21) 14(1†) 4 (22) 1 (5) 9 (50) 4 (22) 15(3†)

Tabella 5.4: Valori riferiti al rapporto A/G dal giorno 0 a 720 nei tre gruppi valutati.

Grafico 5.6: Monitoraggio A/G Gruppo A

Grafico 5.7: Monitoraggio A/G Gruppo B 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 † 2 3 4 5 6 † 8 † 10 11 12 † 14 15 16 17 18 Casi

A/G Gruppo A

A/G Gruppo B

Grafico 5.8: Monitoraggio A/G Gruppo C

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

2

3

4

5

6

†

8

9

† 11 12 13 † 15 16 17 18

Casi

A/G Gruppo C

G0

G360

G720

Valutazione Parassitologica

IFAT

Al giorno 0 tutti i soggetti presentavano un IFAT positiva con titoli compresi tra 1/80 e 1/5120. Il titolo anticorpale non aveva differenze significative tra i tre gruppi

(P=0.91).

Dopo un mese di terapia si osserva in tutti i soggetti analizzati un miglioramento significativo (P=0.01) del titolo anticorpale. (Grafico 5.9)

Gruppo A

Il gruppo trattato con le miltefosine e allopurinolo ha mostrato un miglioramento al primo mese di 16/18 soggetti (89%). Dopo 6 mesi dal trattamento dei 14 cani rimasti in vita 4 (29%) risultavano con un titolo negativo, 8 con un miglioramento però più graduale rispetto a quello osservato al giorno 30.

Due soggetti invece hanno mantenuto un IFAT invariata che è rimasta positiva per tutto il follow up dello studio.

Dopo il secondo ciclo di trattamento avvenuto ad un anno di distanza dal primo i titoli dei 14 cani sono rimasti invariati. Durante l’ultimo controllo avvenuto a due anni di distanza i 4 soggetti negativizzati dopo 6 mesi dal primo trattamento risultavano nuovamente positivi anche se con un titolo anticorpale basso (1/80 e 1/160).

Gruppo B

Al giorno 30, 13/14 (93%) soggetti mostravano una diminuzione del titolo anticorpale fino ad arrivare alla negativizzazione in 2 (14%) di loro, che comunque presentavano all’inizio del trattamento un titolo basso (1/80 e 1/160). Dopo due anni dall’inizio del primo ciclo di terapia si osserva un netto miglioramento nei titoli e i due casi negativizzati rimangono negativi. Inoltre nei rimanenti cani il titolo è notevolmente sceso a valori compresi tra 1/80 e 1/320. Tra i valori osservati dopo un anno e quelli misurati dopo due anni e quindi con il secondo ciclo di trattamento non ci sono state differenze significative.

Gruppo C

I titoli anticorpali sono diminuiti durante il trattamento specialmente dopo i primi 30-60 giorni di terapia. A 6 mesi 5/18 (28%) erano sieronegativi. A 1 anno dei 15 soggetti rimasti 5 risultano ancora siero negativi, mentre a due anni 2 di questi hanno presentato nuovamente anticorpi anti-Leishmania, Mentre altri 2 diventano sieronegativi.

In questo gruppo quindi si ha il miglior risultato in termini di sieronegativizzazione (5/15,33%).

Quello che si osserva in tutti e tre i gruppi è che esiste una alta variabilità individuale nell’andamento del titolo anticorpale. In alcuni casi infatti la diminuzione del titolo è molto veloce, mentre in altri cani mantengono costante il titolo durante tutto il follow up pur mostrando un miglioramento clinico.

La tabella 5.5 riassume i risultati sierologici dei tre gruppi analizzati.

IFAT

IFAT

Cane Gruppo A Gruppo B Gruppo C

G0 G360 G720 G0 G360 G720 G0 G360 G720

1 1/160 † 1/320 1/40 1/80 1/80 Neg Neg

2 1/320 1/320 1/320 1/320 1/80 1/80 1/640 1/80 Neg

3 1/80 Neg 1/80 1/80 Neg Neg 1/80 1/40 Neg

4 1/160 1/80 1/40 1/80 1/80 1/80 1/1280 1/160 1/80 5 1/640 1/80 1/80 1/160 1/80 1/80 1/1280 1/160 1/640 6 1/640 Neg 1/160 1/1280 1/320 1/320 1/160 1/40 1/80 7 1/320 † 1/320 1/80 1/160 1/160 † 8 1/160 1/80 1/80 1/160 1/40 1/80 1/80 Neg Neg 9 1/80 † 1/160 1/80 1/80 1/2560 1/160 1/80 10 1/160 1/80 1/40 1/1280 1/160 1/160 1/160 † 11 1/80 1/40 1/80 1/1280 1/320 1/320 1/160 1/80 1/160 12 1/80 1/80 1/80 1/1280 † 1/320 1/160 1/80 13 1/80 † 1/640 1/320 1/80 1/80 Neg Neg 14 1/5120 1/160 1/80 1/160 Neg Neg 1/160 † 15 1/80 Neg 1/80 1/320 1/160 1/640 16 1/640 1/160 1/160 1/640 1/80 1/80 17 1/320 Neg 1/80 1/80 Neg 1/80 18 1/80 1/40 1/40 1/640 Neg 1/160

Tabella 5.5. Risultati IFAT nei tre gruppi. Legenda: In neretto: soggetti recidivi †soggetti deceduti.

