LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDRA
LINA PREIŠEGOLAVIČIŪTö
VIŠČIUKŲ CHORIOALANTOJINöS MEMBRANOS PANAUDOJIMAS MOKSLINIAMS TYRIMAMS
Chicken chorioallantoic membrane as a model for a research study
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Asist. I.Alionien÷
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Viščiukų chorioalantojin÷s membranos
panaudojimas moksliniams tyrimams“ 1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie n÷ra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DöL DARBO GYNIMO
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
(aprobacijos data) (Gynimo komisijos sekretor÷s/riaus vardas, pavard÷) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra patalpintas į ETD IS
(gynimokomisijos sekretor÷s/riaus parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
Turinys
1. Santrumpos... 4
2. Santrauka (anglų kalba)... 5
3. Įvadas ... 7
4. Literatūros apžvalga ... 9
4.1. Chorioalantojin÷s membranos ypatumai ir susidarymas ... 9
4.2. Chorioalantojin÷s membranos morfologija... 11
4.3. Hepatoceliulin÷ karcinoma ... 14
4.4. Naviko morfologinis tyrimas ir diagnostika ... 15
4.5. Chorioalantojin÷s membranos panaudojimas navikų tyrimams ... 16
5. Tyrimo metodika ... 18
5.1. Apvaisintų kiaušinių inkubavimas ... 18
5.2. Langelių atidarymas, pasiruošimas sodinti medžiagą... 20
5.3. Kepenų karcinomos ląstelių linijos transplantavimas... 21
5.4. Dažymas hematoksilinu ir eozinu... 24
5.5. Imunohistocheminis dažymas... 25
5.6. CAM dažymui naudojami pirminiai antikūnai ... 28
6. Tyrimų rezultatai ... 29
6.1. Histologinis ir imunohistocheminis tyrimas ... 29
6.2. Morfometrinis tyrimas ... 33
7. Aptarimas ... 39
8. Išvados... 42
9. Pad÷kos... 43
1. Santrumpos
CAM – chorioalantojin÷ membranaHBV – hepatito B virusas
AE – alantojo epitelis CE – choriono epitelis
IHC – imunohistochemija
VEGF – vascular endothelial growth factor (kraujagyslių endotelio augimo faktorius)
HE – hematoksilinas ir eozinas
ENV – EnVision (išryškinimo rinkinys)
αSMA(N) – α lygiųjų raumenų aktinas (Smooth Muscle Actin)
flk-1 – endotelio tirozino kinaz÷s receptorius
mM – milimoliai
HCK – hepatoceliulin÷ karcinoma (kepenų ląstelių v÷žys) HRP – horseradish peroxidase (krienų peroksidaz÷)
DAB – diaminobenzidinas
2. Santrauka (anglų kalba)
Master final assignment – „Chicken chorioallantoic membrane as a model for a research study”
Author: Lina Preišegolavičiūt÷, Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy, Kaunas 2013
Tutor: Assistant I. Alionien÷
Aim of the study:
Morphologically evaluate chicken chorioallantoic membrane (CAM) when grafting hepatoma cell line (MH–22A).
Results:
Affected group CAM and its epithelium at the day 12 and 14 were much thicker than control group on the same day of incubation.
Mammal cell grafting into chorioallantoic membrane (CAM) is a thoroughly researched experimental system. It is used to evaluate a range of parameters associated with tumor growth. Experiments with chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) have been widely used to study the morphological, functional and other aspects of tumor growth and its invasion to the CAM.
The aim of this experiment is to show CAM changes and its response induced by hepatocellular carcinoma cell culture. Tumor induced changes were compared with the control group CAM on the same incubation day.
Malignant tumor cells could migrate across the chorioallantoic epithelium into mesenchyme and to form a mass which is immunologically active to the specific antibodies.
Conclusion:
1. CAM mesenchyme cells, which have actin in cytoplasm, and blood vessels, were identified imunohistochemically by using special antibody αSMA. VEGF reaction was not that significant as the one with αSMA.
2. CAM epithelial reaction of grafted hepatocellular carcinoma cells is determined by its thickening. The number of epithelial cell layers was increased. CAM reaction which was caused by hepatocellular cells by using an insert was stronger than the ones without an insert.
3. Chorioallantoic membrane also reacted to grafted hepatocellular carcinoma cells accordingly to their thickening. During evaluation of central and peripheral zones of chorioallantoic membrane, a significant CAM thickening was observed. Thickening of chorioallantoic membrane in central zone was much more expressed when using an insert.
3. Įvadas
Šiuo metu biomedicinoje, audinių atsakui į medžiagas, kurios tiesiogiai veikia biologines sistemas, in vivo dažniausiai naudojami žinduolių modeliai, tokie kaip pel÷s, žiurk÷s ir šunys. Tačiau ne tik d÷l moralinių nuostatų, bet ir atsižvelgiant į laiko, darbo bei finansines sąnaudas, žinduoliai pasirenkami rečiau (Valdes T.I. ir kt., 2001). Šiuo metu stebimas seniai naudojamo viščiuko embriono chorioalantojin÷s membranos (CAM) metodo „atgimimas“. Tod÷l čia apžvelgsime tam tikrų biologinių medžiagų in vivo tyrimus, naudojant besivystančio viščiuko chorioalantojinę membraną, kuri leis pastoviai steb÷ti įsodintos medžiagos pokyčius CAM. Be to tai yra greitas, paprastas ir ekonomiškas būdas. Šiuo tyrimu norima parodyti CAM kaip eksperimentinį modelį, taip pat išryškinti žmogaus auglio ląsteles, pirminius jų formavimosi aspektus, ląstelių sankaupas, kurios formuoja metastaz÷s židinius (Valdes T.I. ir kt., 2011).
Navikas, blastoma (gr. blastos – užuomazga), neoplasma (gr. neoplasma – naujas darinys) – tai pakitusių, neribotai besidauginančių organizmo ląstelių darinys. Naviko atsiradimo priežastis dažnai neaiški. Kartą atsiradęs, jis nesiliauja augęs bei plitęs ir nepriklauso nuo to, ar jį suk÷lusi priežastis dar veikia ar jau neveikia (Stalioraityt÷ E. ir kt., 2001).
Kepenų v÷žys (kepenų ląstelių auglys) tai v÷žys kilęs iš kepenų. Taip pat žinomas, kaip pirminis kepenų v÷žys arba hepatoma. Kepenys (gr. hepar) yra sudarytos iš diferencijuotų ląstelių – hepatocitų. Tai daugiabranduol÷s ląstel÷s, turinčios 6–8 šonus (Vitkus A. ir kt., 2003).Jos sudaro apie 80% kepenų audinio. Tod÷l dažniausiai kepenų v÷žys (daugiau nei 90%–95%) išsivysto iš kepenų ląstelių ir yra vadinamas kepenų ląstelių v÷žiu arba karcinoma. Be to kepenyse yra tulžies latakų, kraujagyslių (venos, arterijos) ir riebalinių ląstelių.
ir l÷tinio hepatito B viruso (HBV) nešiotojų. Globaliniu mastu, HBV yra pagrindinis veiksnys, apie 75%–90%, susijęs su HCK (Palmer Beasley R., 1987). Nepaisant ankstesnių duomenų, pagal pastarųjų 5–8 metų statistiką skirtingose šalyse, HCK paplitimas vis did÷ja (Jordi Bruix J., Sherman M., 2005).
