LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROSIOS PAKOPOS STUDIJOS

Ryčio Stakaičio

GLIOMAGENEZĖS PROCESO REGULIATORIAUS SEMAFORINO SEMA3C VEIKIMO MOLEKULINIŲ MECHANIZMŲ TYRIMAI

Baigiamasis magistro darbas

Darbo vadovas dr. Arūnas Kazlauskas

Kaunas, 2018 m.

TURINYS

SANTRAUKA ... 3

SUMMARY ... 4

PADĖKA ... 5

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9

1.1 Gliomos ... 9

1.2 Semaforinai ... 9

1.2.1 Trečios klasės semaforinai ... 9

1.3 Angiogenezė ... 12

1.4 Tetraciklinu indukuojamos, stabilios „Flp-In“ sistemos ląstelės ... 14

2. TYRIMO METODAI ... 17

2.1 Tyrimo planas ... 17

2.2 Bakterinių plazmidžių konstravimas ... 17

2.3 Eukariotinio raiškos vektoriaus konstravimas ... 18

2.4 Plazmidžių transformacija ... 19

2.5 Plazmidžių išgryninimas iš transformuotų E. coli (DH5α) bakterijų ... 20

2.6 U87 ląstelių linijos transfekcija taikant lipofekciją ir stabilių ląstelių atranka ... 21

2.7 Transfekcijos efektyvumo įvertinimas nustatant β-galoksidazės aktyvumą ... 22

2.8 GST-MAX-SCL ir GST-MAX-SWT baltymų gryninimas iš E. coli (BL21) bakterijų naudojant gliutationo afininės chromatografijos metodą ... 23

2.9 Baltymų poliakrilamido elektroforezė ... 24

2.10 Angiogenezės tyrimas su HUVEC ... 25

2.11 Statistinė duomenų analizė ... 25

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26

3.1 Plazmidinių DNR vektorių sukūrimas ... 26

3.2 Rekombinantinių Sema3C variantų sintezė ir gryninimas ... 28

3.3 Rekombinantinių GST-MAX-SCL ir GST-MAX-SWT baltymų poveikis HUVEC angiogenezei ... 29

3.4 Stabilios glioblastomos kultūros U87frt/tet ląstelių, turinčių FRT integracijos sritį, sukūrimas ... 31

3.5 Glioblastomos kultūros U87frt/tet/GFP ląstelių sukūrimas ... 32

IŠVADOS ... 34

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 35

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 37

PRIEDAI ... 42

SANTRAUKA

Darbo autorius: Rytis Stakaitis

Pavadinimas: Gliomagenezės proceso reguliatoriaus semaforino Sema3C veikimo molekulinių mechanizmų tyrimai

Darbo vadovas: dr. Arūnas Kazlauskas

Semaforinai - tai transmembraniniai, sekretuojamieji arba su glikozilfosfatidilinositoliu susijungę baltymai, klasifikuojami į 8 klases. Centrinėje nervų sistemoje ypač svarbų vaidmenį atlieka sekretuojamieji 3 klasės semaforinai (Sema3), kurie atsakingi už aksonų judėjimo reguliavimą. Sema3 šeimai priklauso septyni skirtingi baltymai (Sema3(A-G)). Gausėjantys semaforinų tyrimai atskleidžia Sema3 svarbą vėžinių susirgimų progresavime reguliuojant ląstelių gyvybingumą, auglio metastazes bei kraujagyslinių tinkų formavimąsi. Pagrindinis šio tyrimo objektas – semaforinas 3C (Sema3C) - dar ganėtinai mažai ištyrinėtas baltymas, tačiau yra duomenų, rodančių, jog šis baltymas svarbus galvos smegenų, žarnyno ir prostatos auglių angiogenezės procesams.

Sema3 baltymų funkciją reguliuoja furino proteazės, kurių atpažįstamas motyvas RxRR aptinkamas semaforinų Sema, PSI ir baziniuose domenuose. Norint nustatyti, kokią svarbą šis furinų kirpimas turi Sema3C funkcijai angiogenezės procesuose, buvo susintetinti ir išgryninti du rekombinantiniai Sema3C variantai, kurie imitavo baltymo

RNRR

vietoje furinais kirptą (SCL) ir nekirptą (SWT) Sema3C bazinį domeną. Panaudojant išgrynintus SCL ir SWT rekombinantus in vitro angiogenezės sistemoje, įvertinta šių baltymų įtaka endotelinių ląstelių HUVEC mikrokapiliarų struktūroms. Šių tyrimų rezultatai atskleidė statistiškai patikimus skirtumus tarp rekombinantinių Sema3C variantų poveikio kraujagyslinio tinklo formavimuisi, tuo būdu patvirtindami iškeltą hipotezę, kad furino kirpimo motyvas

RNRR

yra svarbus Sema3C funkcijai.

Siekiant geriau suprasti Sema3C veikimo mechanizmus, antroje darbo dalyje buvo sukurta stabili glioblastomos U87 ląstelių linija modifikuota U87frt/tet, pasižyminti „Flp-In“ ir „T-REx“ sistemų kombinacija, kurios dėka bus galima greičiau ir efektyviau sukurti stabilias ląstelių linijas, koduojančias įvairius rekombinantinius Sema3C variantus

Raktiniai žodžiai: semaforinai, Sema3C, U87, glioma, angiogenezė

SUMMARY

Author of Master’s thesis: Rytis Stakaitis

Title of Master’s thesis: Semaphorin Sema3C molecular mechanisms involved in regulation of gliomagenesis

Supervisor: PhD Arūnas Kazlauskas

Semaphorins are transmembrane, secreted or to glycosyl phosphatidylinositol-bound proteins, classified to 8 classes. Secreted class 3 semaphorins (Sema3) play an important role in axon guiding in central nervous system (CNS). This family of proteins consists of 7 members (Sema3(A-G)).

Increasingly, a growing research on semaphorins reveals Sema3 importance in various oncogenic processes associated with tumor cell viability, invasiveness and angiogenesis. The main object of this study is Sema3C protein, which is believed to have a major impact to angiogenesis in brain, intestine and prostate cancer.

The function of Sema3 proteins is partially regulated by protease family of furins, which recognize RxRR amino acid sequence in Sema, PSI and basic domains of semaphorins. In order to establish the importance of furin cleavage to Sema3C function in angiogenesis, two recombinant Sema3C variants were synthesized and purified: one of the proteins (termed SCL) was constructed to mimic the Sema3C basic domain, which is cleaved at the hypothetical furin recognition site

RNRR

, whereas the other recombinant protein represented the basic domain of Sema3C in a non-cleaved state (termed SWT). Purified recombinant SCL and SWT proteins were used in in vitro angiogenesis system to determine their impact on endothelial HUVEC cell ability to form microcapillary structures. Results of this experiment revealed significant difference between SCL and SWT in their effect on microcapillary network structure, thus confirming the hypothesis that furin cleavage at

RNRR

Sema3C basic domain is crucial to its function.

In order to fully understand mechanisms of Sema3C function, a glioblastoma U87 cell line was modified to have a combined gene expression system “Flp-In” and “T-REx”. Newly generated cell line, termed U87frt/tet, will be of great use for future studies as an efficient tool for quick generation of multiple stable glioblastoma cell lines each encoding different types of Sema3C variants.

Key words:

semaphorin, Sema3C, U87, glioma, angiogenesis

PADĖKA

Dėkoju Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Neuromokslų instituto direktoriui Prof. habil.

dr. Arimantui Tamašauskui ir Molekulinės neuroonkologijos laboratorijos vadovui doc. dr. Kęstučiui Skauminui už suteiktą galimybę prisidėti prie laboratorijoje vykdomų tyrimų.

Noriu padėkoti visam laboratorijos kolektyvui už geranoriškumą ir pagalbą įvairiais moksliniais klausimais.

Labai dėkoju savo baigiamojo darbo vadovui dr. Arūnui Kazlauskui už įvairius patarimus

planuojant ir atliekant tyrimus, suteiktas mokslines ir praktines žinias, didžiulę kantrybę, gerą

optimizmo dozę ir įkvėpimą nenuleisti rankų.

Darbas ginamas viešame magistro darbų gynimo posėdyje 2018 metų birželio 18 dieną, LSMU Laboratorinės medicinos klinikoje, 217 salėje 09:00-16:00 h. Adresas: Eivenių gatvė 2, Kaunas, Lietuva, LT- 50009.

Tiriamasis darbas atliktas: 2016-2018 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Medicinos fakulteto, Neuromokslų instituto, Molekulinės neuroonkologijos laboratorijoje.

Tyrimas iš dalies finansuotas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto medicinos fakulteto studijų lėšomis.

Visi Neuromokslų instituto Molekulinės neuroonkologijos laboratorijoje atliktų tyrimų

duomenys priklauso Molekulinės neuroonkologijos laboratorijai, nepriklausomai nuo to, kas atliko

tyrimus. Gauti duomenys gali būti naudojami Molekulinės neuroonkologijos laboratorijos mokslininkų

ir laboratorijos doktorantų reikmėms, bei I-II studijų pakopos studentų, atlikusių tyrimus laboratorijoje,

baigiamųjų darbų rengimui.