PCR qualitativa

Al giorno 0 tutti i soggetti di tutti e tre i gruppi presentavano un PCR positiva a tutti i tessuti analizzati. Dopo 12 mesi di terapia si osserva una negativizzazione sul sangue in circa il 50% dei soggetti. Dopo 2 anni di follow up il numero di negativi aumenta, in particolar modo nel sangue (Tabella 5.6). Durante il monitoraggio dei soggetti non è stato sempre possibile effettuare il puntato linfonodale per la mancata collaborazione del proprietario o per le ridotte dimensioni dello stesso che ne impedivano il campionamento.

Gruppo A

Negativizzazione della PCR su sangue di 4/18 (22%) campioni dopo 30 giorni di terapia. Dopo un anno, su 14 cani rimasti in vita, 4 (29%) risultavano negativi su sangue, 3 su congiuntiva, 2 su linfonodo. Al termine dello studio 6/14 soggetti risultano negativi al sangue e di questi 4 anche alla congiuntiva. Rimanevano tutti positivi su linfonodo.

Gruppo B

Al giorno 360, 5/13 (38%) cani risultavano negativi su sangue, 4 (30%) su congiuntiva, 2 (15%) su linfonodo. Al termine del follow up 7/13 (54%) erano negativi su sangue, 4 (30%) su congiuntiva, 2 (15%) su linfonodo.

Gruppo C

Nel gruppo trattato con antimoniali e allopurinolo sono stati ottenuti i seguenti risultati:

G30: 6/18 (33%) negativi su sangue

G360-720: 10/15 (67%) risultano negativi su sangue, 5 (33%) su congiuntiva e (20%) su linfonodo

Tab. 5.6: Risultati PCR nei tre gruppi. Legenda: n.e: non effettuato

PCR

Cane Gruppo A (S/C/L ) Gruppo B (S/C/L) Gruppo C (S/C/L) G0 G360 G720 G0 G360 G720 G0 G360 G720 1 +/+/+ +/+/+ -/-/+ -/-/- +/+/+ -/-/- -/-/- 2 +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ -/+/+ +/+/+ -/-/+ -/-/- 3 +/+/+ -/-/+ -/+/+ +/+/+ -/-/- -/-/- +/+/+ -/+/+ -/-/+ 4 +/+/+ +/+/n.e -/-/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/n.e 5 +/+/+ +/+/+ -/+/+ +/+/+ -/+/+ -/-/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ 6 +/+/+ -/-/- -/+/+ +/+/+ +/+/n.e +/+/+ +/+/+ +/+/n.e -/+/n.e 7 +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+

8 +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ -/-/+ -/-/+ +/+/+ -/-/- -/-/- 9 +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ -/+/+ -/-/n.e 10 +/+/+ +/+/+ -/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+

11 +/+/+ +/+/n.e +/+/+ +/+/+ +/+/n.e +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/n.e 12 +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ -/+/+ +/+/+ 13 +/+/+ +/+/+ +/+/+ -/-/+ +/+/+ -/-/+ -/-/- 14 +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ -/-/- -/-/- +/+/+ 15 +/+/+ -/-/- +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ 16 +/+/+ +/+/+ +/+/+ +/+/+ -/+/+ -/+/+ 17 +/+/+ -/+/+ +/+/+ +/+/+ -/-/- -/+/+ 18 +/+/+ +/+/+ -/+/+ +/+/+ -/-/n.e -/+/n.e

Real time PCR (qPCR)

Un’alta carica parassitaria è stata osservata nel puntato linfonodale a giorno 0 (Tabella 5.7) (valore medio 5006,03 DNA/µ L). Nel sangue intero questo valore è statisticamente inferiore (197,67 DNA/µ L) nei confronti dell’aspirato linfonodale (Tabella 5.8). Questi risultati confermano studi precedenti (Ikonomopoulos et al.,

2003; Manna et al., 2004; Saridomichelakis et al., 2005).

Dopo un mese di terapia nella totalità dei soggetti si osserva una diminuzione della carica sia nel sangue che nel linfonodo. Questa diminuzione diventa più evidente alla fine del follow up.

Una completa eliminazione del parassita non è stata osservata in nessun soggetto.

Gruppo LINFONODO (Leishmania DNA/µL)

Giorno 0 Giorno 180 Giorno 720

A 3543 410 71.25

B 4898 544.4 34.78

C 6587 555.9 16.39

Tab. 5.7 Carica parassitaria media nell’aspirato linfonodale nei gruppi A, B e C. P>0.05 tra i tre gruppi.

Gruppo SANGUE (Leishmania DNA/µL)

Giorno 0 Giorno 180 Giorno 720

A 182.8 41.54 5.145

B 147.2 37.29 1.847

C 264.7 19.41 1.457

Tab. 5.8 Carica parassitaria media su sangue nei gruppi A, B e C. P>0.05 tra i tre gruppi.

Il grafico 5.10 mostra i risultati ottenuti sia con la PCR convenzionale che con la qPCR. Si osserva come i soggetti che risultavano negativi alla PCR convenzionale mostrano una graduale diminuzione della carica parassitaria ma non un sterilizzazione del parassita.

Inoltre valutando i risultati ottenuti dai due diversi tessuti sono stati registrati valori di partenza nettamente inferiori sul sangue ne confronti del linfonodo (Grafico 5.11).

Carica parassitaria su linfonodo (n° copie/µL)

Carica parassitaria su sangue (n° copie/µL)

Grafico 5.10 e 5.11: Progressione della carica parassitaria nel follow up post trattamento (Medie dei gruppi). La linea nera rappresenta i risultati negativi o positivi per la PCR convenzionale.

Nel grafico 5.12, 4 soggetti (3, 6, 15, 17) del gruppo A trattato con le miltefosine, si osserva un aumento della carica parassitaria dopo circa 6-9 mesi dall’inizio della terapia, in concomitanza di una ricaduta della malattia.