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:
Įvertinti viščiuko embriono chorioalantojin÷s membranos pokyčius, ant jos transplantavus hepatoceliulin÷s karcinomos ląsteles (MH – 22A ląstelių linija).
Darbo uždaviniai:
1. Išryškinti chorioalantojin÷s membranos kraujagyslių lygiųjų raumenų bei aktino turinčias mezenchimos ląsteles.
2. Įvertinti chorioalantojin÷s membranos epitelio pokyčius priklausomai nuo ląstelių transplantavimo būdo.
3. Įvertinti chorioalantojin÷s membranos storio pokyčius priklausomai nuo ląstelių transplantavimo būdo.
4. Literatūros apžvalga
4.1. Chorioalantojin÷s membranos ypatumai ir susidarymas
Eksperimentinis viščiuko embriono modelis žinomas gana seniai. Jau 1913 m. J. B. Murphy eksperimentuose su augliais pirmą kartą panaudojo chorioalantojinę viščiuko embriono membraną (Ribatti D., 2004). Eksperimentams atlikti in vivo viščiuko embrionas pasirinktas neatsitiktinai. D÷l daugyb÷s unikalių privalumų galima steb÷ti auglio ląstelių metastazes, kraujagyslių tinklo tankumą, įvertinti organizmo atsaką. Kadangi viščiuko imunin÷ sistema iki išsiritimo n÷ra pilnai išsivysčiusi, susidaro natūrali imunodeficitin÷ aplinka, kuri leidžia s÷kmingai atlikti tyrimus beveik be atmetimo reakcijos (Deryugina E.I., 2001).
Viščiuko chorioalantojin÷ membrana yra labiausiai nuo centro nutolusi ekstraembrionin÷ membrana, einanti ties neląsteline lukšto membrana. CAM susiformuoja susijungiant vidinei alantojo mezodermai ir somatinei choriono mezodermai. Susijungusi CAM vystosi ir 12 inkubacijos dieną padengia visą vidinę lukšto membraną. Viščiukas normaliai išsirita 21 dieną (Valdes T.I. ir kt., 2011).
Mokslininkai, tiriantys v÷žio procesus, vystymosi biologiją bei oftalmologai apraš÷ viščiuko chorioalantojinę membraną (CAM) kaip modelį studijuojant visas šias sistemas ir bandant išsiaiškinti v÷žio „elgseną“, angiogenezę ir fotodinaminę terapiją (Leng T. ir kt., 2004).
Kadangi viščiuko CAM turi tankų kapiliarų tinklą, ji dažnai naudojama tiriant tiek angiogenezę, tiek antiangiogenezę, stebint atsaką į įvairius veiksnius. Vien 2000–2009 metais apie 700 publikacijų išleista remiantis būtent šiuo modeliu. Dažniausiai yra naudojami Baltieji Leghorn veisl÷s viščiukai. Viščiuko embriono vystymasis trunka 21 dieną iki išsiritimo. Yra keturios ekstraembrionin÷s viščiuko membranos: trynio maišas, amnionas, seroza ir alantojis. Seroza dar kartais vadinama chorionu, tačiau terminas chorionas dažniau vartojamas susiliejusiam alantojui ir serozai apibūdinti. Paukščių alantojis atsiranda apie 3,5 dieną po inkubacijos iš užpakalin÷s endodermos kojyt÷s. 4 dieną viščiuko embrionas yra stumiamas į ekstraembrioninę celomo ertmę. Viščiuko proksimalin÷s dalys guli lygiagrečiai ir truputį kaudaliau trynio maišo. Kai distalin÷ dalis auga, auga ir pats embrionas (Ribatti D., 2010).
Alantojo kraujagyslių tinklas sparčiai plečiasi nuo 4 iki 10 inkubacijos dienos. Šiuo vystymosi etapu alantojo mezodermos sluoksnis susijungia su choriono mezodermos sluoksniu ir suformuoja CAM. Taip susidaro dvigubas mezodermos sluoksnis: iš somatin÷s ir vidurių (visceralin÷s) mezodermos. Šiame dvigubame sluoksnyje vystosi tankus kraujagyslių tinklas, kuris susijungia su embriono kraujo apytaka alantojo arterijomis ir venomis. Nepilnai susiformavusios kraujagysl÷s, kurios neturi pamatin÷s membranos ir lygiųjų raumenų ląstelių, išsid÷sčiusios mezodermoje auga labai greitai iki 8 dienos, sudarydamos tankų kapiliarų tinklą, kuris glaudžiai kontaktuoja su ant jo gulinčiomis choriono epitelin÷mis ląstel÷mis ir tarpininkauja vykdant dujų apykaitą su išorine aplinka.
4.2. Chorioalantojin÷s membranos morfologija
Ketvirtą viščiuko embriono vystymosi dieną visos CAM kraujagysl÷s yra nediferencijuoti kapiliarai. Jų sienel÷s susideda iš vienintelio endotelinių ląstelių sluoksnio, kuriame n÷ra pamatin÷s membranos (Ausprunk ir kt., 1974). Tarp 4 ir 5 dienos CAM smulkiųjų kraujagyslių endotelio ląstel÷s yra storesn÷s, turi kelias plazmin÷s membranos (plazmolemos) pūsleles ir dideles vakuoles (Rizzo ir kt., 1995a).
2 pav. Makroskopin÷ CAM kraujagyslių tinklo nuotrauka po rašalin÷s injekcijos. 14–tą inkubacijos dieną stebimas ypatingai tankus kapiliarų tinklas (Ribatti D., 2008).