SANTRUMPOS

bHLH-Zip bazinis leucino spiralinės kilpos užtrauktuko domenas

DMEM Dulbecco modifikuota Eagle terpė (angl. Dulbecco’s Modified Eagle Medium) EDTA etilendiamino-tetraacetatas

FBS fetalinis veršiukų serumas

Flp flipazės rekombinantinis baltymas FRT flp rekombinazės taikinys

GFP žaliai fluorescuojantis baltymas GST glutationo S-transferazė

HUVEC žmogaus virkštelės venos endotelinės ląstelės HAEC žmogaus aortos endotelinės ląstelės

HMEC žmogaus mikrokraujagyslių endotelinės ląstelės IPTG izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozidas

MCS klonavimo sritis (angl. multiple cloning site) NaDS natrio dodecilsulfatas

NRP receptorius neuropilinas

PBS fosfatinis buferis (angl. phosphate buffer saline) PSI pleksino-semaforino-integrino domenas

Sema semaforinas

Sema3 3 klasės semaforinas

Sema3C 3 klasės, C grupės semaforinas

SCL furinų aktyvuoto Sema3C bazinio domeno imitacija SWT furinų neaktyvuoto Sema3C bazinio domeno imitacija

VEGF kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (angl. vascular endothelial growth factor)

ĮVADAS

Gliomageneze apibūdinamas astrocitomų, oligodendrogliomų, oligoastrocitomų ir ependimomų vystymasis. Vystantis astrocitomoms, maždaug 2/3 auglių progresuoja į didelio piktybiškumo gliomas iš kurių viena piktybiškiausių formų – glioblastoma (GBM), diagnozuojama daugiau nei 40 proc. visų pirminių centrinės nervų sistemos (CNS) navikų, o išgyvenamumas po operacijos dažnai nesiekia 12 mėnesių. Beveik visiems piktybiniams navikams būdinga išreikšta angiogenezė - glioblastoma ne išimtis, todėl kasmet vis daugiau dėmesio skiriama GBM kraujagyslinių tinklų formavimosi gilesniam suvokimui ieškant naujų angiogenezę reguliuojančių baltymų.

Angiogenezė yra vienas iš svarbiausių auglio vystymąsi sąlygojančių veiksnių. Svarbiausio angiogenezės proceso reguliatoriaus – kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) suaktyvėjimas siejamas su kraujagyslinio tinklo išvešėjimu. Šio baltymo vienas iš veikimo mechanizmų siejamas su kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus receptoriaus (VEGFR) ko-receptoriais neuropilinais, su kuriais taip pat sąveikauja trečios klasės semaforinai, pavyzdžiui, Sema3A ar Sema3F. Nustatyta, kad antiangiogeninis Sema3A ir 3F veikimas pasireiškia per konkurenciją su VEGF dėl receptoriaus neuropilino prisijungimo vietos. Tačiau ne visi 3 klasės semaforinai pasižymi aiškiu antiangiogeniniu poveikiu. Vienas iš tokių semaforinų – Sema3C, kuris taip pat sąveikauja su neuropilinais kaip ir VEGF, bet jo funkcija angiogenezėje, įvairiais šaltiniais yra ganėtinai kontraversiška. Manoma, kad Sema3C funkcija yra sąlyginai kontroliuojama furino proteazių, kurios atpažįsta Sema ir PSI domenuose esančius RxRR motyvus. Furino proteazių atpažinimo motyvas (742RNRR745) taip pat aptinkama Sema3C baziniame domene, kuriuo Sema3C baltymas sąveikauja su receptoriais neuropilinais. Sema3C kirpimas furinu motyve 742RNRR745 iki šiol nėra įrodytas, taigi, tebėra hipotetinis. Magistrinio darbo metu buvo nuspręsta pabandyti išaiškinti, hipotetinio furino kirpimo motyvo svarbą Sem3C funkcijai angiogenezės procese.

Tyrimo tikslas: nustatyti furinu aktyvuotą formą imituojančio Sema3C rekombinanto poveikį angiogenezei ir sukurti „Flp-In T-REx“ sistemą koduojančią stabilią U87 ląstelių liniją, įgalinančią palengvintą Sema3C rekombinantus koduojančių genų integraciją į ląstelės genomą ir jų raiškos reguliavimą tetraciklinu.

Tyrimo uždaviniai:

1. Sukurti 2 bakterinius vektorius, koduojančius su gliutationo transferaze (GST) ir Max bHLH-Zip domenu (MAX) sujungtą furinu aktyvuoto (SCL) ir neaktyvuoto (SWT) Sema3C bazinio domeno variantus: GST-MAX-SWT ir GST-MAX-SCL.

2. Bakterijose E. coli (BL21) susintetinti GST-MAX-SWT ir GST-MAX-SCL baltymus ir išgryninti GST afininės chromatografijos metodu.

3. HUVEC mikrokapiliarų tinklų in vitro sistemoje ištirti GST-MAX-SWT ir GST-MAX-SCL poveikį angiogenezei.

4. Glioblastomos ląstelių kultūros Tet-U87 pagrindu sukurti stabilią ląstelių liniją U87frt/tet, koduojančią „Flp-In“ sistemos DNR integracijos elementą FRT.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Gliomos

Daugiau nei 30 procentų visų centrinės nervų sistemos auglių bei, maždaug, 80 procentų piktybinių galvos smegenų navikų sudaro gliomos - iš glijos ląstelių susiformavę augliai (1,2). Gliomos skirstomos į 3 piktybiškumo laipsnius, iš kurių pats piktybiškiausias – IV laipsnio astrocitoma, dar vadinama glioblastoma, pasireiškianti ~45 proc. visų diagnozuotų gliomų (3,4). Diagnozavus glioblastomą yra 5 proc. tikimybė išgyventi ilgiau nei 5 metus, tik trečdalis pacientų išgyvena ilgiau nei 12 mėnesių po chirurginio auglio pašalinimo taikant agresyvią chemo ir radioterapijos kombinaciją (3,5). Siekiant geriau suprasti GBM piktybiškumą bei plitimą, vykdomi tyrimai su žmogaus pirmine glioblastomos ląstelių linija U87 (5,6). Dažniausiai norima šias ląstelės modifikuoti ar manipuliuoti jų augimo sąlygomis, pridedant tiriamųjų medžiagų į ląsteles supančią augimo terpę ir stebint atsirandančius pokyčius. Vienas iš tokių būdų yra DNR įterpimas į ląsteles (ląstelių transfekcija), taip priverčiant ląsteles sintetinti norimas medžiagas (7).

1.2 Semaforinai

Semaforinai tai transmembraniniai, sekretuojamieji arba su glikozilfosfatidilinositoliu (GPI) sukibę baltymai, turintys itin konservatyvų, daugiau nei 500 aminorūgščių turintį Sema domeną, esantį N-galinėje baltymo dalyje. Taip pat visi semaforinai turi pleksino-semaforino-integrino (PSI) sritį bei kiekvienai klasei unikalią bazinę C-galinę dalį, kuri sąveikauja su įvairiais receptoriais (8–10).

Labiausiai ištirti semaforinų receptoriai išlieka neuropilinų (Nrp) ir pleksinų šeimos transmembraniniai baltymai (10,11). Veikiant per šiuos receptorius, viena iš pagrindinių, semaforinams tenkančių funkcijų tai aksonų judėjimo ir neurogenezės reguliavimas (12). Atliekant daugiau funkcinių tyrimų, paaiškėjo, jog semaforinai taip pat atsakingi už kaulų, kraujagyslių, kepenų, inkstų bei imuninės sistemos formavimąsi ir funkcionavimą, kurį geba pasiekti keičiant ląstelių citoskeletą ir perorganizuojant aktino filamentus bei angiogeninį tinklą (8,13). Didžiausia semaforinų raiška vis vien išlieka nerviniame audinyje, dėl ko itin svarbu pilnai suprasti konkrečių semaforinų funkcijas nerviniame audinyje (10,14).

Šiuo metu žinomos aštuonios struktūrinės semaforinų (Sema) klasės. Pirmos ir antros klasės semaforinai sintetinami bestuburių organizmų, nuo 3-iosios iki 7-osios klasių semaforinai aptinkami stuburiniuose organizmuose, o 8-oji klasė sintetinama virusų (9,14).

1.2.1 Trečios klasės semaforinai

Trečios klasės semaforinus (Sema3) sudaro septyni skirtingi baltymai, identifikuojami raidėmis

nuo A iki G (15). Visi šios klasės baltymai susideda iš tokių pačių struktūrinių dalių: ~55,6 kDa Sema

domeno N-galinėje dalyje, PSI domeno, į imunoglobuliną panašaus domeno ir C-galinėje srityje esančio

bazinio domeno. Itin konservatyvus Sema domenas aptinkamas visuose organizmuose, jo dėka

užtikrinamas baltymo specifiškumas ir signalo perdavimas per transmembraninius receptorius. Sema3 sąveikai su šiais receptoriais itin svarbus C-galinis bazinis domenas, kuris, kaip parodyta Sema3A ir Sema3F tyrimuose, aktyvinamas furino proteazėmis (16). Furino proteazė atpažįsta semaforinų RxRR (x – bet kokia amino rūgštis) amino rūgščių seką ir atidengia su receptoriais sąveikaujantį argininą (R) (17). Įkirpus šią, C-galiniame domene esančią, baltymo vietą, Sema3C aktyvinamas ir gali sąveikauti su neuropilino molekulėmis per atidengtą arginino amino rūgštį. Susijungus neuropilinui su įkirptu semaforinu susidaro stabilus heterotrimero kompleksas, kuris jungiasi prie ko-receptoriaus pleksino (18). Tokiu atveju neuropilinas veikia kaip tarpininkaujantis receptorius tarp trečios klasės semaforinų (išskyrus Sema3E) ir pleksino, o pleksinas atlieka signalinio receptoriaus funkciją ir perduoda signalines molekules ląstelėms (19,20). Kai kurie semaforinai pasižymi daugiau nei viena furino atpažinimo vieta, kaip Sema3A, Sema3B ar Sema3D, tačiau Sema3C turi tik vieną RxRR amino rūgščių seką,

RNRR

C-galinėje dalyje, kurios kirpimas furino proteaze dar nėra įrodytas (žr. 1 pav.) (21).