1 lentel÷. Viščiuko chorioalantojin÷s membranos (CAM) ir pel÷s modelių trūkumų ir privalumų palyginimas. (Lokman N.O. ir kt., 2012)
In vivo
modelis Privalumai Trūkumai
Trumpas bandomasis laikotarpis (dienos) Trumpas steb÷jimo laikas (dienos) Nebrangus Negalima įvertinti imuninio viščiuko ląstelių
atsako į v÷žio ląsteles Aukštas apvaisinimo indeksas ir medžiagų
pralaidumas Greiti morfologiniai pokyčiai Uždara sistema – terapines medžiagas
leidžia nagrin÷ti mažais kiekiais
Specializuotų antikūnų trūkumas viščiuko audiniams
Natūrali imunodeficitin÷ aplinka Galimyb÷ pritaikyti individualią CAM
daugeliui reakcijų
Didel÷ membranos ekranavimo galimyb÷ Biologija ir fiziologija gerai žinoma
Tinkamumas in vivo vaizdavimui Tiesiogin÷s prieigos buvimas Gyvūnas neturi būti prislopintas CAM
Gali būti naudojama tiriant pirmines žmogaus ląstelių kultūras Ilgesnis steb÷jimo periodas (savait÷s,
m÷nesiai) Ilgas bandomasis laikotarpis (m÷nesiai, metai) Biologija ir fiziologija gerai žinoma, tačiau
ir komplikuota Brangu
Tinkamumas in vivo vaizdavimui Gerai išsivysčiusi imunin÷ sistema Charakterizuota genetin÷ kilm÷ Dauginimasis brangus
Reikalingas didelis gyvūnų kiekis Pel÷
3 pav. Viščiuko pad÷ties kiaušinyje ir CAM schematinis vaizdas. (a) CAM pad÷tis kiaušinyje aplink embrioną (raudona linija) ir 12 inkubacijos dieną netiesioginis kontaktas su lukšto membrana. (b) 10– 12 inkubacijos dienos CAM skersinio pjūvio schema: 1 – choriono epitelis; 2 – mezodermos sluoksnis su joje esančiomis kraujagysl÷mis (raudona), 3 – alantojo epitelis (Vargas A. ir kt., 2007).
Alantojo epitelis, nors ir sudarytas iš plono ląstelių sluoksnio, atskirtas tvirtu barjeru nuo alantojinio sluoksnio. AE yra kaip atrinktinai pralaidus barjeras, įgalinantis elektrolitų ir vandens absorbciją, taip pat atlieka ir gynybinę funkciją prieš įvairias toksines medžiagas, esančias alantojo spindyje. Prieš kelis metus atlikti tyrimai parod÷ alantojo epitelio funkciją reabsorbuojant vandenį iš alantojo skysčio, tai galima traktuoti, kaip lemiamą veiksnį embriono vystymuisi. Inkubacijos metu, alantojo skysčio tūris pastebimai did÷ja iki 12–13 inkubacijos dienos ir tada pradeda staigiai maž÷ti iki viščiuko išsiritimo. Patikimais duomenimis, osmosinis sl÷gis palankus vandens reabsorbcijai gal÷tų būti kontroliuojamas natrio, chloridų selektyviu pasišalinimu iš alantojo skysčio, kai tuo tarpu kalcio, kalio, fosforo bei šlapimo rūgšties, ur÷jos ir kitų azotinių šalinamų junginių koncentracija padid÷jusi (Gabrielli G.M. ir kt., 2010).
Chorioalantojin÷s membranos tinkamumas auglių angiogenez÷s tyrimams yra susijęs su besivystančio viščiuko imunine sistema, nes tuo metu, kuomet yra atliekamas eksperimentas, viščiuko imunin÷ sistema n÷ra pilnai išsivysčiusi ir atmetimo reakcija dar n÷ra pakankama (Leene ir kt.,1973). Paukščiams imunin÷ sistema susiformuoja prieš pat išsiritimą (Weber, Mausner, 1977). Kaip ir kiti stuburiniai, viščiukai yra apsaugoti dviguba imunine sistema, susidedančia iš B ir T limfocitų, kontroliuojančių antikūnių ir ląstelių mediatorių imuninį atsaką atitinkama tvarka. B limfocitai diferencijuojasi Fabricijaus bursoje (kloakos maišelyje) – organe, atitinkančiame žinduolių kaulų čiulpus, o T limfocitai diferencijuojasi užkrūčio liaukoje (čiobrialiauk÷je) (Funk, Thompson, 1996; Davidson, 2003). Iki 10 inkubacijos dienos viščiuko embriono imunin÷ sistema n÷ra pilnai išsivysčiusi. T limfocitai pirmą kartą gali būti aptinkami 11 inkubacijos dieną, B limfocitai – 12 inkubacijos dieną. 12 inkubacijos dieną, vienbranduoliai fagocitai yra randami trynio maiše, blužnyje, bursoje, žarnyne, virškinimo trakte ir kepenyse (Janse, Jeurissen, 1991).
4.3. Hepatoceliulin÷ karcinoma
Kepenų v÷žys arba piktybiniai kepenų navikai gali būti tiek pirminiai – kitaip tariant, tiesiog kaip kepenų v÷žys arba navikas kilęs iš kepenų, t.y. metastazinis, kai v÷žys prasideda ne kepenyse, o kitame organe ir pradeda plisti (metastazuoti). Pirminio kepenų v÷žio yra du tipai. Pirmasis ir dažniau pasitaikantis yra kepenų hepatoceliulin÷ karcinoma (HCK).
HCK, labiausiai paplitusi kepenų v÷žio forma, ypač Azijoje ir Afrikoje (Anderson ir kt., 1992; Okuda ir kt., 1992). HCK apibūdinama kaip išplitusi karcinomos ląstelių infiltracija su galimomis metastaz÷mis. Nors gydomosios terapijos yra pažengę, tačiau didžiausias mirčių skaičius priklauso nuo metastazių paplitimo. Skirtingi v÷žio tyrimo metodai išaiškina skirtingus plitimo mechanizmus. N÷ra idealaus modelio, kiekvienas jų turi savo privalumų ir trūkumų. Idealaus modelio nebuvimas lieka viena iš pagrindinių s÷kmingo v÷žio gydymo kliūčių.
besivystančio biomechanizmo, tai yra naudojant viščiuko CAM kaip modelį in vivo (Tian J. ir kt., 1999).
HCK taip pat dažnai registruojama Kinijoje. Viena iš pagrindinių priežasčių lieka Hepatito B viruso sukeliama infekcija. Pacientai dažniausiai miršta nuo metastazin÷s formos ir HCK atsiradimo. Tod÷l tobulinami ląstelių kultūrų mechanizmai, kurie pad÷tų geriau suprasti naviko vystymosi ypatumus ir progresavimą. Kaip teigia Park (1990) ir Hambly (1997), d÷l tam tikrų techninių priežasčių tai yra sunku įvykdyti ir siekia mažiau nei 2% s÷kmingų tyrimų, ypač tų ląstelių kultūrų, kurios paimtos iš metastazinių vietų (Tian J. ir kt., 1999).
4.4. Naviko morfologinis tyrimas ir diagnostika
4.5. Chorioalantojin÷s membranos panaudojimas navikų tyrimams
Pastaruoju metu ieškomi vis inovatyvesni būdai tiriant šiuos navikų sukeliamus pažeidimus, vienas iš jų, kaip taikinį panaudojant netransformuotas, mažiau atsparias, auglio endotelio ląsteles (Semela D., Dufour J.F., 2004). Buvo manoma, kad nereguliuojama angiogenez÷ yra vienas iš esminių faktorių nulemiančių auglio augimą. Kai standžios konsistencijos auglys, apie 1-2 mm diametro, yra užsodinamas ant CAM, jis gali augti ir plisti be jokios intensyvios kraujotakos, imant maisto medžiagas tiesiog difuzijos būdu. Jei auglys yra didesnis nei 1-2 mm diametro, angiogenez÷ neabejotinai pasireikš. Angiogenez÷ taip pat neatsiejamas veiksnys, reikalingas vystantis metastaz÷m. Nesubrendusio auglio mikro kraujagyslių formavimasis suteikia tam tikrą kelią, per kurį auglio ląstel÷s skverbiasi į bendrą kraujotaką. Be to, auglio angiogenez÷, kuri histologiškai apibūdinama kaip mikro kraujagyslių tankumas, parodo tam tikra prognoze lydinčią koreliaciją keliuose žmogaus auglio tipuose, įskaitant odos melanoma, krūtų, plaučių, prostatos ir kiaušidžių v÷žį (Kimura H. ir kt., 1998). Deli teigia, kad augant kraujagysl÷ms angiogenez÷ tampa patologin÷s kilm÷s ir sustiprina daugelio neoplastinių ir ne-neoplastinių susirgimų riziką. Endotelio kraujagyslių augimo faktorius yra mitogeniškai specifinis endotelin÷ms kraujagyslių ląstel÷ms ir gali tiesiogiai stimuliuoti naujų kraujagyslių augimą (Deli G. ir kt., 2005). VEGF, tai glikoproteinas, kuris gali susijungti su heparinu, sąlyginai yra apie 34 000-46 000 molekulinio svorio ir yra vienas iš potencialiausių angiogenezę įtakojančių faktorių. Dauguma navikinių ląstelių gali pačios sekretuoti VEGF, kuris dažniausiai ir įtakoja angiogenezę naviko audiniuose, padidina kraujagyslių pralaidumą, gelbsti pereinant piktybin÷ms ląstel÷ms į kraujotaką ir palengvina invaziją bei navikinių ląstelių metastazavimą (Yao D.F. ir kt., 2005).
VEGF atsakingas už beveik visus patologinius vyksmus, kuriuose aptinkama angiogenez÷, įtraukiant hepatoceliulinę karcinomą ir l÷tinį hepatitą, taip sudaroma galimyb÷ tirti angiogenezę blokuojančią terapiją (Medina J. ir kt., 2005). Hagedorn ir kiti 2005 metais nustat÷, kad blokuojant VEGF receptorius naudojant tirozino kinaz÷s inhibitorius, naviko vystymasis slopinamas. Tarpusavio ryšio tarp angiogenez÷s ir hepatoceliulin÷s karcinogenez÷s išryškinimui, HCK progresui nustatyti, kiekybiniam angiogenez÷s įvertinimui naudojama imunohistochemija. Papildomas būdas nustatyti HCK prognozę yra būtent molekulinių žymenų analiz÷. Taigi, galiausiai naviko proliferacijos
2 lentel÷. Viščiuko vystymosi stadijos iki išsiritimo Dienos Vystymasis
1 Pradeda formuotis audiniai
2 Ryškus audinių formavimasis, pirmųjų kraujagyslių atsiradimas 3 Pradeda plakti širdis, kraujagysl÷s jau gerai matomos
4 Akies pigmentacija
5 Alkūnių ir kelių formavimasis
6 Snapo formavimasis, atsiranda valingi judesiai
7 Skiauter÷s formavimasis, snapo išaugos formavimasis, kuris v÷liau padeda prasikalti pro kiaušinį.
8 Matyti plunksnų ruoželiai
9 Atsiranda burna, panaš÷ja į paukštį
10 Snapo išauga gerai išreikšta, formuojasi pirštai ir nagai
11 Skiauter÷ tampa pjūkliška –dantyta, aiškiai matoma uodegos ir plunksnų užuomazgos 12 Pirštai gerai išsivystę, pirmosios matomos plunksnos.
13 Kūnas švelniai padengtas plunksnų
14 Embriono galva sukasi į didesnio kiaušinio kampo pusę 15 Žarnos nuslinkusios į pilvo ertmę
16 Plunksnos pilnai uždengia visą kūną
17 Sumaž÷ja amnioninio skysčio, galva tarp kojų
18 Trynio maišas vis dar embriono išor÷je, galva yra po dešiniuoju sparnu
19 Trynio maišas nuslenka į kūno ertmę, amnioninio skysčio neb÷ra, embrionas užima beveik visą kaiušinio ertmę, išskyrus oro tarpą
20 Trynio maišas visiškai nuslenka į kūno ertmę, embrionas tampa viščiuku ir jau kv÷puoja oro tarpo oru
http://www.cobb-vantress.com/contactus/brochures/Hatchery_Guide_2008.pdf. Prieiga per
5. Tyrimo metodika
Tyrimas buvo atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto medicinos akademijos histologijos ir embriologijos katedroje 2011–2013 metais.
5.1. Apvaisintų kiaušinių inkubavimas
5.2. Langelių atidarymas, pasiruošimas sodinti medžiagą
5.3. Kepenų karcinomos ląstelių linijos transplantavimas
9 inkubavimo parą atsargiai nuimama pl÷vel÷ nuo lukšto ir pro matomą langelį mikropipete užlašinama 100 µl žinomos kepenų karcinomos ląstelių linijos suspensija. 7 tiriamiems viščiukams pro langelį buvo įd÷ti įd÷klai su pusiau pralaidžia membrana ant kurios užlašinama ląstelių kultūra. Iš 7 viščiukų iki membranos pa÷mimo išgyveno 5: 3 viščiukai 12 parų, 1 – 14 parų, 1 – 13 parų. Kepenų karcinomos ląstelių linija buvo kultivuojama in vitro sąlygomis Vytauto Didžiojo Universiteto Biologijos katedros biofizikinių tyrimų laboratorijoje. Ši ląstelių linija gauta iš pelių solidin÷s hepatomos 22A formos, galiausiai žymima MH-22A. Šios ląstel÷s skirtos tiek in vitro, tiek in vivo atliekamiems tyrimams. Atliekant tyrimus in vivo ląstel÷s transplantuojamos į C3HA linijos peles, kurioms v÷liau susiformuoja transplantuojami augliai, taip pat ši ląstelių linija buvo naudojama šio tyrimo metu, transplantuojant jas ant viščiuko chorioalantojin÷s membranos. Tam, kad sudaryti sąlygas hepatomos ląstelių linijos augimui, palaikoma 37oC dr÷gm÷ ir 5% CO2 prisotinta aplinka, tinkamai pH
pusiausvyrai. 1,5 mililitruose mitybin÷s terp÷s buvo 8,5x106 tiriamųjų ląstelių. 100µl hepatomos ląstelių kultūros yra 566,666 ląstelių, t.y. toks kiekis, kuris buvo suleistas į įd÷klą, kuris v÷liau perkeltas ant viščiuko chorioalantojin÷s membranos.