1 pav. Sema3C bazinio domeno hipotetinis aktyvavimas furino proteazės proteolitiniu veikimu

Šio tyrimo objektas – Sema3C baltymas, kurio funkcija gali pasireikšti tiesiogiai - veikiant auglio ląstelių invazyvumą arba netiesiogiai - darant įtaką aplinkinėms ląstelėms bei reguliuojant angiogenezę (10). Taip pat dar nėra visiškai aišku ar šis baltymas labiau veikia kaip antionkogeninis ar kaip proonkogeninis baltymas (13,22). Dauguma trečios klasės semaforinų veikia kaip auglį slopinantys baltymai, pavyzdžiui, Sema3A slopina endotelio migraciją ir išgyvenamumą, Sema3B slopina ląstelių proliferaciją plaučių vėžio atveju ar Sema3E, kuris slopina kraujagyslių tankumą augliuose (23,24).

Atrodytų, kad Sema3C taip pat turėtų būti susijęs su vėžinių susirgimų slopinimu, tačiau nustatyta, kad

pilno ilgio Sema3C nors ir slopina angiogenezę skatindamas endotelinių ląstelių apoptozę, kuo

nepasižymi kiti pilno ilgio semaforinai, pavyzdžiui, antiangiogeninis Sema3A, tačiau paveiktas furino proteazės, PSI domeno srityje, praranda savo antiangiogeninį poveikį ir pradeda skatinti kraujagyslinių tinklų formavimąsi, priešingai negu furinu įkirptas Sema3A (16,17,25). Sema3C baziniame domene esančio furino kirpimo motyvo reikšmė šio semaforino funkcijai nėra ištirta. Sema3A ir Sema3F tyrimuose pademonstruota, kad bazinio domeno aktyvavimas furinu ypatingai svarbus šių baltymų sąveikai su Nrp1 ir Nrp2 ir konkurencija su kraujagyslių endotelio augimo faktoriumi (VEGF), kuris yra vienas iš pagrindinių angiogenezės skatintojų (26). Konkurencija vyksta per neuropilino b1 prisijungimo domeną, su kuriuo tiek VEGF, tiek Sema3A ir Sema3F jungiasi su receptoriumi panašiu afiniškumu, todėl įvyksta konkurencija dėl fizinės NRP1 prisijungimo vietos (žr. 3 pav.) (19,20). Neaišku, ar Sema3C taip pat, kaip ir Sema3A ir Sema3F, konkuruoja su VEGF dėl sąveikos su pagrindiniu Sema3C receptoriumi Nrp1, tačiau funkcinė šių dviejų molekulių priešprieša buvo pademonstruota Yang ir bendraautorių paskelbtuose tinklainės angiogenezės tyrimuose, kur Sema3C (pilno ilgio) slopino VEGF sukeltus pokyčius endotelinėse ląstelėse (16).

2 pav. Hipotetinis furino proteazės aktyvinto Sema3E tiesioginė sąveika su ko-receptoriumi

pleksinu

3 pav. Hipotetinė furino proteazės aktyvinto Sema3C konkurencija su kraujagyslių endotelio augimo faktoriumi (VEGF) dėl sąveikos su receptoriumi neuropilinu (Nrp)

1.3 Angiogenezė

Angiogenezė itin aktyviai pasireiškia embrionų vystymosi bei žaizdų gijimo metu, skatinant naujų kapiliarų susiformavimą iš jau egzistuojančių kraujagyslių. Šis svarbus procesas užtikrina stabilų ir pakankamą deguonies bei maisto medžiagų tiekimą naujai besiformuojančiam audiniui (27,28).

Angiogenezę reguliuoja įvairūs angiogeniniai faktoriai, kurie cirkuliuoja kraujagyslinių ląstelių ekstraląstelinėje aplinkoje (29). Veikiant angiogeniniams faktoriams skatinama ląstelių migracija, proliferacija, bazinės membranos suardymas ir vamzdelinių struktūrų suformavimas (28). Visus šiuos procesus galima stebėti imituojant kraujagyslių formavimąsi in vitro sąlygomis, kurios leidžia pakankamai greitai identifikuoti baltymų ar genų poveikį angiogenezei (30). Angiogenezės tyrimai ypač naudingi siekiant suprasti bendrą gausėjančio kraujagyslinio tinklo vaizdą, o ne atskirus ląstelių migracijos, įsitvirtinimo, diferenciacijos ar mikrokapiliarų susiformavimo mechanizmus.

Imituojant angiogenezę in vitro, svarbu tinkamai pasirinkti in vivo angiogenezę atspindinčias

endotelines ląsteles. Dažniausiai eksperimentuojama su žmogaus virkštelės venos endotelinėmis

ląstelėmis (HUVEC), kurios pasižymi polinkiu formuoti kapiliarinius tinklus, glaudžiai sąveikauja tarp

ląstelių ir turi didelį proliferacijos dažnį (31,32). Alternatyva HUVEC yra žmogaus aortos endotelinės

ląstelės (HAEC) arba žmogaus mikrokraujagyslių endotelinės ląstelės (HMEC). Tačiau HAEC labiau

specializuota poangiogeniniams mechanizmas tirti, tokiems kaip hipertenzijos ar trombozės atsiradimas,

o HMEC, nors ir turi tapatumo su vėžinį audinį supančiomis endotelio ląstelėmis, bet greitai praranda

jautrumą angiogeniniams faktoriams ir tampa negyvybingos (31). Verta paminėti, kad yra sukurta

modifikuota HMEC ląstelių linija (HMEC-1), kurios gyvybingumas ženkliai prailgintas, tačiau tokios savybės gali sąlygoti klaidingai teigiamus ar neigiamus rezultatus (33,34).

Vienas iš pirmųjų sukurtų angiogenezės tyrimo metodų buvo žaizdos gijimo testas. Perbrėžus, 2D lėkštelėje užsėtas endotelines, ląsteles vertinamas jų gebėjimas migruoti į perivaskulinę zoną ir taip užpildyti mechaniškai sukurtą tarpą tarp ląstelių. Stebint šį gijimo procesą per šviesinį mikroskopą, galima įvertinti ląstelių migravimo greitį, gyvybingumą bei poliškumą (35,36). Vienas iš didžiausių privalumų, naudojant šį metodą yra tai, kad nereikia specialių darbo priemonių ar izoliuotų kamerų, bet ganėtinai sudėtinga tiksliai atkartoti eksperimentus dėl būtinybės itin tiksliai atkartoti įbrėžimo storį ir pasėtų ląstelių sutankėjimą. Dar vienas seniai sukurtas, bet vis dar populiarus metodas – ląstelių invazyvumo nustatymas Boydeno arba Dunno kamerų pagalba. Abi šio tyrimo modifikacijos paremtos ląstelių polinkiu migruoti link chemotaksio stimuliatoriaus (37). Boydeno metodu ląstelės užsėjamos ant polimerizuotos lėkštelės su mikroporomis, o po jomis įpilama ląstelių augimo terpė su tiriamąja medžiaga kaip baltymai ar vaistinės medžiagos (38). Po poros valandų stebimas ląstelių migravimas pro mikroporas ir taip vertinamas tiriamosios medžiagos invazyvumo skatinimas ar slopinimas (39). Dunno metodo veikimo principas panašus, tik vietoj vertikalaus ląstelių migravimo, vyksta horizontalusis migravimas, taip išvengiant gravitacinio poveikio (37,40). Nors abu metodai yra sąlyginai paprasti ir ekonomiški, bet jie parodo tik tam tikrą angiogenezės etapą. Taikant 2D mikrovamzdelių formavimosi metodą galima susidaryti bendrą vaizdą, kaip tiriamoji medžiaga veikia visą angiogenezę. Šiuo ganėtinai greitu metodu stebima kaip naujai užsėtos ląstelės pradeda užmegzti ryšį viena su kita, tarpusavyje formuoja mikrokapiliarų tinklą ir kaip ilgai tas tinklas išlaikomas (žr. 4 pav.) (39). Šiems tyrimams dažniausiai naudojama HUVEC endotelinių ląstelių linija, ląstelės užsėjamos ant specialaus ekstraląstelinio matrikso kartu su tiriamaisiais baltymais ar vaistinėmis medžiagomis. Laikui bėgant ląstelės stebimos pro mikroskopą ir fotografuojamos, maždaug po 16-24 valandų vertinamas mikrokapiliarų ilgis, šakotumas ir kitos charakteristikos. Norint dar geriau suvokti tiriamųjų medžiagų poveikį ar funkciją angiogenezėje ir kuo tiksliau imituoti procesus gyvame organizme, yra sukurtos 3D mikrokapiliarų formavimosi metodikos. Taikant 3D ląstelių auginimą galima geriau suvokti ląstelių erdvines tarpusavio sąveikas ir pasiekti į in vivo panašesnius vykstančius procesus (39).