4 pav. Vaizdas iš viršaus. Apvaisintas kiaušinis su matomu 3 dienų embrionu, matyti tankus kraujagyslių tinklas, plakanti širdis (a). 13-14 dienų embrionas su gerai išreikštu kraujagyslių tinklu, matyti akys ir galūn÷s, beveik visas kūnas padengtas plunksnomis, HCK ląstelių sankaupos parodytos rodykl÷mis, o pati membrana d÷l dalinio išsaus÷jimo stipriai prisitvirtinusi prie lukšto (b).
Platus CAM kraujagyslių tinklas užtikrina transplantuojamų naviko ląstelių gyvybingumą (Armstrong ir kt., 1982; Murphy, 1913; Ossowski, Reich, 1980). Ribatti pasteb÷jo, kad angiogeninis atsakas prasideda jau po 72–96 valandų po transplantacijos, taip sukeliant padid÷jusį kraujagyslių tankumą aplink implantą, tuo metu kraujagysl÷s telkiasi ratu centro link (Ribatti D., 2010).
5 pav. Įd÷klas su 3,0 µm poras turinčia pusiau pralaidžia membrana. Toks įd÷klas uždedamas ant CAM pro kiaušinyje padarytą langelį į kurį sulašinama tam tikras kiekis ląstelių kultūros. Įd÷klas dažniausiai naudojamas: ląstelių pritraukimui, augimui ir daugyb÷s ląstelių diferenciacijai. Įd÷klo
filtravimo diametras 24 mm, filtravimo laukas - 4,5 cm2.
De Fouw ir kiti 1989 metais tyrin÷jant chorioalantojin÷s membranos morfometrinius parametrus nustat÷, kad 6 vystymosi parą CAM paviršiaus plotas siekia 6 cm2, tuo tarpu 14 vystymosi parą chorioalantojin÷s membranos paviršiaus plotas siekia net 65 cm2. Šio vystymosi periodo eigoje išauga maitinančių kraujagyslių skaičius, daugiausiai d÷l chorioalantojin÷s membranos augimo ir vystymosi pokyčių po 10 paros. Taip pat Rizzo ir De Fouw 1993 metais teigia, kad endotelin÷s ląstel÷s suplon÷ja apie 50% tarp 10 ir 14 inkubacijos paros (Ribatti D., 2001).
Hepatoceliulin÷s karcinomos ląstelių kultūros ant CAM transplantuotos dviem būdais: - Naudojant insertą ir į jį sulašinant 100µl hepatomų ląstelių suspensijos;
- Laisvai įšvirkščiant 100µl tiesiai pro langelį ant CAM.
5.4. Dažymas hematoksilinu ir eozinu
Dažyti m÷giniai uždengiami dengiamaisiais stikleliais, naudojant dengiamąją terpę (Laurinavičien÷ A., 2008).
Histologiniai preparatai buvo vertinami histologiškai. Morfometriniai CAM ir choriono epitelio storio pokyčių matavimai buvo atlikti naudojant skaitmeninę OLYMPUS mikroskopo (Olympus XC30) kamerą ir CellSense Dimensions kompiuterinę programą.
5.5. Imunohistocheminis dažymas
Imunohistochemija (kartais dar vadinama imunocitochemija) – tai tyrimo metodas, kuriame naudojamos chromogenin÷s medžiagos, jos nuspalvina antigeno-antikūno sąveikos vietą, įvykus joje cheminei reakcijai. Šis metodas leidžia gana patikimai nustatyti piktybinių ir kitų ląstelių kilmę, v÷žio diagnostinius ir prognostinius žymenis. (Laurinavičien÷ A., 2008) Imunohistocheminio dažymo tikslas yra išryškinti audinio antigenus, šiuo atveju hepatoceliulin÷s karcinomos, naudojant DAKO REAL EnVision (Peroksidaz÷/DAB, triušis/pel÷) vizualizacijos rinkinį. Dažymo rinkinį sudaro detekcijos reagentas bei chromogeno substratas, specialiai sukurti imunohistocheminiam dažymui. Detekcijos reagentas – tai peroksidaze žym÷tas dekstranas, sujungtas su ožkos antikūnais prieš pel÷s ir triušio imunoglobulinus. Diaminobenzidinas (DAB) naudojamas kaip chromogenas (Procedurų vadovas 2006, kardialin÷s patologijos laboratorija). Chorioalantojin÷ membrana (CAM) su tiriamaja medžiaga, kaip ir prieš HE dažymo metodą, taip ir prieš IHC dažymą, fiksuojama 4% formalino tirpale. Įlieta į parafiną medžiaga atšaldoma ir yra jau paruošta pjauti, 3 µm storio pjūviai gali būti užd÷ti tiek ant silanizuotų, tiek ant Super Frost Plus objektinių stiklelių. Taip pat gali būti naudojami SuperFrost® Plus Gold bei Polysine® stikliukų (ROTH Catalogue, 2009). Paruošti stikleliai laikomi per naktį 37oC termostate, prieš dažant laikomi 2 val. 60 oC termostate, kad medžiaga geriau prisitvirtintų prie stikliukų. Deparafinavimui naudojami tokie patys reagentai, kaip ir HE dažymo metu, tik vietoj 3, 96% alkoholio, talpų yra naudojama 4 – 2 talpos 96% alkoholio tirpalo ir dar 2 - 100% bevandenio izopropilo alkoholio. Reagentai yra specifiniai:
1. Ksilenas, izopropanolis, etanolis – 96%
- ENV – dekstrano, sujungto su peroksidaz÷s molekulin÷mis ir ožkos antrinio antikūno molekulin÷mis prieš triušio ir pel÷s imunoglobulinus, buferinis tirpalas (Real EnVision/HRP, Rabbit/Mouse),
- Substrato buferis - DAB+chromogenas
- Epitopo (antigeno dalies reaguojančios su antikūnu) išlaisvinimo tirpalai - Citratinis buferis, pH 6,0
- Peroksidaz÷s blokavimo tirpalas, parengtas vartojimui - Antikūnų skiediklis, parengtas vartojimui
- 37 mM amonio vanduo - Mejerio hematoksilinas - Dengiamoji medžiaga - Distiliuotas vanduo
- Distiliuotas vanduo 1 min. - Mejerio hematoksilinas 5 min. - Tekantis krano vanduo 1 min. - 37 mM amonio vanduo 30 s. - Tekantis krano vanduo 2 min. - 96 % etilo alkoholis (2x) 2 min. - Ksilenas (2x) 5min.
Ištraukus iš ksileno pjūviai iš karto dengiami dengiamaisiais stikleliais. Palaukus kol nudžius galima mikroskopuoti (Procedūrų vadovas, 2006). Kimura ir kiti 1998 metais atlikto tyrimus remiantis CD34 imunohistochemija ir nustat÷, kad angiogenez÷, kiekybiniais aspektais, nesuteikia aiškios informacijos, pagal kurią būtų galima prognozuoti HCK, tačiau diagnostiniu atžvilgiu galima būtų atskirti HCK nuo ne-HCK (Kimura H. ir kt., 1998).