4 pav. HUVEC ląstelių formuojamas mikrokapiliarų tinklas skirtingais laiko tarpsniais

Adaptuota pagal (41)

1.4 Tetraciklinu indukuojamos, stabilios „Flp-In“ sistemos ląstelės

Atliekant funkcinius genų ir jų koduojamų baltymų tyrimus vienas iš būdų tai pasiekti yra gebėjimas įjungti ar išjungti tiriamo baltymo sintezę pačiose ląstelėse. Kontroliuojama tiriamojo geno raiška ląstelėse gali būti sukuriama įvairiais metodais, pavyzdžiui, transfekuojant ląsteles žinomomis mikro RNR molekulėmis, kurios slopintų genų potranskripcinius mechanizmus ir tuo būdu slopintų tiriamojo baltymo sintezę arba modifikuojant ląsteles taip, kad jos pastoviai inicijuotų transfekuotų plazmidžių slopinimą arba aktyvinimą, su galimybe šį veikimą reguliuoti specifiniais reagentais- induktoriais (42). Pirmuoju variantu yra ganėtinai sunku atsirinkti konkrečią mikro RNR, kuri turėtų tik vieną taikinį. Net ir išsirinkus unikalią mikro RNR su vienu taikiniu, šių molekulių veikimo efektyvumo laikotarpis yra trumpas (keletas dienų) (43). Antruoju variantu sukuriama indukuojama tiriamojo geno raišką koduojanti stabili ląstelių linija, kuri užtikrina tyrimų ilgalaikiškumą ir patikimumą, tačiau šių ląstelių linijų sukūrimas yra ganėtinai ilgas ir sudėtingas procesas (44).

Vienas iš būdų sukurti indukuojamas ląsteles yra taikant tetraciklinu indukuojamą genų raiškos sistemą “T-REx” (žr. 5 pav.). Šios sistemos metu atliekama dviguba stabilių ląstelių linijų atranka.

Pirmiausia transfekuojamos ląstelės su DNR plazmidėmis, kurios koduoja transkripcijos reguliatorių tetR, ir atrankinio antibiotiko pagalba, kurio atsparumas būna koduojamas transfekuotoje plazmidėje, vykdoma pirmoji stabilių ląstelių atranka. Kitame etape tetR stabiliai sintetinančios ląstelės transfekuojamos DNR plazmidėmis, kurios koduoja tiriamojo geno seką, bei atliekama antroji stabilių ląstelių atranka. Sistemos funkcionalumas pasireiškia tuo, kad tiriamojo baltymo geną koduojanti plazmidė promotoriaus sekoje turi transkripcinio slopiklio tetR jungimosi vietą. Prisijungus tetR prie promotoriaus, užslopinama tiriamojo geno raiška. Geno raišką laikinai galima įjungti į ląstelių mitybinę terpę įdėjus tetR ligando tetraciklino, kuris susijungia su transkripcijos slopintoju tetR ir atpalaiduoja jį nuo geno promotoriaus ir tokiu būdu tetraciklinas atlieka transkripcijos induktoriaus vaidmenį (44,45).

Taikant šią sistemą galima nesudėtingai ir su minimaliais pašaliniais veiksniais stebėti tiriamojo baltymo

daromus pokyčius ląstelėms pakartotinai išjungiant ir įjungiant jo sintezę. Vis dėlto pasiekti galutinį

tikslą yra ganėtinai sudėtingas ir ilgas procesas, užsitęsiantis stabilių ląstelių atrankos etape. Taip pat,

atliekant ląstelių atranką, neišvengiamai didėja ląstelių persėjimų skaičius, dėl ko ląstelėse gali atsirasti

atsitiktinės mutacijos ir taip pasunkinti rezultatų interpretavimą arba priversti pakartotinai atlikti visą

tyrimą (46,47).

5 pav. „T-REx“ sistemą turinčių stabilių ląstelių veikimo schema Adaptuota pagal (48)

Siekiant sumažinti ląstelių persėjimo skaičių ir pagreitinti stabilių ląstelių linijos atranką, lygiagrečiai su „T-REx“ sistema naudojama papildoma ląstelių modifikacijos sistema – „Flp-In“.

Modifikacija pagrįsta flp rekombinazės veikimu, kuris integruoja transfekuotą, tiriamąjį geną koduojančią plazmidę į ląstelėse esančią FRT (flp rekombinazės taikinys) sritį (49). Sistema sukuriama tetR koduojančias stabilias ląsteles transfekuojant FRT sritį koduojančia plazmide ir atrenkant stabilią ląstelių liniją, koduojančią ir tetR, ir FRT. Tokiu būdu gaunamas „Flp-In“ ir „T-REx“ ektopinės geno raiškos sistemos derinys, kurį galima taikyti vienu metu kuriant neribotą skaičių stabilių ląstelių linijų, koduojančių skirtingus tiriamus genus, kurių raiška būtų reguliuojama tetraciklinu. Ši sistema naudojama taip: į tetR/FRT stabilias ląsteles vienu metu įterpiami du plazmidiniai vektoriai: vienas koduojantis flp rekombinazę, o kitas – tiriamojo baltymo DNR seką ir FRT sritį. Tokiu atveju ląstelė pradeda sintetinti flp rekombinazę, kuri įterpia tiriamojo baltymo plazmidę į ląstelės genomą sujungdama FRT elementą esantį ląstelėje ir FRT sritį esančią plazmidiniame vektoriuje (žr. 6 pav.) (50–

52).

6 pav. „Flp-In“ sistemą turinčių stabilių ląstelių veikimo schema

Adaptuota pagal (53)

2. TYRIMO METODAI

2.1 Tyrimo planas

Magistrinio darbo metu buvo naudojamos:

1) Stabili U87tet ląstelių linija (Aušra Marčiulionytė, 2015 m.),

2) pGEX4T3/SCL ir pGEX4T3/SWT plazmidinės konstrukcijos (Mantvydas Rinkūnas, 2016 m.) 3) pET302/MAX/SCL ir pET302/MAX/SWT plazmidinės konstrukcijos (Aidas Marijus

Vyšniauskas, 2017 m.)

Tyrimo pradiniame etape numatyta sukonstruoti tris naujas plazmides: dvi bakterines plazmidines konstrukcijas pGEX4T3/MAX/SCL ir pGEX4T3/MAX/SWT, koduojančias rekombinantinius baltymus, kuriuos sudaro gliutationo S-transferazė (GST), Max bHLH-Zip domenas ir Sema3C bazinio domeno furinu kirptą (SCL) ir nekirptą (SWT) formas imituojantys variantai; trečioji plazmidė - pcDNA

/FRT/TO/GFP – tai eukariotinis „Flp-In T-REx“ sistemos raiškos vektorius, koduojantį žaliai fluorescuojantį baltymą GFP. Pirmosios dvi plazmidės skirtos rekombinantinių baltymų GST-MAX-SCL ir GST-MAX-SWT sintezei bakterijose, o trečioji plazmidė skirta U87frt/tet stabilios ląstelių linijos veikimo tikrinimui. Detali techninė informacija pateikiama 1-3 prieduose.

2.2 Bakterinių plazmidžių konstravimas

1) Virtualus naujos plazmidės kūrimas atliekamas „ApE“ programine įranga

2) 5 µg plazmidinių vektorių pGEX4T3/SCL ir pGEX4T3/SWT paruošiami įkerpant klonavimo sritį su 10 a.v. restrikcine endonukleaze EcoRI ir inkubuojama 1 valandą +37℃

temperatūroje

3) DNR intarpinis MAX fragmentas iškerpamas iš 10 µg pET302/MAX/SCL plazmidės naudojant 10 a.v. EcoRI ir inkubuojant 1 valandą, +37℃ temperatūroje

4) Vektorių ir intarpų dydžiai patikrinami 1 proc. agarozės gelyje ir išgryninami iš jo naudojant

„PureLink Quick Gel Extraction Kit“ rinkinį

5) Linearizuoti vektoriai defosforilinami naudojant 1/20 bendro tūrio (1 a.v./µl koncentracijos) šarminę fosfatazę „FastAP“. Fermento defosforilinantis veikimas aktyvinamas inkubuojant 22 min., +37℃ temperatūroje, fermento inaktyvavimas - inkubuojant 5 min., +75℃

temperatūroje. Defosforilintas, linearizuotas, plazmidinis vektorius nebegali susijungti pats su savimi veikiant DNR ligazei

6) Nauja plazmidė sukuriama sujungiant iškirptą DNR fragmentą su linearizuotu, defosforilintu,

plazmidiniu vektoriumi naudojant 1/20 bendro tūrio (40 a.v./µl koncentracijos) T4 DNR

ligazę ir inkubuojant 24 valandas, kambario temperatūroje

7) 1 µg naujai sukonstruotų plazmidžių pGEX4T3/MAX/SCL ir pGEX4T3/MAX/SWT,

patikrinamos sukarpant su 10 a.v. restrikcinėmis endonukleazėmis PstI ir XhoI, inkubuojant 1 valandą, +37℃ temperatūroje. Po sukarpymo atliekama 1 proc. agarozės gelio elektroforezė 8) Jei elektroforezėje matomi fragmentų dydžiai atitinka teorinius fragmentų dydžius, tada nauja

plazmidė pagausinama transformuojant kompetentines Escherichia coli (E. coli) (DH5α) bakterijas

7 pav. Rekombinantinius Sema3C variantus koduojančių bakterinių vektorių kūrimo schema EcoRI – restrikcinė endonukleazė, kerpanti DNR seką ties G^AATTC nukleotidų seka. T4 Ligazė - fermentas sujungiantis DNR fragmentus. GST – gliutatijono S-transferazę koduojanti nukleotidų seka.