5.6. CAM dažymui naudojami pirminiai antikūnai
Imunohistochemin÷ms reakcijom buvo naudojami 2 pagrindiniai antikūnai:
Pirminis antikūnas Žym÷jimo
kodas Klonas
Teigiamos kontrol÷s
audinys Pel÷s monokloninis antikūnas prieš žmogaus α
lygiųjų raumenų aktiną SMA α (N) αsm-1 Plonosios žarnos
Pel÷s monokloninis antikūnas prieš žmogaus
antigeną VEGF VG1 Migdolin÷s ir seilių liaukos, inkstai, endometriumas, kasa, gaubtin÷ žarna.
- Pel÷s monokloninis antikūnas prieš žmogaus antigeną
Šis antikūnas žymi VEGF-121, VEGF-165 ir VEGF-189 (vascular endothelial growth factor) kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus izoformas. Dar gali būti vadinamas kaip kraujagyslių pralaidumo faktorius.
- Pel÷s monokloninis antikūnas prieš žmogaus α lygiųjų raumenų aktiną
6. Tyrimų rezultatai
6.1. Histologinis ir imunohistocheminis tyrimas
Chorioalantojin÷s membranos struktūra kontrolin÷je grup÷je 12 inkubacijos parą parodyta 8 pav. Chorioalantojin÷s membranos reakcija į transplantuotą hepatoceliulin÷s karcinomos ląstelių kultūrą parodyta 9 pav. Matomas chorioalantojin÷s membranos epitelio bei mezenchiminio sluoksnio sustor÷jimas.
9 pav. CAM nuotrauka po hepatoceliulin÷s karcinomos ląstelių užsodinimo. Matyti visų membranos sluoksnių struktūra; sustor÷jęs choriono epitelis (ce), stipriai sustor÷jusi ir išveš÷jusi mezoderma (m), alantojo epitelis (ae) ir kraujagysl÷s (k). Dažyta hematoksilinu-eozinu, padidinimas 4x; mastelis: 200 µm, 12 inkubacijos diena. CAM išimta be lukšto membranos.
12 pav. matoma reakcija į α SMA. Gauta ryški pozityvi reakcija stambesnių kraujagyslių sienel÷je, kur yra nusidažiusios lygiųjų raumenų ląstel÷s. Taip pat stebima intensyvi teigiama reakcija sluoksnyje po choriono epiteliu. Šiame sluoksnyje yra gausus kapiliarų tinklas, ir teigiama reakcija stebima pericituose, turinčiuose aktino filamentų.
12 pav. αSMA(N) reakcija į kraujagyslių endotelį. Makroskopin÷ tiriamosios CAM (su insertu) nuotrauka 12 inkubacijos dieną. Matoma ryški kraujagyslių reakcija. Dažyta hematoksilinu-eozinu ir imunohistochemiškai αSMA(N) antikūniu. Originalus padidinimas 40x; mastelis: 20 µm.
6.2. Morfometrinis tyrimas
13 ir 14 paveiksluose pavaizduotas skirtumas CAM ant kurios buvo d÷tas insertas su HCK ląstel÷mis ir CAM su tiesiog užlašinta ir tolygiai pasiskleidusia HCK ląstelių suspensija.
3 lentel÷je pateikiami bendri kontrolin÷s ir tiriamosios grupių duomenys. Kontrolin÷s grup÷s tarpusavyje skiriasi nedaug priklausomai nuo inkubacijos trukm÷s. CAM storis did÷ja tolygiai nuo 12 iki 14 paros. Tuo tarpu 12 paros CAM su hepatomos ląstelių kultūra yra storiausia palyginus su 13 ir 14 paros tiriamosiosmis grup÷mis (p>0,05). Atlikto tyrimo metu galima buvo daryti prielaidą, kad 12 paros tiriamoji CAM, palyginus su v÷lesn÷s inkubacijos, stipriai sustor÷jusi d÷l tebeesančių maisto medžiagų kiaušinyje, o 13 ir 14 parą viščiukų embriono CAM pradeda trūkti maisto medžiagų ir ji plon÷ja, d÷l poreikio patenkinti fiziologines reikmes bei palaikyti hepatoceliulinių ląstelių augimą. Galiausiai embriono raidos ypatybių įtakojama membrana išdžiūsta, o navikin÷s ląstel÷s netenka mitybos (Balčiūnien÷ N. ir kt., 2009).
3 lentel÷. CAM kontrolin÷s grup÷s ir CAM su hepatomų ląstelių kultūra priklausomyb÷ nuo paros.
4 lentel÷. 14 paros kontrolin÷s ir tiriamosios grup÷s palyginimas pagal CAM storį.
5 lentel÷. 14 paros kontrolin÷s ir tiriamosios grup÷s palyginimas pagal CAM epitelio storį.
4 ir 5 lentel÷se pateikti duomenys rodo 14 paros CAM membranos ir epitelio storį, priklausomai nuo tiriamosios medžiagos transplantavimo būdo. Grafikuose matoma, kad membrana, ant kurios buvo d÷tas įd÷klas sureagavo stipriau (4 lentel÷). Taigi kontrolin÷s grup÷s duomenys nuo tiriamosios grup÷s, šiuo atveju transplantavus ląsteles su įd÷klu, patikimai skiriasi. Kontrolin÷s grup÷s ir transplantuotų ląstelių be įd÷klo CAM storio pokyčiai n÷ra reikšmingi. (p>0,05). CAM epitelio storis transplantavus ląsteles su įd÷klu, patikimai skiriasi ir nuo kontrolin÷s ir nuo grup÷s, kur ląstel÷s buvo transplantuotos be įd÷klo. Gabrielli Italijoje atliko tyrimą, parodantį CAM epitelio geb÷jimą kaupti kalcio jonus ir pernešti į embrioninę cirkuliaciją, taigi CAM epitelis yra pirminis ląstelių barjeras prieš joms patenkant į embrioną (Gabrielli M.G., 2010). Tod÷l mūsų atliktame tyrime galime teigti, kad užsodintos hepatomos ląstel÷s (ląstelių kultūra) pirmiausia sureagavo su CAM epiteliu ir suk÷l÷ staigią reakciją.
7 lentel÷. 14 paros CAM kontrolin÷s ir tiriamosios grup÷s centrin÷s bei periferin÷s dalies palyginimas.
7. Aptarimas
Viščiuko chorioalantojin÷ membrana mūsų atliktiems tyrimams buvo pasirinkta d÷l daugelio veiksnių. Lyginant su žinduoliais, CAM modelio neįtakoja motininiai faktoriai, be to imunin÷ sistema susiformuoja tik likus kelioms dienoms iki išsiritimo. Žinoma, kad pradin÷s kraujagysl÷s formuojasi iki 8 dienos, o vaskuliarizacija paskutinį etapą pasiekia 18 inkubacijos dieną, prieš pat išsiritimą. Šiuose tyrimuose naudojome CAM, kaip modelį, kad išsiaiškinti vystymosi ypatumus iki 15 dienos, bei nustatyti kokią įtaką CAM ir CAM epiteliui tur÷jo užsodintos hepatomos ląstelių kultūros.