MAX – transkripcijos faktorių Max, sujungtą su bHLH-Zip fragmentu koduojanti nukleotidų seka. SCL – furinais įkirpto Sema3C bazinio domeno imitaciją koduojanti nukleotidų seka. SWT - furinais

neįkirpto Sema3C bazinio domeno imitaciją koduojanti nukleotidų seka

2.3 Eukariotinio raiškos vektoriaus konstravimas

1) Virtualus naujos plazmidės kūrimas atliekamas „ApE“ programine įranga

2) 5 µg plazmidinio vektoriaus pcDNA

/FRT/TO paruošiama įkerpant klonavimo sritį su 10 a.v.

restrikcine endonukleaze BamHI, inkubuojant 1 valandą +37℃ temperatūroje ir

modifikuojant naudojant 2/35 bendro tūrio (5 a.v./µl koncentracijos) Klenovo fragmentą.

Fermento 5’→3’ polimerazinis ir 3’→5’ egzonukleazinis veikimas aktyvinamas inkubuojant 15 min., +37℃ temperatūroje, fermento inaktyvinimas - inkubuojant 10 min., +75℃

temperatūroje. Klenovo fragmentas naudojamas užbukinti įkirptos DNR lipnius galus,

susidariusius po restrikcinių endonukleazių veikimo

3) DNR intarpinis GFP fragmentas iškerpamas iš 10 µg pcDNA

/FRT/TO/GFP plazmidės naudojant 10 a.v. BamHI, inkubuojant 1 valandą, +37℃ temperatūroje ir modifikuojant naudojant 2/35 bendro tūrio (5 a.v./µl koncentracijos) Klenovo fragmentą

4) Vektorių ir intarpų dydžio patikrinimas 1 proc. agarozės gelyje ir išgryninimas iš jo naudojant

„PureLink Quick Gel Extraction Kit“ rinkinį

5) Linearizuotas vektorius defosforilinamas naudojant 1/20 bendro tūrio (1 a.v./µl koncentracijos) šarminę fosfatazę „FastAP“

6) Naujas eukariotinis raiškos vektorius sukuriamas sujungiant iškirptą DNR fragmentą su linearizuotu, defosforilintu, plazmidiniu vektoriumi naudojant 1/20 bendro tūrio (40 a.v./µl koncentracijos) T4 DNR ligazę ir inkubuojant 24 valandas, kambario temperatūroje

7) 1 µg naujai sukonstruoto eukariotinio raiškos vektoriaus pcDNA

/FRT/TO/GFP, patikrinamas sukarpant su 10 a.v. restrikcinėmis endonukleazėmis KpnI ir NdeI, inkubuojant 1 valandą, +37℃ temperatūroje. Po sukarpymo atliekama 1 proc. agarozės gelio elektroforezė

8) Jei elektroforezėje matomi fragmentų dydžiai atitinka teorinius fragmentų dydžius, tada nauja plazmidė pagausinama transformuojant kompetentines E. coli (DH5α) bakterijas

8 pav. GFP baltymą koduojančio ir FRT elementą turinčio eukariotinio raiškos vektoriaus kūrimo schema

BamHI – restrikcinė endonukleazė, kerpanti DNR seką ties G^GATC nukleotidų seka. T4 Ligazė - fermentas sujungiantis DNR fragmentus. GFP – žaliai fluorescuojantį baltymą koduojanti nukleotidų

seka. Klenovo f. – fermentas pasižymintis 5’→3’ polimeraziniu ir 3’→5’ egzonukleaziniu veikimu.

pcDNA5/FRT/TO – eukariotinis raiškos vektorius turintis FRT integracijos elementą ir koduojantis tetR transkripcijos slopiklį

2.4 Plazmidžių transformacija

1) 0,3 µg plazmidinės DNR sumaišoma su 50 µl kompetentinėmis E. coli DH5α

(pcDNA

/FRT/TO/GFP atveju) arba E. coli BL21 (bakterinių plazmidžių atvejuose)

bakterijomis ir paliekama inkubuotis 30 min. leduose

2) Plazmidės patekimo į bakterijų vidų efektyvumas padidinamas temperatūriniu šoku laikant bakterijų ir plazmidinės DNR mišinį 40 sekundžių, +42℃ temperatūroje

3) Transfekuotos bakterijos gaivinamos gliukoze praturtintoje S.O.C. mitybinėje terpėje 1 valandą, +37℃ (DH5α ) / +30℃ (BL21) temperatūroje

4) Transfekuotos bakterijos užsėjamos ant kieto agaro terpės su 100 µg/ml ampicilinu ir inkubuojamos 16 valandų, +37℃ (DH5α ) / +30℃ (BL21) temperatūroje

5) Išaugusios bakterijų kolonijos turi įsiterpusią plazmidinę DNR molekulę, kuri lemia atsparumą ampicilinui

9 pav. Plazmidinių vektorių įterpimo ir pagausinimo kompetentinėse E. coli bakterijose schema DNR plazmidė – plazmidinis vektorius koduojantis tiriamąjį baltymą ir atsparumą ampicilinui

2.5 Plazmidžių išgryninimas iš transformuotų E. coli (DH5α) bakterijų

1) Bakterijos kultivuojamos 16 valandų +37℃

temperatūroje skystoje mitybinėje terpėje („Lysogeny Broth“ - LB) su 100 µg/ml ampicilinu

2) Pagausintos bakterijos išsodinimos centrifuguojant 10 min., 2880 x g greičiu, +4℃

temperatūroje

3) Naudojant rinkinį „PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit“ (žr. 3 priedas), iš bakterijų masės (nuosėdų) išskiriama plazmidinė DNR

4) DNR koncentracija plazmidžių mėginyje išmatuojama naudojant spektrofotometrą

„NanoDrop 2000“. Mėginio 260 nm bangos ilgio sugertis tiesiogiai proporcinga DNR koncentracijai, o 260/280 nm ir 260/230 nm bangos ilgių sugerties santykio (~1,8 ir ~2,0) sumažėjimas parodo mėginio užterštumą baltymais ir fenoliais ar kitomis organinėmis priemaišomis

10 pav. Plazmidžių išgryninimo iš transformuotų E. coli (DH5α) bakterijų schema

2.6 U87 ląstelių linijos transfekcija taikant lipofekciją ir stabilių ląstelių atranka

1) U87MG ląstelių linija auginama aminorūgštimis, vitaminais, mineralais, gliukoze ir

gliutaminu praturtintoje mitybinėje terpėje „DMEM-GlutaMAX“ su 10 proc. augimo faktorių turinčiu fetaliniu veršiuko serumu (FBS) ir penicilino/streptomicino antibiotikų mišiniu (P/S) 2) Dieną prieš transfekciją ląstelės užsėjamos į 55 cm

Petri lėkštelę 60 proc. tankumu

3) Kitą dieną, įvertinus ląstelių tankumą (pageidautina, kad jis būtų 85-90 proc.), atliekama jų transfekcija plazmidinėmis DNR. DNR ir lipofektamino kompleksas sudaromas sumaišant plazmidinę DNR su lipofekcijos reagentu ir inkubuojant 10 min., kambario temperatūroje;

susidaręs DNR ir reagento kompleksas užlašinamas ant ląstelių

4) DNR ir lipofektamino kompleksas liposomų pagalba prasiskverbia į ląstelių citoplazmą inkubuojant ląsteles 48 valandas, +37℃ temperatūroje, 5 proc. CO

sąlygomis

5) Po 48 h. ląstelės persėjamos 25 proc. tankumu atrankos antibiotikais zeocinu

arba higromicinu

papildytoje mitybinėje terpėje

6) Ląstelių, į kurių genomą sėkmingai įsiterpė plazmidinė DNR ir kurios tuo būdu įgyja

atsparumą atrankos antibiotikams, atranka vykdoma tol, kol ląstelės nustoja gausiai mirti ir

pradeda stabiliai daugintis bei formuoti kolonijas.

1 Transfekavus pFRT/lacZeo plazmidę, kuri įsiterpusi į ląstelės genomą veikia kaip flp rekombinazės taikinys ir užtikrina greitesnę stabilių ląstelių atranką, bei koduoja β-galoksidazės fermentą, naudojamas 500 µg/ml atrankinis zeocino antibiotikas

2 Ko-transfekavus pOG44 ir pcDNA⁵/FRT/TO/GFP plazmides, kurios koduoja flp rekombinazę ir žaliai fluorescuojantį baltymą (GFP), naudojamas 10 µg/ml atrankinis higromicino B antibiotikas

11 pav. DNR įterpimo į eukariotines ląsteles schema

2.7 Transfekcijos efektyvumo įvertinimas nustatant β-galoksidazės aktyvumą

1) pFRT/lacZeo plazmide transfekuotos ir atsparumą zeocinui įgijusios U87tet ląstelės, kurios buvo pavadintos U87frt/tet, užsėjamos į 96 šulinėlių formato lėkštelės šulinėlius po 5x10

ląstelių į šulinėlį tankumu

2) Po 24 h. nusiurbiama terpė ir praplaunama fosfatiniu druskų tirpalu (PBS)

3) Fiksuojamos ląsteles užpilant komercinį fiksavimo reagentą („β-Gal Staining Kit“) ir inkubuojant 10 min., kambario temperatūroje

4) Užfiksuotos ląstelės praplaunamos su 1x PBS ir paveikiamos komerciniu dažymo reagentu, kurio sudėtyje yra 20 mg/ml bromchloroindoksilo galaktozido (X-gal) - mėlynojo pigmento prijungto prie galaktozės molekulės. Inkubuojama 2 valandas, +37℃ temperatūroje, 5 proc.

CO

sąlygomis

5) Vertinamas β-galoksidazės aktyvumas šviesiniu mikroskopu suskaičiuojant nusidažiusių

mėlynai (sėkmingai transfekuotų ląstelių) ir nenusidažiusių ląstelių santykį

2.8 GST-MAX-SCL ir GST-MAX-SWT baltymų gryninimas iš E. coli (BL21) bakterijų naudojant gliutationo afininės chromatografijos metodą

1) Gryninimui naudotos gliutationo kolonėlės („Pierce Glutathione Spin Columns“) ir buferiniai tirpalai aprašyti 1 priede

2) Transformuotos bakterijos pagausinamos skystoje LB mitybinėje terpėje su 100 µg/ml ampicilinu ir inkubuojamos 16 valandų, +35℃ temperatūroje

3) Bakterijos gausinamos +35℃ temperatūroje kol jų biomasės optinis tankis pasiekia 0,6 - 0,8 intervalą (λ = 600 nm)

4) GST-MAX-SCL ir GST-MAX-SWT baltymų sintezė aktyvinama pašalinant slopiklį nuo plazmidinio lac operono su 1mM Izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozidu (IPTG). Bakterijos

5) Bakterijos centrifuguojamos 2880 x g greičiu, 10 min., +4

℃ temperatūroje

6) Bakterijos suardomos sumaišant jas su 2 ml lizės buferiu ir inkubuojant 30 min., +37℃

temperatūroje bei maišant automatinėje maišyklėje 20 min. po inkubavimo

7) Užtikrinant visišką bakterijų suardymą, pridedamas detergentas „Triton X-100“ iki 1 proc.

galutinės koncentracijos ir inkubuojama 1 valandą, +16℃ temperatūroje automatinėje maišyklėje

8) Bakterijų liekanos nuo baltymų atskiriamos centrifuguojant 16 000 x g greičiu, 40 min., +4℃

temperatūroje

9) Aktyvuojami gliutationo kolonėlės, agarozinės dervos cheminiai centrai, įpilant plovimo buferio ir centrifuguojant 2 min., 680 x g greičiu, kambario temperatūroje

10) GST baltymai prijungiami prie aktyvuotos gliutationo kolonėles, įpilant baltyminį supernatantą į kolonėlę ir inkubuojant 1 valandą, +16℃ temperatūroje automatinėje maišyklėje

11) Neprikibę baltymai (baltymai neturintys GST fragmento) šalinami centrifuguojant kolonėlę 2 min., 680 x g greičiu, kambario temperatūroje

12) Gliutationo kolonėlė, su GST fragmentą turinčias baltymais, plaunama nuo priemaišų įpilant plovimo buferio ir centrifuguojant 2 min., 680 x g greičiu, kambario temperatūroje

13) Baltymai, turintys GST fragmentą, atpalaiduojami nuo kolonėlės įpilant eliucijos buferio

(turinčio 10 mM redukuoto gliutationo) į kolonėlę ir centrfuguojant 2 min., 680 x g greičiu,

kambario temperatūroje. Eliucija kartojama 4 kartus - taip surenkamos 4 baltymų frakcijos

12 pav. Rekombinantinių baltymų pagausinimo ir išgryninimo iš transformuotų E. coli (BL21) bakterijų schema

IPTG – bakterinių vektorių raiškos induktorius

13 pav. Rekombinantinių Sema3C variantų struktūra

GST – baltymų išgryninimui, GST afininės chromatografijos būdu, reikalingas fragmentas. MAX – per bHLH-Zip domeną suformuoja stabilius homodimerus, imituodamas natūralų Sema3C išsidėstymą.

SCL – furinais kirpto Sema3C bazinio domeno imitacija. SWT – pilno ilgio Sema3C bazinis domenas

2.9 Baltymų poliakrilamido elektroforezė

1) Elektroforezės gelių ir buferinių tirpalų sudėtis aprašyta 1 priede

2) Paruošiami dviejų koncentracijų (5 proc., pH 6,8 ir 10 proc., pH 8,8) poliakrilamido geliai 3) Denatūruojami ir neigiamai įkraunami baltymai sumaišius baltymus su baltymų denatūravimo

tirpalu (turinčio β-merkaptoetanoliu ir natrio dodecilsulfatu) (¼ baltymų tūrio) ir pakaitinus 5 min., +95℃ temperatūroje

4) Denatūruoti baltymai suleidžiami (20 µl) į poliakrilamido gelį ir skatinama migracija link anodo leidžiant 100 V įtampą, 1 valandą 30 min.

5) Numigravusių baltymų vizualizacija 30 min. dažant poliakrilamido gelį „Comassie Briliant

Blue R-250“ dažu

6) Numigravusių baltymų ryškinimas 1 valandą blukinant poliakrilamido gelį blukinimo tirpalu

2.10 Angiogenezės tyrimas su HUVEC

1) Žmogaus virkštelės venos endotelio ląstelės (HUVEC) auginamos 75 cm

ląstelių auginimo lėkštelėje iki 80 proc. konfluentiškumo. Ląstelių auginimui naudojama speciali M200 PRF terpė su 2 proc. LSGS (ląstelių augimo priedas turintis mažai serumo)

2) „Geltrex“, mažai augimo faktorių turintis, ekstraląstelinį matriksą imituojantis gelis, išimamas iš -80℃ temperatūros ir paliekamas atitirpti leduose, +4℃ temperatūroje 18 h.

3) 100 µl „Geltrex“ supilama į 0,32 cm

šulinėlį ir paliekama stingti 30 min., +37℃

temperatūroje 5 proc. CO

sąlygomis

4) HUVEC atšokdinamos naudojant tripsiną su EDTA ir suskaičiuojamos 25 hemocitometro kvadratėliuose

5) 15 000 ląstelių atskirai sumaišomos su tiriamaisiais baltymais, kad galutinė baltymų koncentracija būtų 0,5 µM

6) Ląstelės, sumaišytos su baltymais, užsėjamos ant sustingusio „Geltrex“ ir paliekamos inkubuotis 16 valandų, +37℃ temperatūroje, 5 proc. CO

sąlygomis

7) Po inkubacijos baltymų poveikis ląstelių angiogenezei vertinamas „Image J“ programine įranga

2.11 Statistinė duomenų analizė

Angiogenezės eksperimentai, visomis sąlygomis, kartoti tris kartus ir gautų duomenų statistinė

analizė atlikta naudojant Microsoft Excel programinę įranga. Kiekybiniai duomenys įvertinti taikant

neporinį, abipusį t-testą (angl. unpaired two-tailed t-test). Statistinių hipotezių tikrinimui pasirinktas 0,05

reikšmingumo lygmuo, tai reiškia, kad esant p≤0,05 – atmetama atsitiktinumo galimybė, o kai p>0,05

– duomenų skirtumai statistiškai nepatikimi.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Plazmidinių DNR vektorių sukūrimas

Atlikus naujai sukurtų plazmidžių restrikcinę analizę (žr. 14 ir 15 pav.), patvirtinta, jog pavyko sėkmingai virtualiai sumodeliuoti ir bioinžineriškai sukonstruoti 3 skirtingas plazmidines DNR konstrukcijas:

1) pGEX4T3/MAX/SCL, kuri koduoja furinu įkirptą Sema3C bazinį domeną imituojantį fragmentą, sujungtą su homodimerizaciją užtikrinančiu MAX baltymo bHLH-Zip domenu bei baltymo gryninimui reikalingu GST baltymu. Konstruktą sukarpius PstI ir XhoI restrikcinėmis endonukleazėmis nustatyti 4 iš 6 bakterinių klonų turintys teisingai sukonstruotą pGEX4T3/MAX/SCL plazmidę, kurios gauti sukarpyti fragmentai atitiko teorinius dydžius – 4251; 964 ir 174 nukleotidų bazių poras (žr. 14 pav.).

2) pGEX4T3/MAX/SWT, kuri koduoja furinu neįkirptą Sema3C bazinį domeną imituojantį fragmentą, sujungtą su MAX bHLH-Zip ir GST. Atlikus restrikcinę analizę panaudojant PstI ir XhoI restriktazes, nustatyta, kad 5 iš 6 bakterinių klonų turėjo sėkmingai sukonstruotą pGEX4T3/MAX/SWT plazmidę, kurios sukarpyti fragmentai atitiko teorinius dydžius – 4251; 964 ir 192 nukleotidų bazių poras (žr. 14 pav.).

3) Eukariotinės raiškos vektorių pcDNA

/FRT/TO/GFP, koduojantį DNR rekombinacijos sritį FRT

ir žaliai fluorescuojantį baltymą GFP (sužadinamas 395 nm – 475 nm bangos ilgio šviesos intervale),

kurio sintezę galima reguliuoti tetraciklino pagalba, dėl esančios transkripcijos represoriaus tetR

prisijungimo sekų (TO) GFP promotoriuje. Naujai sukonstruotą raiškos vektorių paveikus KpnI ir NdeI

restriktazėmis, gauti 3516; 1120 ir 501 nukleotidų bazių porų fragmentai, kurie atitiko teorinius

plazmidės sukarpymo dydžius gautus „ApE“ programine įranga (žr. 15 pav.).