Savo tyrime mes naudojome du monokloninius antikūnius su tikslu identifikuoti naujai susidarančias kraujagysles chorioalantojin÷je membranoje. Žinoma, kad navikinis augimas provokuoja neoangiogenezę, ir pritaikius efektyvų kraujagyslių išryškinimo būdą, galima jas vertinti kiekybiškai (skaičiuoti), taip pat vertinti jų kiekio pokyčius priklausomai nuo naviko rūšies, daryti išvadas apie naviko piktybiškumą ir tirti įvairių vaistų poveikį neoangiogenezei.
αSMA identifikuoja ląstelių citoskeleto filamentą aktiną. Jo gausu kraujagyslių sienelių lygiųjų raumenų ląstel÷se, taip pat kai kuriose mezenchimos ląstel÷se, kurios yra pericitų pirmtakai.
VEGF yra kraujagyslių endotelio augimo faktorius, kuris yra gaminamas organizmo ląstelių ir audinių. Jin-No ir kiti teigia, kad VEGF tai angiogeninis faktorius, kuris stimuliuoja endotelio ląstelių proliferaciją ir migraciją. Angiogenez÷ sukeliama kai VEGF susijungia su receptoriais flk-1 (tirozino kinaz÷) ir flt-1, kurie yra išskirti endotelio. Įrodyta, kad kraujagyslių endotelio augimo faktorius yra kone pagrindinis ir fiziologin÷s, ir patologin÷s angiogenez÷s reguliatorius. VEGF sintezuojamas tiek auglio, tiek normalių ląstelių. Priešingai daugeliui kitų augimo faktorių VEGF reaguoja specifiškai tik su endotelio ląstel÷mis. Ribatti teigia, kad svarbiausia tinkama CAM kapiliarų tinklo analiz÷, nes yra sunku atskirti jau egzistuojančius kapiliarus nuo naujai susidariusių (Ribatti D., 2006).
darant pjūvius nebuvo žinoma į kurį lauką pateks navikin÷s ląstel÷s. Tačiau diagnostiniu požiuriu yra duomenų, kad bet kokia ryški VEGF reakcija byloja apie abejotiną prognozę
(http://products.invitrogen.com/ivgn/product/PMG0113) Prieiga per internetą 2013 01 15.
Mes savo darbe gavome ryškią teigiamą αSMA reakciją, kuri buvo lokalizuota kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstel÷se, ir matomai pericituose. Akivaizdu, kad pagal šios reakcijos intensyvumą, galima spręsti apie viščiuko embriono chorioalantojin÷s membranos vaskuliarizaciją. Tiriant kontrolin÷s grup÷s chorioalantojinę membraną (CAM), mat÷si ryški kraujagyslių lygiųjų raumenų reakcija.
Palyginimui atlikome reakciją su VEGF (vascular endothelial growth factor) antikūnu, kurį manoma išskiria pačios naviko ląstel÷s (Yao D.F. ir kt., 2005). Reakcija buvo teigiama. Bandymas su VEGF nebuvo toks akivaizdus, nepavyko išvengti dažymo fono, nors reakcija taip pat buvo intensyvesn÷ prie choriono epitelio. Mūsų panaudoto monokloninio VEGF antikūno anotacijoje nebuvo pažym÷tas jo specifiškumas viščiuko kraujagyslių endoteliui. Gali būti, kad reikia ieškoti kitų eksperimento sąlygų (keisti tirpalų pH ar pan.).
Savo tyrime mes nustat÷me, kad membrana sureagavo stipriau, panaudojus ląstelių transplantaciją įd÷kle. Tai dar kartą patvirtina šio modelio tinkamumą viščiuko embriono chorioalantojin÷s membranos ir navikinių ląstelių sąveikai tirti. Transplantavus ląsteles įd÷kle, vienoje ribotoje vietoje buvo didel÷ navikinių ląstelių koncentracija ir šios ląstel÷s iššauk÷ stiprią membranos reakciją. Membranos reakcija buvo silpnesn÷, kai ląstel÷s buvo transplantuotos be įd÷klo. Šiuo atveju navikin÷s ląstel÷s difuziškai pasklido membranos paviršiuje, ir d÷l to reakcija buvo silpnesn÷.
Tyrimai parod÷, kad 12 paros CAM yra vystymosi pike (tiek kontrolin÷s grup÷s, tiek tiriamosios) nes gauna daugiausiai maisto medžiagų, kurių užtenka tiek fiziologin÷m reikm÷m aprūpinti, tiek naviko augimui palaikyti. Tačiau art÷jant link 14 inkubacijos paros (13,14 diena) maisto medžiagų nebeužtenka ir membrana pradeda džiūti, taip sukeldama ir naviko nykimą. Tai, kad 12 paros CAM vystymasis ir angiogenez÷ yra geriausiai išreikšta parodo ir kiti tyrimai atlikti LSMU histologijos ir embriologijos katedroje, pažymima, kad 12 paros kontrolin÷ CAM angiogenez÷ išreikšta geriausiai. 2006 metais Ribatti atlikti tyrimai vertinant CAM angiogenezę ant 8 parų chorioalantojin÷s membranos sodinant želatininę kempinę su kraujagyslių augimą stimuliuojančiomis medžiagomis. 12 parą buvo skaičiuojamos naujai susidarančios kraujagysl÷s, augančios statmenai kempin÷s ir aplink ją, kurioje prieš tai egzistavusių kraujagyslių nebuvo (Ribatti D. ir kt., 2006a). Lietuvoje ir Vokietijoje atlikti tyrimai su viščiukų CAM įrod÷, kad kiti piktybiniai navikai, tokie kaip smegenų glioblastoma, užsodinta ant CAM į ją įauga tik minimaliai, o chorioalantojin÷s membranos kraujagysl÷s į naviką neįsiskverbia, tod÷l ir viščiukų eritrocitų jame nebuvo rasta (Balčiūnien÷ N. ir kt., 2009). Tame pačiame tyrime taip pat buvo parodyta intensyvi chorioalantojin÷s membranos reakcija į transplantą.
8. Išvados
1. Imunohistocheminis tyrimas, panaudojant αSMA antikūną, išryškino chorioalantojin÷s membranos susiformavusias kraujagysles bei mezenchimos ląsteles, turinčias aktino citoplazmoje. Naudojant VEGF antikūną, reakcija nebuvo tokia akivaizdi.
2. CAM epitelis reagavo į transplantuotas hepatoceliulin÷s karcinomos ląsteles sustor÷jimu. Padid÷jo epitelinių ląstelių sluoksnių skaičius. CAM epitelio reakciją į transplantuotas ląsteles įd÷kle buvo stipresn÷ nei transplantavus ląsteles be įd÷klo.