14 pav. pGEX4T3/MAX/SCL ir pGEX4T3/MAX/SWT konstruktų restrikcinė analizė naudojant PstI ir XhoI restrikcines endonukleazes

SM#0313 – molekulinio dydžio standartas. Rodyklėmis pažymėti tolimesniam darbui pasirinkti naudoti bakterijų klonai, turintys teisingai sukonstruotus bakterinius vektorius. Teisinga konstrukto orientacija laikytina, kai sukarpyti plazmidės fragmentai atitiko teorinius plazmidės sukarpymo fragmentus gautus

„ApE“ programine įranga (pGEX4T3/MAX/SCL atveju 1;3;4 ir 5 klonai. pGEX4T3/MAX/SWT atveju 1;2;3;4 ir 5 klonai). Neteisinga konstrukto orientacija parodo, kad MAX fragmentą koduojanti

nukleotidų seka į bakterinį vektorių įsiterpė atvirkščia orientacija

15 pav. pcDNA

/FRT/TO/GFP konstrukto restrikcinė analizė naudojant KpnI ir NdeI restrikcines endonukleazes

SM0331 – molekulinio dydžio standartas. Taisyklingas plazmidė laikytina, kai sukarpyti plazmidės

fragmentai atitiko teorinius plazmidės sukarpymo fragmentus gautus „ApE“ programine įranga

3.2 Rekombinantinių Sema3C variantų sintezė ir gryninimas

GST-MAX-SCL ir GST-MAX-SWT baltymų sintezei E. coli (BL21) bakterijose buvo nustatytos optimalios sąlygos: indukcija 1mM IPTG, 3 h. 35°C temperatūroje, kuriomis sėkmingai susintetinti 43,5 kDa molekulinio svorio rekombinantiniai baltymai (žr. 16 pav.). Pasinaudojant šių baltymų suprojektuota savybe turėti GST baltymą, jo ligando gliutationo afininės chromatografijos metodu pavyko išgryninti ir dalinai atskirti 43,5 kDa rekombinantinius baltymus nuo pašalinių bakterijų sintetinamų baltymų (žr. 17 pav.).

16 pav. Transformuotų ir indukuotų E. coli (BL21) bakterijų baltymų poliakrilamido gelis

„Blue Star“ – baltymų molekulinio dydžio standartas. Raudonuose stačiakampiuose pažymėti rekombinantiniai Sema3C variantai, kurių molekulinis svoris atitinka teorinius baltymų dydžius, remiantis „ApE“ programine įranga. Bakterijose, prieš IPTG indukciją (2 ir 4 poliakrilamido gelio

šulinėliai), nematomi ~43,5 kDa dydžio baltymai, o bakterijose, po IPTG indukcijos (3 ir 5 poliakrilamido gelio šulinėliai) matomi ~43,5 kDa dydžio baltymai, kas parodo sėkmingą

rekombinantinių Sema3C variantų sintezę

17 pav. Išgrynintų rekombinantinių Sema3C variantų poliakrilamido gelis

„Blue Star“ – baltymų molekulinio dydžio standartas. Raudonuose stačiakampiuose pažymėti rekombinantiniai Sema3C variantai, kurių molekulinis svoris atitinka teorinius baltymų dydžius, remiantis „ApE“ programine įranga. 5 ir 7 šulinėliuose esantys baltymai, lengvesni už 43,5 kDa,

parodo rekombinantinių Sema3C variantų degradavimą baltymų gryninimo metu

3.3 Rekombinantinių GST-MAX-SCL ir GST-MAX-SWT baltymų poveikis HUVEC angiogenezei

Išgryninti GST-MAX-SCL ir GST-MAX-SWT baltymai panaudoti angiogenezės tyrime, siekiant imituoti furinais aktyvuoto (SCL) ir neaktyvuoto (SWT) semaforino 3C poveikį HUVEC ląstelėms. Tyrimo kontroliniuose mėginiuose HUVEC ląstelės buvo veikiamos GST baltymu.

Įvertinus HUVEC ląstelių suformuotą mikrovamzdelių tinklą (žr. 18 pav.), nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai parodė, kad:

1) Atsižvelgiant į HUVEC ląstelių mikrovamzdelių kiekį, šakotumą ir jų suformuotas akutes,

statistiškai patikimai nustatyta, jog šie parametrai buvo gausesni ląstelėse augančiose GST-MAX-SWT

baltymą turinčioje terpėje, negu ląstelėse su GST ar GST-MAX-SCL baltymais. Lyginant GST ir GST-

MAX-SCL baltymų poveikį, statistiškai patikimų skirtumų ar tendencijos nenustatyta (p>0.16) (žr. 19

pav.).

2) Apskaičiavus HUVEC ląstelių suformuotų akučių vidutinį plotą ir perimetrą, nustatyta, kad ląstelės paveiktos GST-MAX-SWT turėjo mažiausias akutes, lyginant su GST ir GST-MAX-SCL baltymų paveiktomis ląstelėmis (žr. 19 pav.).

Gauti rezultatai parodo, kad furinais neaktyvuotą Sema3C bazinį domeną imituojanti forma (SCL) skatino kapiliarinį mikrovamzdelių sutankėjimą ir išvešėjimą, o furinais neaktyvuota forma (SWT) – pasižymėjo priešingu veikimu. Galima manyti, kad toks rekombinantų funkcinis skirtumas atsirado dėl SCL konkurencijos su VEGF dėl receptoriaus neuropilino, o SWT neturėjo atidengtos C galinės arginino amino rūgšties, per kurią būtų sąveikaujama su neuropilinais ir dėl to negalėjo nuslopinti VEGF poveikio. Kita vertus, nustatyti statistiškai patikimi skirtumai tarp SWT ir GST poveikio HUVEC ląstelėms, rodo, kad SWT ne tik, galimai, nekonkuruoja su VEGF, bet ir pats, iš dalies, skatina angiogenezę. Šie rezultatai tik dar kartą parodo Sema3C funkcinį kontraversiškumą, kadangi kitų mokslininkų darbai: pavyzdžiui, Mumblat su bendraautoriais (17), nustatė, kad pilno ilgio Sema3C slopino angiogenezę, o jo įkirpta forma prarado šį antiangiogeninį poveikį, o tai prieštarauja magistrinio darbo metu gautiems rezultatams. Tačiau reikia atkreipti dėmesį, kad Mumblat su bendraautoriais, tyrimuose naudojo Sema3C variantą, kuriame didžioji bazinio domeno dalis buvo pašalinta, taigi, ši detalė galėtų paaiškinti susidariusią rezultatų priešpriešą.

18 pav. HUVEC mikrokapiliarų tinklo įvertinimas „Image J“ programine įranga po 16 h. poveikio rekombinantiniais Sema3C variantais

Geltonais skaičiais žymimos mikrokapiliarų suformuotos akutės

19 pav. HUVEC mikrokapiliarų tinklo, paveikto rekombinantiniais Sema3C variantais, parametrų įvertinimas atliekant neporinį, abipusį t-testą (angl. unpaired two-tailed t-test)

* - statistiškai patikimas skirtumas (p<0,05)

3.4 Stabilios glioblastomos kultūros U87frt/tet ląstelių, turinčių FRT integracijos sritį, sukūrimas Glioblastomos U87tet ląstelės sėkmingai transfekuotos pFRT/lacZeo DNR plazmide ir kultivuotos iki atskirų 8 klonų susidarymo. Ląstelių atrankos eigoje, iš 8 klonų išgyveno ir buvo atrinkti 2 klonai, kiti klonai prarado gyvybingumą, mutavo arba atmetė transfekuotą plazmidę kultivavimo eigoje. Iš likusiųjų klonų pasirinktas daugiausiai perspektyvos turintis klonas nr. 6, remiantis β- galoksidazės testu (žr 20 pav.), kurio metu nustatytas transfekuotos pFRT/lacZeo plazmidės transkripcinis efektyvumas. Atrinktas klonas nr. 6 pasižymėjo:

1) Atsparumu atrankiniam zeocino antibiotikui.

2) Išlaikyta U87 ląstelių linijai būdinga morfologija bei gyvybingumo savybėmis.

3) β-galoksidazės sinteze, kuri indikuoja, kad ląstelėse sėkmingai įsintegravo flp rekombinazės atpažinimo sritis – FRT.

4) Aktyvia transkripcijos represoriaus tetR sinteze, kuri slopina eukariotinius raiškos vektorius

turinčius TO fragmentą citomegalo viruso promotoriuje

20 pav. U87frt/tet ląstelių šviesinio mikroskopo vaizdas (40x) po β-galoksidazės testo Po 2 h. inkubacijos, ląstelės, nesintetinančios β-galoksidazės ir neturinčios pFRT/lacZeo plazmidės savo genome, nenusidažo (vaizdas ląsteles inkubavus 0 h.), o ląstelės, sintetinančios β-galoksidazę ir

turinčios pFRT/lacZeo plazmidę savo genome, nusidažo (vaizdas ląsteles inkubavus 2 h.)