3. Chorioalantojin÷ membrana taip pat reagavo į transplantuotas hepatoceliulin÷s karcinomos ląsteles sustor÷jimu. Vertinant chorioalantojin÷s membranos centrinę ir periferinę dalis, pasteb÷tas žymus membranos sustor÷jimas centrin÷je dalyje. Membranos sustor÷jimas centrin÷je dalyje buvo labiau išreikštas po įd÷klu.
9. Pad÷kos
Nuoširdžiai d÷koju Prof. Angelijai Valančiūtei - Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos Akademijos, Histologijos ir Embriologijos katedros ved÷jai, už galimybę atlikti tyrimus, taip pat Dr. Sonatai Šalomskaitei ir Doc. Dr. Ingridai Balnytei, bei asistentei Ramintai Mozūraitei už pagalbą, renkant medžiagą reikalingą tyrimams atlikti.
10. Literatūros sąrašas
1. Balčiūnien÷ N., Tamašauskas A., Valančiūt÷ A., Deltuva V., Vaitiekaitis G., Gudinavičien÷ I., Weis J., Dietrich Graf von Keyserlingk. Histology of human glioblastoma transplanted on chicken chorioallantoic membrane. Medicina (Kaunas). 2009. Vol. 45, No 2, 123-131.
2. Beasley R.P. The Major Etiology of Hepatocellular Carcinoma. 1987. No. 10, P. 1942-1956. Bio 314. Biologinių tyrimų metodologija. Darbo ląstelių kultūrų laboratorijoje pagrindai. Kaunas. 2004-2006. P. 2.
3. Bruix J., Sherman M. Management of Hepatocellular Carcinoma. AASLD Practise Guideline. Hepatology. 2005. Vol. 42, No.5, P. 1208-1236.
4. Cimpean A.M., Ribatti D., Raica M. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model to study tumor metastasis. 2008. Vol. 11, P. 311-319.
5. Deng-Fu Y., Xin-Hua W., Yong Z., Gong-Sheng S., Zhi-Zhen D., Deng-Bing Y., Wei Wu, Li-Wei Q., Xian-Yong M. Quantitative analysis of vascular endothelial growth factor, microvascular density and their clinicopathologic features in human hepatocellular carcinoma. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 2005. Vol. 4, P. 220-226.
6. Deruygina I.E., Quigley P. J. Chick embryo chorioallantoic membrane model system to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochem Cell Biol. 2008. Vol. 130, P. 1119-1130. 7. Gabrielli M.G., Accili D. The Chick Chorioallantoic Membrane: A Model of Molecular,
Structural and Functional Adaptation to Transepitheliai Ion Transport and Barrier Function during Embryonic Development. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010. P. 1-12. 8. Geertu D., Can-Hao J., Rong M., Song Y., Yue L., De C., Makuuchi M. Immunohistochemical
assessment of angiogenesis in hepatocellular carcinoma and surrounding cirrhotic liver tissues. World Journal of Gastroenterology. 2005. P. 960-963.
9. Hagedorn M., Balke M., Schmidt A., Bloch W., Kurz H., Javerzat S., Benoı ˆt Rousseau., Wilting J., Bikfalvi A. Developmental Dynamics. 2004. P. 23-33.
11. Kimura H., Nakajima T., Kagawa K., Deguchi T., Kakusui M., Katagishi T., Okanoue T., Kashima K., Ashihara T. Angiogenesis in hepatocellular carcinoma as evaluated bv CD 34 immunohis tochemistry. Liver. 1998. Vol. 18, P. 14-19.
12. Kuzmien÷ A., Šalomskait÷-Davalgien÷ S., Balnyt÷ I., Palubinskien÷ J., Valančiūt÷ A., Ulozas V. Evaluation of the chicken embryo chorioallantoic membrane model for laryngeal tumor transplantation. 2011. P. 229-240.
13. Leng T., M. Miller J., V. Bilbao K., Palanker V. D., Blumenkranz MS., The chick chorioallantoic membrane as a model tissue for surgical retinal research and stimulation. Department of Ophthalmology, Stanford University School of Medicine. 2004. Vol. 24, P. 427-434.
14. Laurinavičien÷ A., Smaliukien÷ R. Histologinių technologijų vadovas. Vilnius. 2007. P. 56-60. 15. Medina J.†., Sanz-Cameno P.†, Garcı´a-Buey L., Martı´n-Vı´lchez S., Lo´pez-Cabrera M., Moreno-Otero R. Evidence of angiogenesis in primary biliary cirrhosis: an immunohistochemical descriptive study. Journal of Hepatology. 2005. 8 P. 124-131.
16. Noor A. Lokman., Alison S. F. Elder., Ricciardelli C., K. Oehler M. Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Study the Effect of Newly Identified Molecules on Ovarian Cancer Invasion and Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 2012. Vol. 13, P. 9959-9970.
17. Procedūrų vadovas. Kardialin÷s patologijos laboratorija. Kaunas. 2006. P. 85-88.
18. Saftoiu A., Ciurea T., Georgescu C., Banita M., Comanescu V., Rogoveanu I., Gorunescu F., Georgescu I. Immunohistochemical assessmentof proliferating cell nuclear antigen in primary hepatocellular carcinoma and dysplastic nodules. 2003. J.Cell. Mol. Med. Vol. 7, P. 436-446. 19. Semela D., Dufour J., Angiogenesis and hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology.
2004. Vol. 41., P.864-880.
20. Stalioraityt÷ E. Patologin÷ anatomija. Kaunas. 2001. P. 160-165.
21. Tian J., Tang ZY., Ye.Se, YK L., ZY Lin., Chen J., Q Xue. New human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line with highly metastatic potential (MHCC97) and its expressions of the factors associated with metastasis. British Journal of Cancer. 1999. Vol. 81(5), P. 814-821. 22. Ribatti D., The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study Of Angiogenesis and
Metastasis. Italy. 2010. 89 p.
1Department of Human Anatomy and Histology, University of Bari Medical School. 2001. Vol. 264, P. 317-324.
24. Valdes T.I., Kreutzer D., Moussy F. The chick chorioallantoic membrane as a novel in vivo model for the testing of biomaterials. Center for Biomaterials, University of Connecticut Health Center. 2001. P. 273-284.
25. Vargas A., Zeisser-Labouèbe M., Lange N., Gurny R., Delie F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 2007. Vol. 59, P. 1162–1176.
26. Vitkus A., Baltrušaitis K., Valančiūt÷ A., Vitkus A., Žukien÷ J. Žmogaus histologija. Kaunas. 2003. 355 p.
27. Hatchery Guide.
http://www.cobb-vantress.com/contactus/brochures/Hatchery_Guide_2008.pdf. Prieiga per
internetą 2012 12 10.
28. Underdown bird supplies.
(http://www.underdown.co.nz/maino-4-eggs-140-incubator/).Prieiga per internetą 2013 01 20.
29. VEGF Recombinant Mouse Protein.