3.5 Glioblastomos kultūros U87frt/tet/GFP ląstelių sukūrimas

Transfekuotos pcDNA

/FRT/TO/GFP plazmidės integracija, į ląstelės genomą, pasiekta per

sėkmingai funkcionuojančią „Flp-In“ sistemą ir kartu transfekuotos pOG44 plazmidės koduojamą flp

rekombinazę. Ląstelėse, kuriose veikia ši sistema, eukariotinius raiškos vektorius, turinčius FRT seką,

integruoja, FRT sritį atpažįstanti, flp rekombinazė. Tokiu atveju, visose ląstelėse pasiekiama vienoda

plazmidės integracijos vieta genome. Konkrečiu atveju buvo sukurta kontrolinė, tetraciklinu

indukuojama ląstelių linija U87frt/tet/GFP (žr. 21 pav.), kuri bus naudojama kaip kontrolė ateities

darbams su ląstelių kultūromis Molekulinės neuroonkologijos laboratorijoje. Stabilių ląstelių kūrimas

įprastiniu būdu paprastai trunka, įskaitant individualių klonų atrankai reikalingą laikotarpį, apytikriai 6

savaites, tuo tarpu U87frt/tet/GFP stabilios linijos sukūrimas užtruko 12 dienų, kadangi individuali klonų

atranka „Flp-In“ sistemai nereikalinga. Apibendrinant šio tyrimo rezultatą, galima teigti, kad U87frt/tet

ląstelių linija veikia sėkmingai, ją ateityje bus galima efektyviai panaudoti kuriant neribotą skaičių U87

ląstelių linijų, koduojančių įvairius Sema3C baltymo variantus, kurių sintezę ląstelėse bus galima

vykdyti indukuojamu būdu.

21 pav. U87frt/tet/GFP ląstelių vaizdas pro mikroskopą (40x), šviečiant baltai šviesai ir 470 nm bangos ilgiui

A) nuotraukose matoma GFP sintezė po 24 h. inkubacijos terpėje su tetraciklinu ir GFP sintetinančių ląstelių kiekis.

B) nuotraukose nematoma GFP sintezė po 24 h. inkubacijos terpėje be tetraciklino

IŠVADOS

1. Restrikcinė analizė parodė, jog GST-MAX-SWT ir GST-MAX-SCL baltymus koduojantys bakteriniai vektoriai pGEX4T3/MAX/SCL ir pGEX4T3/MAX/SWT sukurti sėkmingai.

2. GST afininės chromatografijos metodu išgryninti baltymai buvo tirpūs, tačiau drauge su laukiamo 43,5 kDa dydžio GST-MAX-SWT ir GST-MAX-SCL rekombinantais buvo gauta mažesnio molekulinio svorio rekombinantų degradavimo produktų.

3. HUVEC mikrokapiliarų tinklų in vitro sistemoje GST-MAX-SWT poveikyje, lyginant su kontroliniu baltymu GST, mikrokapiliarų tinklas išvešėjo, tuo tarpu GST-MAX-SCL pasireiškė priešingu poveikiu. Tai patvirtina hipotezę, jog Sema3C bazinio domeno aktyvavimas furino kirpimu yra svarbus Sema3C funkcijai angiogenezės procese.

4. Sukurta stabili ląstelių linija U87frt/tet, koduojanti tetR represorių ir „Flp-In“ sistemos DNR

integracijos elementą FRT. Šios sistemos veikimas buvo patikrintas U87frt/tet ląstelių pagrindu

sukuriant stabilią U87 ląstelių liniją, indukuojamu būdu sintetinančią GFP baltymą. U87frt/tet linija

ateityje palengvins Sema3C rekombinantinius variantus koduojančių stabilių U87 ląstelių gavimą.

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

1) Atliekant tolimesnius tyrimus, reikia dar labiau optimizuoti baltymų indukcijos IPTG sąlygas, kad būtų sumažinama Sema3C degradacijos produktų ir padidinama išgryninto baltymo koncentracija.

Didžioji dalis degradacijos produktų, labiausiai tikėtina, atsiranda dėl Sema3C bazinio domeno nestabilumo. Norint sumažinti bazinio domeno irimo procesą sintezės metu reiktų koreguoti IPTG indukcijos temperatūrines sąlygas bei trukmę. Šio darbo metu buvo bandomos dvi IPTG indukcijos sąlygos: 1) 17 h. 25°C temperatūroje ir 2) 3 h. 35°C temperatūroje. Didesnė rekombinantų sintezė buvo gauta inkubuojant bakterijas 3 h. Tęsiant darbus reiktų pabandyti daugiau IPTG indukcijos temperatūros ir trukmės kombinacijų, pavyzdžiui: 10 h. 30°C; 5 h. 33°C ar 2 h. 37°C temperatūroje.

2) Nustatant furino proteazių įtaką Sema3C bazinio domeno funkcijai angiogenezėje, reikėtų kuo labiau supaprastinti rekombinantinių Sema3C variantų struktūrą, kad jie būtų panašesni į natūralias Sema3C bazinio domeno formas. Tai būtų galima pasiekti pašalinant GST fragmentą po rekombinantų išgryninimo GST afininės chromatografijos metodu. Darbe sukonstruotų rekombinantinių baltymų GST ir MAX bHLH-Zip domeno sandūroje yra proteazės trombino kirpimo motyvas, (54,55) taigi trombinu būtų galima atskirti GST fragmentą nuo MAX-SCL ir MAX-SWT rekombinantų ir pakartotinai praleisti baltymus pro GST afininės chromatografijos kolonėles. Kolonėlėse turėtų pasilikti nukirptas GST fragmentas, o neprikibę MAX-SCL ir MAX-SWT baltymai būtų surenkami (žr. 22 pav.).

3) Siekiant sukurti „Flp-In“ sistemą turinčias stabilias ląstelių linijas (t.y. kitokio tipo, nei U87),

reikėtų atrinkti ir išauginti mažiausiai 15 transfekuotų ląstelių klonų. Įterpus plazmidę koduojančią FRT

integracijos elementą į ląstelių genomą, ląstelės įgauna atsparumą atrankiniam antibiotikui ir taip

žinoma, kad transfekcija buvo sėkminga. Tačiau tik paskutiniame stabilių ląstelių atrankos etape

pamatoma, kaip efektyviai vyksta plazmidžių, įsiterpusių per FRT elementą, transkripcija. Išauginti

transfekuotų ląstelių klonai gali vizualiai atrodyti ir funkciškai elgtis vienodai, tačiau jų FRT elemento

įsiterpimo vieta genome gali kardinaliai skirtis – vienuose klonuose FRT gali būti įsiterpęs į genomą,

kur genų raiška prislopinta histonų metilinimu, o kituose – kur genų raiška skatinama histonų

acetilinimu. Todėl naudinga turėti atsarginių atrinktų ląstelių klonų, jei paaiškėtų, kad pasirinktasis

klonas tolimesniems darbams turi prislopintą FRT integracijos elementą.

22 pav. Rekombinantinių Sema3C variantų patobulinimo schema

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Eckel-Passow JE, Lachance DH, Molinaro AM, Walsh KM, Decker PA, Sicotte H, et al.

Glioma Groups Based on 1p/19q; IDH and TERT Promoter Mutations in Tumors. N Engl J Med [Internet]. 2015 Jun 25 [cited 2018 May 10];372(26):2499–508. Available from:

http://www.nejm.org/doi/10.1056/NEJMoa1407279

2. Ceccarelli M, Barthel FP, Malta TM, Sabedot TS, Salama SR, Murray BA, et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma.

Cell [Internet]. 2016 Jan 28 [cited 2018 May 10];164(3):550–63. Available from:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286741501692X

3. Ostrom QT, Bauchet L, Davis FG, Deltour I, Fisher JL, Langer CE, et al. The epidemiology of glioma in adults: a &quot;state of the science&quot; review. Neuro Oncol [Internet]. 2014 Jul [cited 2018 May 10];16(7):896–913. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24842956

4. Louis DN, Perry A, Reifenberger G, von Deimling A, Figarella-Branger D, Cavenee WK, et al.

The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System:

a summary. Acta Neuropathol [Internet]. 2016 Jun 9 [cited 2018 May 28];131(6):803–20.

Available from: http://link.springer.com/10.1007/s00401-016-1545-1

5. Clark MJ, Homer N, O’Connor BD, Chen Z, Eskin A, Lee H, et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet [Internet].

2010 Jan 29 [cited 2018 May 10];6(1):e1000832. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20126413

6. Yu S-C, Ping Y-F, Yi L, Zhou Z-H, Chen J-H, Yao X-H, et al. Isolation and characterization of cancer stem cells from a human glioblastoma cell line U87. Cancer Lett [Internet]. 2008 Jun 28 [cited 2018 May 10];265(1):124–34. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18343028

7. Alural B, Ayyildiz ZO, Tufekci KU, Genc S, Genc K. Erythropoietin Promotes Glioblastoma via miR-451 Suppression. Vitam Horm [Internet]. 2017 Jan 1 [cited 2018 May 10];105:249–71.

Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0083672917300237

8. Kozlov G, Perreault A, Schrag JD, Park M, Cygler M, Gehring K, et al. Insights into function of PSI domains from structure of the Met receptor PSI domain. Biochem Biophys Res Commun [Internet]. 2004 Aug 13 [cited 2018 May 13];321(1):234–40. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15358240

9. Koncina E, Roth L, Gonthier B, Bagnard D. Role of Semaphorins during Axon Growth and Guidance. 2013 [cited 2018 May 8]; Available from:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK6446/

10. Nasarre P, Gemmill RM, Drabkin HA. The emerging role of class-3 semaphorins and their neuropilin receptors in oncology. Onco Targets Ther [Internet]. 2014 [cited 2018 May 8];7:1663–87. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25285016

11. Nakamura F, Goshima Y. Structural and Functional Relation of Neuropilins. 2013 [cited 2018 May 10]; Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK6408/

12. Christie SM, Kim S-J, Toth PD, Muller-Greven J, Buck M, Smith AW. Interactions between the

Transmembrane Domains of Plexin, Semaphorin, and Neuropilin. Biophys J [Internet]. 2018

Feb 2 [cited 2018 May 28];114(3):72a–73a. Available from: