NATRIO DICHLOROACETATO POVEIKIO U87 MG GLIOBLASTOMOS LĄSTELIŲ NAVIKŲ RAIDAI ANT VIŠČIUKO EMBRIONO CHORIOALANTOJINĖS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS

Rūta Curkūnavičiūtė

NATRIO DICHLOROACETATO POVEIKIO U87 MG GLIOBLASTOMOS LĄSTELIŲ NAVIKŲ RAIDAI ANT VIŠČIUKO EMBRIONO CHORIOALANTOJINĖS

MEMBRANOS HISTOLOGINIS IR IMUNOHISTOCHEMINIS TYRIMAS Baigiamasis magistro darbas

Darbo vadovas prof. dr. Ingrida Balnytė Darbo konsultantas prof. habil. dr. Angelija Valančiūtė

Kaunas, 2019 m.

TURINYS

TURINYS ... 2

SANTRAUKA ... 4

ABSTRACT ... 6

PADĖKA ... 8

INTERESŲ KONFLIKTAS ... 9

SANTRUMPOS ... 10

ĮVADAS ... 12

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 14

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 15

1.1. Glioblastomos ypatybės ... 15

1.2. Varburgo efektas ... 16

1.3. Natrio dichloroacetato poveikis glioblastomos augliams ... 17

1.4. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos formavimasis, jos struktūra ir funkcijos ... 19

1.5. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelio privalumai onkologiniuose tyrimuose 20 1.6. Mutantinio p53 raiška glioblastomos audinyje ... 22

1.7. EZH2 onkogenezės žymuo ... 23

1.8. PLBA navikinių ląstelių proliferacijos žymuo ... 24

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 26

2.1. In ovo viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelis ... 26

2.2. U87 MG glioblastomos ląstelių kultivavimas ... 28

2.3. U87 MG glioblastomos ląstelių navikų suformavimas ant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos ... 29

2.4. Eksperimentinės grupės ... 30

2.5. In vivo biomikroskopija ir CAM nuėmimas ... 30

2.6. Medžiagos paruošimas histologiniam ir imunohistocheminiam tyrimui (įliejimas ir pjaustymas) 31 2.7. Dažymas hematoksilino ir eozino metodu ... 32

2.8. Imunohistocheminis dažymas ... 33

2.9. Histomorfometrinė analizė ... 35

2.10. Statistinė duomenų analizė ... 35

2.11. Naudotos medžiagos ir reagentai ... 36

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 38

3.1. In vivo biomikroskopija ... 38

3.2. Histologinis ir histomorfometrinis CAM tyrimas ... 42

3.3. Imunohistocheminė analizė ... 48

3.3.1. Mutantinio p53 baltymo raiška tirtų grupių navikų ląstelėse ... 48

3.3.2. EZH2 baltymo raiška tirtų grupių navikų ląstelėse ... 50

3.3.3. PLBA baltymo raiška tirtų grupių navikų ląstelėse ... 51

4. IŠVADOS ... 54

5. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 55

6. PRIEDAI ... 69

1 priedas – U87 MG ląstelių specifikacijos ... 69

SANTRAUKA

Magistro darbo autorius: Rūta Curkūnavičiūtė

Magistro darbo pavadinimas: NATRIO DICHLOROACETATO POVEIKIO U87 MG

GLIOBLASTOMOS LĄSTELIŲ NAVIKŲ RAIDAI ANT VIŠČIUKO EMBRIONO

CHORIOALANTOJINĖS MEMBRANOS HISTOLOGINIS IR IMUNOHISTOCHEMINIS TYRIMAS

Darbo tikslas – nustatyti natrio dichloroacetato (DCA) poveikį U87 MG glioblastomos navikų augimui, invazijai naudojant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos (CAM) modelį. Darbe histomorfometriškai vertintas DCA poveikis CAM, imunohistochemiškai vertintas DCA poveikis ant CAM suformuoto U87 MG glioblastomos naviko ląstelių proliferacijai, mutantinio p53 ir EZH2 baltymų raiškai ir jų raiškos ryšys su naviko progresavimu.

Tyrimui naudoti apvaisinti Cobb-500 veislės vištų kiaušiniai. 3-ią viščiuko embriono vystymosi parą kiaušinio lukšte buvo atidaryti langeliai, o 7-tą parą šalia stambiausios CAM kraujagyslės buvo persodintas suformuotas U87 MG glioblastomos ląstelių navikas. Tirtos trys eksperimentinės navikų grupės: 1) U87 MG negydyti kontroliniai glioblastomos ląstelių navikai, 2) gydytų 5 mM DCA ir 3) gydytų 10 mM DCA dozėmis U87 MG glioblastomos ląstelių navikai.

Vertinant DCA poveikį U87 MG glioblastomos ląstelių navikams, 9–12 embriono vystymosi paromis buvo atlikti in vivo biomikroskopiniai tyrimai. Nustatyta, kad negydyti U87 MG ląstelių navikai sukėlė ryškią angiogenezę: apie suformuotą naviką išryškėjo kraujagyslių suformuotas

„stipininis ratelis“; gydytų 5 mM DCA doze navikų angiogenezės slopinimas buvo ryškesnis, lyginant su 10 mM DCA grupe. Histomorfometriškai tirtose grupėse nustatytas DCA poveikis CAM, U87 MG negydytoje ir 10 mM DCA gydytoje navikų grupėje būdingas didžiausias chorioalantojinės membranos sustorėjimas (atitinkamai 219,1 ± 91,67 µm ir 254,4 ± 105,90 µm). Tai statistiškai patikimi rezultatai, lyginant su apvaisintų kiaušinių kontroline grupe (ant CAM nepersodintas navikas), p < 0,0001. CAM sustorėjimas susijęs su „pūslelių“ atsiradimu choriono epitelyje ir tankesne mezenchima. U87 MG kontrolinei negydytų navikų grupei būdingas didžiausias membranos mezenchimos sutankėjimas. Apvaisintų kiaušinių kontrolinėje grupėje (ant CAM nepersodintas navikas) pūslelių neaptikta. Histomorfometriškai įvertinus CAM epitelio vientisumą, nustatyta, kad U87 MG glioblastomos ląstelės pasižymi aukšta invazyvumo geba. Invazija kontrolinėje U87 MG grupėje nustatyta 88 proc. tirtų atvejų. U87 MG 5 mM DCA grupėje invazija į CAM buvo 7,20 proc.

atvejų, t.y statistiškai patikimai sumažėjo (p = 0,0001), U87 MG 10 mM DCA grupėje – 50 proc., t.y.

statistiškai patikimai sumažėjo (p = 0,044). U87 MG ląsteles paveikus 5 mM DCA ar 10 mM DCA

doze, mutantinių p53-teigiamų ląstelių raiška sumažėja: 5 mM DCA grupėje ji siekė 12 ± 6,26 proc., o

10 mM DCA – 14 ± 12,89 proc, t.y. statistiškai patikimas sumažėjimas lyginant su U87 MG kontroline grupe (atitinkamai, p = 0,008 ir p = 0,017). Lyginant su U87 MG kontrole, EZH2 raiška navike, paveikus DCA, mažėjo: 5 mM DCA grupėje EZH2-teigiamų ląstelių buvo 11 ± 14 proc. visų ląstelių navike (p = 0,004 ), o 10 mM DCA grupėje – 30 ± 25,79 proc. (p > 0,05). U87 MG ląstelių proliferacija tirtų DCA dozių poveikyje sumažėja: 5 mM DCA grupėje PLBA-teigiamų ląstelių buvo 20 ± 7,3 proc. visų ląstelių navike, o 10 Mm DCA grupėje – 21 ± 17 proc., t.y. statistiškai patikimai sumažėjo (atitinkamai p = 0,000 ir p = 0,002).

Tyrimas parodė, kad U87 glioblastomos navikų invazyvumas į CAM statistiškai patikimai

sumažėjo DCA poveikyje. 5 mM ir 10 mM DCA dozės slopino U87 MG glioblastomos ląstelių navikų

augimą ant CAM ir neoengiogenezę. Nustatytas naviko, o taip pat ir DCA, poveikis CAM storiui,

mezenchimos tankiui. Su naviko ksenotransplantacija susijęs pūslelių atsiradimas choriono epitelio

srityje. DCA slopina naviko ląstelių proliferaciją, mutantinio p53 ir EZH2 baltymų raišką gydytų

tirtomis DCA dozėmis U87 MG glioblastomos ląstelių navikuose, lyginant su negydytų DCA ląstelių

grupe, ir slopina naviko progresavimą.

ABSTRACT

Author of Master Thesis: Rūta Curkūnavičiūtė

Full title of Master Thesis: HISTOLOGICAL AND IMMUNOHISTOCHEMICAL RESEARCH OF SODIUM DICHLOROACETATE IMPACT ON 87 MG GLIOBLASTOMA CELL TUMOR DEVELOPMENT ON CHICK EMBRYO CHORIOALLANTOIC MEMBRANE

The aim of the study was to evaluate the effect of sodium dichloroacetate (DCA) on U87 MG glioblastoma tumor growth and invasion using chicken chorioallantoic membrane (CAM) model. The DCA effect on the tumor on CAM was evaluated histomorphometrically. Immunohistochemical analysis was carried out in order to evaluate the DCA effect on U87 MG tumor cell proliferation, mutant p53, and EZH2 protein expression and its relation to tumor progression.

Fertilized Cobb-500 chicken eggs were used for the study. On day 3 of embryo development, a small window was drilled in the eggshell. U87 MG tumor cells were grafted on CAM on the day 7 of embryo development. Three experimental groups of tumors were investigated: 1) U87 MG non- treated tumors (control), 2) treated with 5 mM DCA and 3) treated with 10 mM DCA doses.

In order to assess the effect of DCA to U87 MG tumors, in vivo biomicroscopy was carried out on days 9–12 of embryo development. Neoangiogenesis in U87 MG non-treated tumors was induced: the tumor was surrounded by newly formed blood vessels and a clearly expressed "spoked- wheel" pattern was present. The 5 mM DCA dose inhibited neoangiogenesis greater than 10 mM DCA did. DCA effect on CAM was assessed histomorphometrically: widespread thickening of CAM was observed in U87 MG and U87 MG 10 mM DCA groups (respectively 219.1 ± 10.96 µm and 254.4 ± 12.72 µm): it was statistically significant, compared with the CAM of fertilized egg control group (no grafted tumors on CAM; p < 0.0001). The thickening of CAM was related to appeared “vesicles“ in the chorionic epithelium. Essentially compaction of CAM mesenchyme was seen in the U87 MG group. No „vesicles“ were observed in the fertilized egg control group (no grafted tumor on CAM).

Histomorphometrically the integrity of chorionic epithelium was assessed and high invasion freqency

into CAM was determined in the U87 MG group. Invasion in the U87 MG group was 88 %, in U87

MG 5 mM DCA group it was 7.2 %, in U87 MG 10 mM DCA – 50 %: DCA treatment significantly

reduced tumor invasion into CAM (respectively p < 0.0001 and p = 0.044). DCA reduced the

expression of mutant p53 protein in tumor cells: in U87 MG 5 mM group expression was 12 ± 6.26 %,

in U87 MG 10 mM group – 14 ± 12.89 % of all cells in the tumor: compared with U87 MG control, it

was significantly reduced (respectively p = 0.008 and p = 0.017). When compared with U87 MG

control group, DCA treatment reduced the expression of EZH2 protein: in U87 MG 5 mM the

expression was 11 ± 14 % (p = 0.004), in U87 MG 10 mM group – 30 ± 25.79 % (p > 0.05) of all

tumor cells. DCA decreased the U87 MG tumor’s cell proliferation, compared with U87 MG control:

in U87 MG 5 mM group PCNA protein expression was 20 ± 7.30 %, in U87 MG 10 mM group – 21 ± 17 % of all tumor cells: it was reduced significantly (respectively p < 0.0001 and p = 0.002).

Conclusions. Study data show that DCA treatment significantly reduced the U87 MG tumor

invasion into CAM, inhibited tumor growth and neoangiogenesis. DCA and tumor had an effect on

the thickness of CAM and compaction of CAM mesenchyme. The development of „vesicles“ in the

chorionic epithelium was related to a tumor on CAM. DCA reduced tumor cell proliferation, mutant

p53 and EZH2 protein expression in tumor cells.

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju darbo vadovei prof. dr. Ingridai Balnytei už visapusišką pagalbą rengiant magistrinį darbą ir konstruktyvius patarimus.

Labai dėkoju darbo konsultantei prof. habil. dr. Angelijai Valančiūtei už atvertas duris į mokslo ir histologijos pasaulį, šiltą bendravimą ir profesinius patarimus.

Dėkoju prof. habil. dr. Donatui Stakišaičiui už pagalbą rengiant magistrinį darbą ir patarimus farmakologijos srityje.

Noriu padėkoti dr. Arūnui Kazlauskui už suteiktą ląstelių liniją ir vertingus patarimus dirbant su ląstelių kultūromis.

Esu dėkinga dr. Linai Šlekienei už pagalbą padedant įsisavinti darbo su viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modeliu metodikas.

Taip pat noriu padėkoti kolegėms Laurai Ribokaitei ir Mildai Juknevičienei už visapusišką palaikymą, kantrybę, patarimus, idėjas ir puikų bendradarbiavimą tyrimo metu.

Esu iš visos širdies dėkinga savo šeimai už palaikymą ir suteiktą galimybę eiti mokslo keliu.

INTERESŲ KONFLIKTAS

Autoriui interesų konflikto nebuvo.

SANTRUMPOS

17p13.1 17-osios chromosomos trumpasis petys Acetil-CoA Acetilo kofermentas A (angl. Coenzyme A)

ATP Adenozintrifosfatas (angl. Adenosine Triphosphate)

CAM Viščiuko embriono chorioalantojinė membrana (angl. Chick Embryo Chorioallantoic Membrane)

CNS Centrinė nervų sistema (angl. Central Nervous System) DCA Natrio dichloroacetatas (angl. Sodium Dichloroacetate)

DMEM Dulbecco‘s modifikuota Eagle mitybinė terpė (angl. Dulbecco‘s Modified Eagles Medium)

DMSO Dimetilsulfoksidas (angl. Dimethil Sulfoxide)

EZH2 Zeste homologo 2 stiprintojas (angl. Enhancer of Zeste Homolog) FBS Jaučio vaisiaus serumas (angl. Fetal Bovine Serum)

GBM Glioblastoma (angl. Glioblastoma)

GLUT1 Gliukozės transporteris 1 (angl. Glucose Transporter 1) H2K27me3 Histono H3 lizino 27 metilinimas

HIF- 1 Hipoksijos indukuojamas veiknys (angl. Hypoxia-inducible factor)

IACUC JAV Institucinis gyvūnų globos ir eksploatacijos komitetas (angl. The Institutional Animal Care and Use Committee)

IDH1/2 Izocitrato dehidrogenazės (angl. Isocitrate Dehydrogenase) 1 arba 2 genas IHC Imunohistochemija (angl. Immunohistochemistry)

K110me2 Lizino 110 metilinimas

LDH Pieno rūgšties dehidrogenazė (angl. Lactate Dehydrogenase)

MTP Mitochondrijų pralaidumo moduliacijos poros (angl. Mitochondrial Permeability Transition Pores)

NKCC Na ⁺ –K ⁺ –2Cl ^- kotransporteriai (angl. Sodium Potassium Chloride Cotransporter)

NADP ⁺ Nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas (angl. Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate)

NIH JAV Nacionalinis sveikatos institutas (angl. National Institutes of Health) PcG Polykombo grupės baltymai slopintojai (angl. Polycomb Group Protein Inhibitors)

PDH Piruvato dehidrogenazė (angl. Pyruvate Dehydrogenase)

PDK Piruvato dehidrogenazės kinazė (angl. Pyruvate Dehydrogenase Kinase)

PHGDH Fosfoglicerato dehidrogenazė (angl. Phosphoglycerate Dehydrogenase) PIP PLBA sąveikaujantis baltymas (angl. PCNA-interacting peptide)

PLBA Proliferuojančių ląstelių branduolių antigenas (angl. Proliferating Cell Nuclear Antigen)

PRC PcG baltymų grupės represiniai kompleksai (angl. Polycomb – repressive complexes)

PSO Pasaulinė sveikatos organizacija (angl. World Health Organisation)

PV Polimerazių precesyvumo veiksnys (angl. Polymerase Processivity Factor)

SLC5A8 Su natriu surištas monokarbksilato nešiklis (angl. Sodium-coupled

Monocarboxylate Transporter)

ĮVADAS

Lyginant su 2018 metais, 2019 metų duomenimis navikinių susirgimų pasaulyje padaugėjo 10 proc. [1]. Piktybiniai navikiniai susirgimai 2017 metais Lietuvoje buvo antroje pagal dažnumą mirties priežastis po kraujotakos sistemos ligų, mirtingumas nuo vėžio buvo 282,7 atvejo 1000 gyventojų.

2017 metais Lietuvoje užregistruoti 25346 nauji piktybinių navikų atvejai, o sergamumas siekė 896,1 atvejo 100000 gyventojų [2]. Sergamumas piktybiniais navikais yra aktuali ir opi visuomenės sveikatos problema.

Gliomos priskiriamos dažniausiai pasitaikančių centrinės nervų sistemos navikų grupei, o pusę naujai diagnozuotų gliomų atvejų sudaro pati agresyviausia smegenų naviko forma – glioblastoma (GBM) – astrocitinės kilmės difuzinė glioma [3]. Standartinis GBM gydymas apima chirurginį naviko pašalinimą, chemoterapiją (pirmos eilės pasirinkimo preparatas – temozolomidas) ir radioterapiją. Nežiūrint gydymo pažangos, GBM prognozė dažnai yra nepalanki, o pacientų išgyvenamumo vidurkis tesiekia 15–18 mėnesių nuo ligos diagnozavimo [3,4]. Chirurginį naviko pašalinimą apsunkina tai, kad dėl infiltracinio naviko augimo sunku atskirti sveiką smegenų audinį nuo navikinio, o pats navikas dažnai lokalizuojasi specializuotose smegenų vietose, atsakingose už kalbą, motorinę funkciją, jutimus [5]. Dėl difuzinių metastazių ir rezistentiškumo chemoterapijai glioblastomos dažnai atsinaujina [6,7]. Nepaisant naujausių chirurginio gydymo pasiekimų, ypač gydant atsinaujinančios glioblastomos atvejus, glioblastomos pacientų išgyvenamumas išlieka žemas [8].

Glioblastomai, kaip ir daugumai solidinių navikų, būdinga pakitusi navikinių ląstelių medžiagų apykaita, kuri apibūdinama Varburgo efektu. Tokie pokyčiai susiję su tuo, kad ir esant pakankamam deguonies kiekiui ir nepakankamai funkcionuojančioms mitochondrijoms, navikinės ląstelės nevykdo oksidacinio fosforilinimo (ląstelės kvėpavimo), būdingo sveikoms ląstelėms.

Energijos apykaitos pakitimams kompensuoti ląstelėse suintensyvėja aerobinės glikolizės ir pieno rūgšties fermentacijos procesai [9,10]. Nors toks metabolinis pokytis generuojant ATP energiją yra neefektyvus, tačiau jis palankus navikinėms ląstelėms: gaminama ne tik energija, bet ir lipidai, baltymai, nukleorūgštys, reikalingi dukterinių ląstelių formavimuisi ir proliferacijai. Taip pat, mitochondrijose gaminama daugiau aktyvių deguonies radikalų bei sukuriama rūgšti pH ekstraląstelinė mikroaplinka, kuri skatina navikinių ląstelių proliferaciją bei migraciją, taip pat slopina imuninės sistemos atsaką į naviką [11–13].

Kancerogenezė paprastai siejama su nekontroliuojamos ląstelių proliferacijos sutrikimu, bet dabar pateikiama vis daugiau tyrimų duomenų, kad navikų raida yra susijusi su pakitusia medžiagų apykaita, kuri kompensuoja nekontroliuojamai besidauginančių ląstelių energetinius poreikius [14].

Navikinių ląstelių metabolizmo ypatumai yra tyrinėjami kaip potencialus taikinys gydymui [15].

Natrio dichloroacetatas (DCA) yra piruvato dehidrogenazės kinazės inhibitorius [16], kurio poveikis aktyvina piruvato dehidrogenazės kompleksą ir vėžinėse ląstelėse paveikia aerobinės glikolizės ir pieno rūgšties fermentacijos procesus, slopina Varburgo efektą ir lemia navikinių ląstelių apoptozę [17,18]. Nustatyta, kad DCA slopina NKCC1 ir NKCC2 pernešėjus ir turi priešvėžinį poveikį [19].

DCA taikomas įgimtos ir įgytos pieno rūgšties acidozės (laktatacidozės) bei kitų mitochondrinių sutrikimų gydymui [20]. Žmogui skiriamas dozėmis 6,25 mg/kg kūno masės du kartus per parą DCA gali turėti priešvėžinį poveikį. Klinikiniuose tyrimuose DCA buvo tirtas gydant glioblastomą [21,22].

Nepaisant to, DCA terapinė priešvėžinė indikacija dar nėra registruota, nes reikalingi išsamūs terapinį pagrįstumą įrodantys ikiklinikinių tyrimų duomenys. Šiuo metu yra vykdomi DCA klinikiniai tyrimai gydant piktybiniais navikais sergančius ligonius [23,24].

Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos (CAM) modelis yra vertinga alternatyva eksperimentiniams graužikų modeliams tirti gliomos angiogenezę ir invazyvumą bei tiriamųjų vaistinių preparatų poveikį gliomos navikui in vivo. Lyginant su graužikų modeliais, CAM modelis išsiskiria nesudėtinga metodika, pigumu, trumpa eksperimento trukme bei etikos apribojimų nebuvimu. Taip pat galimas nuolatinis naviko, suformuoto ant CAM, stebėjimas in vivo biomikroskopija [25]. Be to, viščiuko embriono imuninė sistema susiformuoja tik 18-ąją vystymosi parą ir tai leidžia ant CAM 6–10 viščiuko vystymosi parą implantuoti žmogaus įvairių rūšių navikinių ląstelių navikus, kurios nesukelia atmetimo reakcijos [26,27].

Darbe tyrėme, kokį poveikį DCA turi CAM ir U87 MG glioblastomos ląstelių naviko,

suformuoto ant CAM, progresavimui bei invazijai į CAM. Imunohistocheminiais metodais vertinome

p53, PLBA ir EZH2 antigenų raišką U87 MG glioblastomos ląstelėse.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas

Įvertinti natrio dichloroacetato (DCA) poveikį U87 MG glioblastomos ląstelių suformuotų navikų progresavimui, invazijai, naudojant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos (CAM) modelį.

Darbo uždaviniai

1. Nustatyti DCA poveikį U87 MG glioblastomos ląstelių suformuotų navikų augimo ir invazyvumo į CAM pokyčius.

2. Histomorfometriškai įvertinti CAM pokyčius, susijusius su DCA poveikiu.

3. Nustatyti ir imunohistochemiškai įvertinti DCA poveikį suformuoto ant CAM U87 MG glioblastomos naviko ląstelių proliferacijai.

4. Imunohistochemiškai įvertinti DCA poveikį p53 ir EZH2 raiškai suformuoto naviko

ląstelėse bei jos ryšį su naviko progresavimu.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Glioblastomos ypatybės

Gliomos yra heterogeniška dažniausių centrinės nervų sistemos (CNS, angl. Central Nervous System) navikų grupė [28]. Viena būdingiausių šios navikų grupės savybių yra daugybė netipiškų kraujagyslių, kurios gausiai proliferuoja ir apima smegenų audinį [29]. Gliomos skirstomos į dvi kategorijas: 1) difuziniai navikai, kurie sudaro didžiąją dalį visų gliomų ir pasižymi infiltraciniu augimu į supančią CNS parenchimą; 2) nedifuziniai navikai. Histologiškai difuzinės gliomos gali būti astrocitinės ir oligodendroglialinės kilmės [30]. Pagal piktybiškumą difuzinės gliomos skirstomos į laipsnius: II (žemo), III (anaplazinės) ar IV (glioblastomos) [28].

Glioblastoma (GBM, angl. Glioblastoma) yra pati agresyviausia astrocitinės kilmės difuzinė glioma, kuri pagal PSO klasifikaciją priskiriama IV laipsniui [31,32]. Ji sudaryta iš genetiškai ir fenotipiškai heterogeniškų navikų grupių [33]. Tai yra pats dažniausias piktybinio CNS naviko tipas [34], kurio vidutinė išgyvenamumo trukmė siekia 15–18 mėnesių [35]. Tik apie 5 proc. pacientų išgyvena daugiau, nei 5 metus [36]. GBM sudaro 47,1 proc. piktybinių pirminių smegenų ir CNS navikų, 56,1 proc. visų gliomų ir 14,9 proc. visų smegenų ir CNS navikų. Per metus naujų susirgimo atvejų Jungtinėse Amerikos Valstijose skaičius siekia 3,2 atvejų 10000 gyventojų, o vidutinis diagnozavimo amžius yra 64 metai (8,9). GBM simptomai nespecifiniai: galvos skausmas, silpnumas, vėmimas, atminties sutrikimai, asmenybės sutrikimai, traukuliai, sutrikęs regėjimas [38].

Glioblastomos gali būti pirminės ir antrinės. Pirminės GBM sudaro apie 90 proc. visų glioblastomų atvejų. Jos susiformuoja greitai de novo iš normalių glijos ląstelių ir yra būdingos vyresnio amžiaus pacientams (12,13,14). Antrinės GBM formuojasi iš II ar III laipsnio astrocitomų.

Jos būdingos jaunesnio amžiaus pacientams, būdinga mažesnis nekrozės laipsnis, lokalizotuos priekinėje smegenų skiltyje, geresnė išgyvenamumo prognozė [30,40]. Morfologiškai pirminė ir antrinė GBM neturi jokių skirtumų, tačiau skiriasi jų genotipas. Remiantis naujausiais duomenimis pagal nuo kofermento nikotinamido adenino dinukleotido fosfato (NADP ⁺ , angl. Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) priklausomo izocitrato dehidrogenazės 1 (IDH1, angl. Isocitrate Dehydrogenase 1) geno mutacijos statusą, glioblastomos pradėtos skirstyti į IDH „laukinio“ tipo ir IDH – mutantines [30]. IDH1 geno mutacija būdinga antrinėms GBM [39]; ji yra laikoma molekuliniu GBM diagnostiniu žymeniu [41], taip pat svarbi nustatant vėžinės ligos prognozę bei individualias gydymo strategijas [42]. IDH1 geno mutacija yra siejama su TP53 geno mutacija antrinėse GBM [43].

Kol kas nėra veiksmingo GBM gydymo. Įprastai gydymą sudaro chirurginis naviko

pašalinimas, spindulinė terapija ir chemoterapija, dažniausiai temozolomidu. Beveik visiems

pacientams būdingas ligos atsinaujinimas [44]. GBM būdingas difuzinis augimas, įvairiais gydymo būdais neįmanoma pašalinti visų navikinių ląstelių, o chirurginis naviko pašalinimas nėra efektyvus, nes sunku atskirti ribas tarp naviko ir sveiko audinio [45]. Chemoterapijai vartojamas vaistas temozolomidas pasižymi ribotu praeinamumu per kraujo–smegenų barjerą, sisteminiu toksiškumu ir trumpu kraujo plazmos eliminacijos pusperiodžiu [46]. Taip pat, daugiau nei 90 proc. atvejų GBM atsinaujina, nes atsiranda atsparumas temozolomidui [45]. Atsinaujinus GBM, gydymo galimybės yra ribotos [47]. Be to, GBM ląstelės labai heterogeniškos, o tai mažina visų trijų paminėtų gydymo būdų veiksmingumą [48].

1.2. Varburgo efektas

Visos eukariotinės ląstelės apsirūpina energija vykdydamos oksidacinio fosforilinimo procesą mitochondrijose – ląstelės kvėpavimą. Šio proceso metu deguonies aplinkoje, oksiduojant gliukozės molekules, gaminama adenozintrifosfatas (ATP, angl. Adenosine Triphosphate), ir išskiriami medžiagų apykaitos produktai – anglies dioksidas ir vanduo [49,50]. Warburg pirmasis pasiūlė teoriją, kad visi vėžiniai susirgimai prasideda nuo ląstelinio kvėpavimo pažeidimo, todėl vėžio raida gali būti priskirima ir metabolinių sutrikimų patologijai [50]. Hipoksija būdinga daugumos navikų audiniui [51]. Dauguma vėžinių ląstelių kvėpavimą vykdo glikolizės būdu, nors aplinkoje ir yra deguonies.

Lyginant su normaliomis ląstelėmis, navikinės ląstelės aktyviau fermentuoja gliukozės metabolizmą į pieno rūgštį [49]. Šis fenomenas vadinamas Varburgo (angl. Warburg) efektu [52].

Aerobinės glikolizės metu iš vienos gliukozės molekulės susidaro 2 ATP molekulės, o oksidacinio fosforilinimo metu – 36 ATP molekulės [53]. Tai yra neefektyvus būdas generuoti ATP energiją aktyviai proliferuojančioms vėžinėms ląstelėms. Yra nustatyta, kad navikų mikroaplinkos ektraląstelinis pH yra rūgštesnis, lyginant su normalių audinių ekstraląsteliniu pH [54]. Navikinėse ląstelėse aerobinės glikolizės būdu pagaminama daug pieno rūgšties, kuri rūgština navikinių ląstelių mikroaplinkos pH. Išskirti H ⁺ iš naviko mikroaplinkos patenka į gretimus nepažeistus audinius sukeldami šių audinių remodeliavimą. Tai palengvina navikinių ląstelių invaziją į sveikus audinius, t.y.

metastazavimą, skatina proliferaciją, slopina jų apoptozę bei skatina angiogenezę [55–57]. Taip pat, dideli gliukozės kiekiai, naudojami aerobinei gliukozei, panaudojami vėžinių ląstelių proliferacijai anabolinių procesų metu [58]. Anglies atomai de novo naudojami nukleotidų, lipidų, baltymų gamybai, kadangi aerobinė glikolizė gali būti nukreipta įvairiais biocheminiais metabolizmo keliais [59].

Vienas būdų slopinant kancerogenezę yra naviko metabolizmo pakeitimas, aktyvuojant

vėžinių ląstelių mitochondrijas ir priverčiant glikolitinio fenotipo vėžines ląsteles kvėpuoti oksidacinio

fosforilinimo būdu, slopinant Varburgo efektą [52,60,61]. Glioblastomai, kaip daugumai piktybinių

navikų, būdingas glikolitinis fenotipas, ląstelėms aktyviau gaminant pieno rūgštį. Įrodyta, kad aukšto

glikolizės lygio navikai yra ne tokie jautrūs radioterapijai ir chemoterapijai ir yra agresyvesni [60,62].

Taip pat, Varburgo efektas yra susijęs su chemoterapijos ir radioterapijos sukeltu vėžinių ląstelių atsparumu citotoksiniam stresui [63]. Taigi, gydymo metodai, kurie blokuoja ar sumažina glikolitinį vėžinių ląstelių metabolizmą, gali padidinti šių ląstelių jautrumą radioterapijai ir chemoterapijai [9,60,61], sulėtinti navikų augimą ir sumažinti navikinių ląstelių išgyvenamumą [64].

1.3. Natrio dichloroacetato poveikis glioblastomos augliams

Hipoksija skatina kraujo kapiliarų formavimąsi, taip pat yra svarbi kraujagyslių sistemos formavimuisi embrionuose ir navikuose [65] bei energijos gamybai navikinėse ląstelėse [57].

Hipoksijos indukuojamas veiksnys 1 (HIF-1, angl. Hypoxia-inducible Factor) yra transkripcijos veiksnys, aktyvuojamas hipoksijos sąlygomis. Jis indukuoja gliukozės nešiklių ir fermentų, reikalingų glikolizei, gamybą [66]. Pavyzdžiui, HIF-1 indukuoja piruvato dehidrogenazės kinazės (PDK, angl.

Pyruvate Dehydrogenase Kinase) sintezę. PDK reguliuoja piruvato srautą į mitochondrijas, t.y.

inhibuoja fermentą piruvato dehidrogenazę (PDH, angl. Pyruvate Dehydrogenase) [67,68]. Vietoje oksidacinio fosforilinimo vyksta aerobinė glikolizė ir, veikiant fermentui laktodehidrogenazei (LDH, angl. Lactate Dehydrogenase), vyksta pieno rūgšties gamyba (1 pav.). PDH fermentas sujungia glikolizės ir Krebso ciklo metabolinius kelius, padeda transformuoti piruvatą į acetilo kofermentą A (acetil-CoA, angl. Coenzyme A). Stokojant PDH aktyvumo, piruvatas nepatenka į mitochondrijas ir slopinamas oksidacinis fosforilinimas, t.y. ląstelinis kvėpavimas. Jam nevykstant, negaminami reaktyvaus deguonies radikalai, nes hipoksijos sąlygomis elektronų transportas yra neefektyvus. Taigi, hipoksijos sąlygomis aktyvuotas HIF-1 savo ruožtu aktyvuoja PDK, kuris skatina glikolizę citoplazmoje ir piruvato metabolizmą į pieno rūgštį [57].

DCA –150 Da dydžio maža molekulė, kuri gali praeiti kraujo–smegenų barjerą. Tai tiriamasis

vaistinis preparatas, kurio taikinys yra mitochondrijos PDK, kurią inhibuojant taikomas gydyti pieno

rūgšties acidozei [57]. DCA slopina glikolitinį vėžinių ląstelių fenotipą, atsakingą už padidėjusią pieno

rūgšties gamybą ir pH sumažėjimą tarpląsteliniame tarpe [64].

1 pav. Aerobinės glikolizės ir oksidacinio fosforilinimo palyginimas, veikiant DCA.

Hipoksijos sąlygomis HIF-1 skatina aerobinę glikolizę (kairė pav. pusė) ir piruvato redukciją į pieno rūgštį, veikiant LDH. PDK inhibuoja PDH, slopinamas Krebso ciklas. DCA inhibuoja PDK, aktyvuoja

PDH, padidina piruvato srautą į mitochondrijas. Skatinama gliukozės oksidacija, navikinių ląstelių mitochondrijos aktyvuojamos. Atsidaro MTP, citochromas c (cyt c) išeina į citoplazmą, indukuojama

apoptozė, sulėtėja proliferacija ir naviko augimas (adaptuota pagal Michelakis ED, Webster L, Mackey JR) [57]

Nesmulkialąstelinio plaučių vėžio, krūties vėžio ir glioblastomos ląstelės, lyginant su normalių audinių ląstelėmis, turi hiperpoliarizuotas mitochondrijas, kurių funkcijos yra sumažėjusios [69]. Šis radinys pirmiausia buvo apibūdintas Chen tyrėjų grupės [70] 1988 metais. Tai siejama su mažu kiekiu reaktyvių deguonies radikalų navikinėse ląstelėse, kurie gaminami tik veikliose mitochondrijose [57]. Hiperpoliarizuotose mitochondrijose piruvatas negali į jas patekti ir pabaigti oksidacinio fosforilinimo proceso Krebso cikle [51,57]. DCA navikinėse ląstelėse inhibuoja fermentą PDK, taip aktyvuodamas fermentą PDH. To pasekoje padidėja piruvato srautas į mitochondrijas, per Krebso ciklą skatinama gliukozės oksidacija (oksidacinis fosforilinimas) [71] (1 pav.), sumažėja pieno rūgšties gamyba ir kaupimas [72]; navikinių ląstelių mitochondrijos yra depoliarizuojamos, jų membranų potencialas grąžinamas į normalių ląstelių lygį. Navikinių ląstelių mitochondrijose padidėja reaktyvių deguonies radikalų kiekis [73]. Oksidacinis stresas indukuoja apoptozę, o angiogenezė ir ląstelių proliferacija slopinama. DCA poveikio metu vyksta tokie procesai: proapoptozės mediatoriai, pvz., citochromas c, yra lokalizuoti mitochondrijose, o mitochondrijas depoliarizavus, atsidaro mitochondrijų pralaidumo moduliacijos poros (MTP, angl. Mitochondrial Permeability Transition Pores), mediatorių išlaisvinimas į citoplazmą yra susijęs su apoptozės indukcija [74,75] (1 pav.). Taip slopinamas naviko augimas [57,69,76,77].

Na ⁺ –K ⁺ –2Cl ^- (NKCC, angl. Sodium Potassium Chloride Cotransporter) pernešėjas valdo

Na ⁺ , K ⁺ , Cl ^- jonų pernašą per daugelio organizmo ląstelių plazminę memraną. Yra dvi NKCC

izoformos: NKCC1 ir NKCC2. NKCC1 aptinkama daugumoje organizmo ląstelių, o NKCC2 – inkstų

kanalėliuose [78]. Yra nustatyta, kad Na ⁺ ir Cl ^- jonai yra susiję su naviko progresavimu [79], o

NKCC1 pernėšėjas dalyvauja ląstelės ciklo reguliavime, valdo ląstelės tūrį [80]. 2018 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Histologijos ir embriologijos katedros J. Stanevičiūtė ir kt. [19] nustatė DCA slopinamąjį poveikį NKCC1 ir NKCC2 pernešėjams. Nustatyta, kad DCA slopina NKCC2 ekspresiją žiurkių inkstuose ir NKCC1 RNR ekspresiją čiobrialiaukėje, dėl to mažėja žiurkių, gydytų DCA, čiobrialiaukės ląstelių proliferacija, liaukos svoris. NKCC1 slopinimas sumažina intraląstelinio Cl ^- kiekį. DCA skatina Na ⁺ ir Cl ^- jonų išsiskyrimą su žiurkių šlapimu.

Dauguma navikų tipų pasižymi glikolitiniu fenotipu, todėl DCA poveikis gali būti tiriamas įvairiems navikams. Ikiklinikiniai tyrimai leidžia galvoti, kad DCA priešvėžinis poveikis nesmulkialąstelinio vėžio, krūties vėžio, glioblastomos, endometriumo ir prostatos vėžio atvejais yra tikėtinas. Tam reikalingi tolimesni ikiklinikiniai tyrimai [57,75,81].

1.4. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos formavimasis, jos struktūra ir funkcijos

Viščiuko embriono chorionoalantojinė membrana (CAM) (angl. Chick Embryo Chorioallantoic Membrane) yra ekstraembrioninė membrana [25], kuri atlieka įvairias gyvybines funkcijas [82]. Pagrindinės CAM funkcijos yra: kvėpavimo (deguonies ir anglies dioksido mainai), embriono medžiagų apykaitos produktų, ankstyvuoju vystymosi periodu šlapalo, vėliau šlapimo rūgšties, saugykla, natrio jonų ir druskų apykaita, kalcio pernešimas iš kiaušinio lukšto į kaulus, jų mineralizacijos proceso metu [83–85].

CAM pradeda formuotis 3–4 embriono vystymosi parą susiliejant choriono ir alantojo mezodermų sluoksniams (2 pav.) [82,84]. Ji pamažu didėja ir 16-tą vystymosi parą padengia visą trynio maišą bei prisijungia prie kiaušinio lukšto vidinės membranos [82].

2 pav. Makroskopinis CAM vaizdas. a – 4-tą embriono vystymosi parą matoma gausiai vaskuliarizuota CAM (rodyklė), besiplečianti iš epigastriumo ir trynio maišo membrana (YSM);

b – 12-ta vystymosi para, ex ovo embrionas yra 10 cm ² dydžio, matomas reikšmingas CAM ploto padidėjimas (Nowak-Sliwinska P, Segura T, Iruela-Arispe ML) [85]

Histologiškai CAM sudaro trys sluoksniai: ektoderma – choriono epitelis, prisitvirtinęs prie

kiaušinio lukšto vidinės membranos, endoderma (alantojo epitelis) ir vidurinis mezodermos sluoksnis,

kuris skiria ektodermą ir endodermą (3 pav.) [26,82]. CAM mezodermos sluoksnis turi didelį kraujagyslių tinklą, prie kurio jungiasi porinės alantojo arterijos ir venos. Jos sujungtos su embriono kraujo cirkuliacija [82,84,86]. Mezoderma taip pat gausi stromos komponentų [26].

3 pav. Mikroskopinis CAM vaizdas (trys sluoksniai).

CE – choriono epitelis (ektoderma), prisitvirtinęs prie kiaušinio lukšto vidinės membranos;

M – vidurinis mezodermos sluoksnis, kuriame yra kraujo kapiliarai (K); AE – alantojo epitelis (endoderma), kuris supa alantojaus ertmę. Didinimas – 40 ´ , skalė – 20 μm

1.5. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelio privalumai onkologiniuose tyrimuose

Viščiuko embriono chorioalantojinė membrana yra patvirtintas modelis eksperimentinėje onkologijoje [87], naudojamas tirti naviko augimui, metastazavimui, žaizdų gijimui, įvairių vaistų poveikiui, angiogenezei, kraujagyslių biologijai ir invazyvumui bei virusų augimui [84,85,88–92]. Jis yra paprastas, patikimas, lengvai pakartojamas ir pigus [83,84].

Viščiuko embriono chorioalantojinė membrana yra gausiai vaskuliarizuota, todėl ant jos paviršiaus transplantuotas bioptatas ar navikinių ląstelių suformuoti navikai lengvai prigyja ir vystosi (4 pav.) [93]. Medžiaga iš smegenų, aortos, šlaunikaulio, stemplės, diafragmos, gerklų, trachėjos bei kamieninių ląstelių suspensijos buvo perkelta ant CAM paviršiaus ir tirta angiogenezė (45–47, 54–57).

CAM modelis naudojamas tirti įvairių vaistų poveikį glioblastomos ląstelėms [91,107–109]. Metodas

patogus tuo, kad galimas neinvazyvus naujų kraujagyslių identifikavimas ir nuolatinis stebėjimas in

vivo biomikroskopijos būdu. Lyginant su žinduolių modeliais, kur naviko augimas trunka 3–6 savaites,

naudojant CAM modelį, transplantatai tampa vizualiai matomi 2–5 parą po užsodinimo [82]. Tiriant

metastazavimą, naudingas histologinis CAM tyrimas, nes galima tirti navikinių ląstelių migraciją nuo

išorinio CAM sluoksnio choriono epitelio iki viduriniosios mezenchimos [93].

4 pav. CAM vaizdas (tyrimo metu). Vėžinių ląstelių suspensija užsodinta ant viršutinės embriono CAM (Crespo P, Casar B) [110]

Dar vienas CAM modelio privalumas yra tai, kad darbas su viščiukų embrionais nereikalauja iki 17-osios vystymosi paros įgyti bioetikos leidimą eksperimentams su gyvūnais. Eksperimentai yra baigiami iki su skausmu susijusių centrų viščiuko embriono smegenyse susiformavimu [84].

Jungtinėse Amerikos valstijose Institucinis gyvūnų globos ir eksploatacijos komitetas (IACUC, angl.

The Institutional Animal Care and Use Committee) ir Nacionalinis sveikatos institutas (NIH, angl.

National Institutes of Health) yra nustatę, kad iki 14-osios vystymosi paros viščiuko embrionai nejaučia skausmo ir gali būti naudojami moksliniams eksperimentams be jokių bioetikos institucijų apribojimų. Tokiomis nuostatomis vadovaujamasi visame pasaulyje.

Viščiuko embrionas neturi susiformavusios imunokompetentinės sistemos, todėl galimos skirtingų rūšių gyvūnų įvairių audinių transplantacijos ant CAM paviršiaus, kurios nesukelia atmetimo reakcijos [82,93]. Murphy tyrėjų grupė įrodė [111], kad transplantuoti žiurkių audiniai negali augti suaugusiose vištose, bet jie auga ant CAM paviršiaus iki 18-osios embriono vystymosi paros.

Suaugusių vištų imuninė sistema sudaryta iš humoralinio ir ląstelinio imuniteto. Humoralinio imuniteto B ląstelės bręsta fabricijaus maišelyje (paukščių limfoepitelinis organas), o ląstelinio imuniteto T limfocitai užkrūčio liaukoje [112,113]. Viščiuko embriono imuninė sistema pradeda vystytis tik po dviejų savaičių nuo apvaisinimo pradžios [114,115]. T ląstelės aptinkamos 11-ąją embriono vystymosi parą [116], o 18-ąją parą imunitetas laikomas susiformavusiu [114,115]. Trynio maiše, blužnyje, fabricijaus maišelyje, kepenyse ir užkrūčio liaukoje 10-ąją vystymosi parą aptinkami monocitai, o 12-ąją – makrofagocitai [116]. Taigi, imuninės sistemos neturėjimas leidžia viščiuko CAM modelį naudoti žmogaus vėžinių ląstelių ir navikų transplantatų ant CAM paviršiaus tyrimams.

Yra keletas CAM modelio trūkumų: dauguma vėžinių ląstelių negali suformuoti telkinių antriniuose organuose dėl trumpo eksperimento laiko nuo inkubacijos pradžios iki išsiritimo. Nors viščiuko embrionas neturi imunokompetentinės sistemos, stebimas nespecifinis imuninis atsakas – uždegimas [82,93]. Be to, angiogenezės tyrimą dalinai apsunkina tai, kad ant CAM yra anksčiau susiformavusių kraujo kapiliarų, kuriuos sunku atskirti nuo naujai susiformavusių [27].

Yra nustatytas gydymo DCA efektyvumas CNS navikams in vivo tiriant graužikų modelius (1

lentelė). Vella ir kt. [117] nustatė, kad DCA gydymas reikšmingai 55 proc. sumažino SKNBE2 ląstelių

ksenografto naviko tūrį pelėse, o Morfouace [77] tyrėjų grupė parodė, kad P7 ląstelių ksenografto tūris pelėse po gydymo DCA reikšmingai sumažėjo 53 proc. (p < 0,05), lyginant su atitinkamų ląstelių ksenograftų negydytomis kontrolėmis. Žiurkių 9L [118] ir pelių U373 [119] ląstelių alograftiniuose modeliuose DCA prailgino tiriamųjų gyvųnų išgyvenimo trukmę, tai statistiškai patikimi rezultatai lyginant su kontrole. DCA poveikis pelių U87 MG alograftų navikų tūriui nebuvo nustatytas [120].

Priešvėžiniam DCA poveikiui įrodyti reikalingi išsamūs ikiklinikiniai tyrimai, o pateikti 1 lentelėje graužikų eksperimentiniai modeliai in vivo yra riboti, nes, skirtingai nuo CAM modelio, negalimas in vivo biomikroskopinis tyrimas, neoangiogenezės tyrimai. 1 lentelėje pateikiami literatūroje rasti DCA veiksmingumo tyrimai in vivo.

1 lentelė. DCA gydymo efektyvumo tyrimai CNS navikams in vivo

Tirtas

gyvūnas CNS navikų

transplantuotos ląstelės DCA poveikis Šaltinis

Pelės, nude SKNBE2 ksenograftas Sumažėjo naviko tūris Vella, 2012 [117]

Pelės, nude P7 ksenograftas Sumažėjo naviko tūris Morfouace, 2014 [121]

Žiurkės 9L alograftas Prailgėjo išgyvenimo trukmė Wicks, 2015 [118]

Pelės U373 alograftas Prailgėjo išgyvenimo trukmė Velpula, 2017 [119]

Pelės U87 MG alograftas Nebuvo Albatany, 2018 [120]

1.6. Mutantinio p53 raiška glioblastomos audinyje

Onkogenezė yra procesas, kurio metu vyksta normalių ląstelių genetiniai pokyčiai ir piktybėjimas [122]. Kancerogenezės metu pradedami gaminti mutantiniai nefunkcionuojantys baltymai. TP53 – žmogaus navikinėse ląstelėse mutuojantis genas [123]. Laukinio tipo (normalus) TP53 yra genas, atliekantis naviko slopinimo ir transkripcijos veiksnio funkciją, dar vadinamas

„genomo saugotoju“ [124]. Pas žmogų jis yra lokalizuotas 17-osios chromosomos trumpajame petyje

(17p13.1) [125]. Esant DNR pažaidai, hipoksijai, maisto medžiagų trūkumui ląstelėse, p53 baltymas

aktyvina ekspresiją genų, atsakingų už ląstelės ciklo reguliaciją, apoptozę bei DNR pažaidų taisymą

[126]. Kai DNR pažeidimas yra minimalus, p53 sužadina DNR taisos mechanizmus ir ląstelės ciklo

stabdymo mechanizmus. O kai pažeidimas yra didesnio pobūdžio, p53 sukelia ląstelės apoptozę,

autofagiją ir senėjimą [127]. Taip p53 apsaugo organizmą nuo DNR klaidų plitimo ir naviko vystymosi [128].

Laukinio tipo p53 ląstelėse teigiamai reguliuoja oksidacinį fosforilinimą mitochondrijose.

Atvirkščiai, mutantinis p53 ląstelėse skatina aerobinę glikolizę citoplazmoje per gliukozės transporterio 1 (GLUT1, angl. Glucose Transporter 1) kiekio didinimą plazminėje membranoje [129,130]. Taip skatinamas Varburgo efektas, naviko vystymasis progresuoja [131]. Normoje laukinio tipo p53 baltymo kiekis ląstelėje yra mažas. Esant stresinėms sąlygoms, padidėja laukinio ir mutantinio tipo p53 baltymų raiška. Todėl padidėjusi p53 ekspresija naviko audiny laikoma piktybiškumo požymiu; mutantinis p53 svarbus onkogenezės eigai [132].

Gliomoms būdinga geno TP53 mutacija [133]. Recidyvuojamčioms GBM būdinga padidėjusi mutantinio p53 baltymo raiška [134]. Shai ir kt. [135] ištyrė 67 negydytų GBM auglių genomą ir nustatė, kad U87 glioblastomos ląstelių linijos TP53 genas yra neaktyvus mutantinio tipo. Žmogaus glioblastomoje TP53 geno mutacijos yra labai dažnos [136], kas yra susiję su sutrikusiu ląstelių gebėjimu taisyti DNR pažaidas ir su aktyvesne tumorogeneze [127]. Sutrikusi TP53 geno funkcija susijusi su GBM rezistentiškumu gydymui [137].

1.7. EZH2 onkogenezės žymuo

Epigenetinių procesų metų vyksta ląstelių diferenciacija į struktūriškai ir funkciškai specializuotas ląsteles [138]. Šie procesai apima DNR metilinimą ir potransliacines histonų modifikacijas. Histonų modifikacijos apima mechanizmą, vadinamą „histonų kodu“ [139]. Šis kodas yra užšifruotas baltymų kompleksų, kurie specifiškai atpažįsta ir sujungia modifikuotus histonus [140].

Polykombo (PcG, angl. Polycomb) grupės baltymai slopintojai yra pagrindiniai minėtų procesų epigenetiniai reguliatoriai, gebantys formuoti chromatiną modifikuojančius kompleksus, slopinti specifinių genų raišką bei svarbūs kancerogenezei [140,141]. Jie slopina RNR transkripciją, svarbūs genų ekspresijos reguliatoriai [142], būtini embriono ir suaugusio individo kamieninių ląstelių diferenciacijai [140,143]. Navikuose šių procesų reguliavimas yra sutrikęs [141].

PcG baltymų grupę sudaro du kompleksai (PRC, angl. Polycomb-repressive Complexes):

PRC1 ir PRC2. Vienas PRC2 katalitinių komponentų yra epigenetinis reguliatorius Zeste homologo 2 stiprintojas (EZH2, angl. Enhancer of zeste homolog). Jis skatina histono H3 lizino 27 metilinimą (H2K27me3) ir slopina specifinio geno transkripciją [144,145].

Nors PcG baltymų grupė svarbi ląstelių regeneracijai ir diferenciacijai, kai kurie šios grupės

komponentai yra onkogenai: EZH2 raiška padidėjusi daugumoje auglių [145], tarp jų ir glioblastomoje

[146]. Nustatyta, kad padidėjusi EZH2 raiška GBM yra piktybiškumo laipsnio ir blogos

išgyvenamumo prognozės rodiklis, o EZH2 slopinimas vėžinėse ląstelėse slopina naviko augimą

[147,148]. EZH2 dalyvauja kancerogenezėje, svarbus progresavimo, metastazavimo bei besiformuojančio vėžio atsparumo vaistams žymuo [145]. EZH2 „nutildo“ genus-slopintojus per histono H3 lizino 27 metilinimą (H2K27me3) ir turi įtakos vėžio raidai. EZH2 yra glioblastomos ir kitų piktybinių navikų diagnostinis žymuo [141].

1.8. PLBA navikinių ląstelių proliferacijos žymuo

Genomo duplikacija, chromatino ir jo epigenetinės informacijos dauginimas yra mechanizmai, kurie užtikrina genomo vientisumą ir genetinės informacijos perdavimą palikuonims.

Nehistoninis baltymas proliferuojančių ląstelių baltymų antigenas (PLBA, angl. Proliferating Cell Nuclear Antigen) yra vienas iš svarbių eukariotų DNR metabolizmo baltymų, dalyvaujantis replikacijos, rekombinacijos, reparacijos ląstelės procesuose. PLBA replikacijos procese dalyvauja kaip polimerazių precesyvumo veiksnys (PV, angl. Polymerase Processivity Factor). Daugelis ląstelės baltymų, dalyvaujančių replikacijoje, sąveikauja su PLBA. PLBA eukariotuose yra trimeras, sudarytas iš trijų vienodų (žmogaus ląstelėse – 36 kDa) monomerų, kurie yra susijungę į žiedą su ertme viduryje (5 pav.) [149–151]. PLBA žiedas apsupa DNR ir tvirtai prijungia polimerazes prie DNR. Šis baltymas yra „platforma“, prie kurios jungiasi polimerazės ir kiti baltymai, svarbūs įvairiems DNR metaboliniams procesams [152]. PLBA neleidžia DNR polimerazei disocijuoti nuo DNR bei didina DNR sintezės greitį [153].

5 pav. PLBA struktūra. Schematinis žmogaus trimerinio PLBA žiedo vaizdas, kuriame 3 skirtingi monomerai pavaizduoti skirtingomis spalvomis. Žiedo viduryje ertmė (De Biasio A, Campos-Olivas R,

Sánchez R, López-Alonso JP, Pantoja-Uceda D, Merino N, et al.). [154]

2018 metais Peng ir kt. nustatė [155], kad EZH2 tiesiogiai jungiasi prie PLBA. Iki šiol buvo žinoma, kad EZH2, kaip histonų metiltransferazė, yra būtinas ląstelių proliferacijai. Nustatyta, kad EZH2 tiesiogiai jungiasi prie PLBA per PIP (PLBA sąveikaujantis baltymas, angl. PCNA-interacting Peptide) sritį ir skatina lizino 110 metilinimą (K110me2). Peng ir kt. nustatė, kad šis metilinimas yra svarbus PLBA trimero stabilizavimui. Šie tyrimai nustatė mechanizmą, kuriuo epigenetiniai reguliatoriai kontroliuoja DNR replikaciją.

Diagnostikai dažniausiai naudojami kiekybiniai metodai nustatyti ląstelių proliferacijai yra

imunohistocheminiai (IHC, angl. Immunohistochemistry), o vienas iš žymenų yra PLBA [156]. Vienas

būdų įvertinti ląstelių proliferaciją gliomoje yra PLBA antigeno raiška [157]. PLBA būdingas

padidėjimas ląstelės ciklo G 1 ir S fazėse [158]. PLBA baltymas yra būtinas nukleorūgščių

metabolizmui [159]. PLBA ekspresija vyksta tik proliferuojančiose ląstelėse, ji siejama su

metastazavimu, naviko piktybiškumo laipsniu [160]. Yra ryšys tarp PLBA raiškos padidėjimo

astrocitomoje, oligoastrocitomoje ir didesnio naviko piktybiškumo laipsnio bei sumažėjusio pacientų

išgyvenamumo [161,162]. PLBA ekspresija gydytuose glioblastomos augliuose yra mažesnė, nei

kontroliniuose [163].

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA

2.1. In ovo viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelis

Cobb 500 veislės apvaisinti vištų kiaušiniai (įsigyti Rumšiškių (buvusiame Dovainonių) paukštyne), patalpinami į Maino Enrico kiaušinių inkubatorių (6 pav.), kuriame palaikoma 37 °C temperatūra ir 60 proc. santykinė oro drėgmė. Tris paras nuo kiaušinių patalpinimo į inkubatorių, jame veikiantis sietų vartymo režimas palaiko 1 k./val. vartymo ciklą.

6 pav. Tiriamieji Cobb 500 veislės apvaisinti vištų kiaušiniai su atidarytais langeliais lukšte Maino Enrico inkubatoriuje

Trečiąją parą nuo inkubacijos pradžios yra išjungiamas kiaušinių vartymo režimas ir

atidarinėjami kiaušinių langeliai. Lukštai dezinfekuojami 70 proc. etilo alkoholio tirpalu. Bukajame

kiaušinio gale, kur yra susiformavęs oro tarpas, mechaniniu greitaeigiu grąžtu kiaušinio lukšte

išgręžiama apvali skylutė (7 pav. A). Pro ją steriliu švirkštu yra nusiurbiama 2 ml baltymo, kad

chorioalantojinė membrana atkibtų nuo kiaušinio lukšto vidinės pusės ir besivystantis embrionas

nebūtų mechaniškai sužalotas atidarinėjant langelį lukšte.

7 pav. Kiaušinių langelių atidarymo vaizdai 3-iąją viščiuko embriono inkubacijos parą. A –

langelių atidarymo metu bukajame kiaušinio gale, kur susiformavęs oro tarpas, greitaeigiu mechaniniu grąžtu išgręžta apvali skylutė; B – atidarytas langelis kiaušinio lukšte

Atkabinus CAM nuo vidinės kiaušinio lukšto pusės, mechaninio greitaeigio grąžto pagalba kiaušinio lukšte išgręžiami 1 cm ² ploto kvadrato formos langeliai. Pašalinamas kiaušinio lukštas ir po juo esanti vidinė kiaušinio lukšto membrana (7 pav. B). Įvertinama, ar kiaušinis yra apvaisintas ir embriono gyvybingumas. Jeigu embrionas yra gyvas, akimi matomas širdies pulsavimas, besiformuojantis kraujagyslių tinklas, o stereomikroskopo pagalba galima stebėti eritrocitų judėjimą embriono kraujagyslėmis. Neapvaisinti kiaušiniai ir negyvi embrionai eliminuojami iš tyrimo.

Apvaisinti kiaušinių su gyvybingais embrionais langeliai uždengiami sterilia permatoma plėvele, pagaminta iš plastiko, ir užklijuojami steriliu medicininiu pleistru (8 pav.). Ši plėvėlė apsaugo nuo kiaušinio išdžiuvimo, bakterinės ir mechaninės taršos. Kiaušiniai patalpinami į inkubatorių tolimesniam tyrimui. 7-tą inkubacijos parą ant CAM, šalia stambiausios kraujagyslės, yra užsodinamos U87 MG glioblastomos ląstelių suformuotas navikas.

8 pav. 3-ią viščiuko embriono inkubacijos parą kiaušinyje atidarytas langelis, uždengtas

sterilia plėvele ir užklijuotas steriliu pleistru

2.2. U87 MG glioblastomos ląstelių kultivavimas

U87 MG glioblastomos epitelinės kilmės adherentinė ląstelių linija, išvesta iš moters piktybinės gliomos, pelėse formuoja piktybinius auglius – glioblastomas (1 priedas).

Ląstelės saugomos šaldiklyje kriomėgintuvėliuose -80 °C temperatūroje. Norint jas atšildyti ir padauginti tolimesniems tyrimams, mėgintuvėlis su ląstelėmis patalpinamas į 37 °C vandens vonelę.

Ląstelių šaldymo terpės sudėtyje yra dimetilsulfoksido (DMSO, angl. Dimethil Sulfoxide), kuris yra citotoksiškas, todėl nedelsiant atšildytos ląstelės laminare steriliomis sąlygomis perkeliamos į centrifuginį konusinį mėgintuvėlį su 9 ml Dulbecco‘s modifikuotos Eagle (DMEM, angl. Dulbecco‘s Modified Eagles Medium) mitybinės terpės, papildytos 2 proc. L-gutamino aminorūgštimi, 10 proc.

jaučio vaisiaus serumu (FBS, angl. Fetal Bovine Serum), antibiotikais penicilinu (100 U/ml) ir streptomicinu (0,1 mg/ml); centrifuguojama 1000 apsisukimų per minutę greičiu, 5 min., 37 °C temperatūroje. Supernatantas yra nupilamas, o nuosėdos resuspenduojamos 1 ml mitybinės DMEM terpės ir disperguojamos pipetuojant. Tuomet ląstelių suspensija užsėjama į 75 cm ² talpos ląstelių auginimo indą, kuriame yra 25 ml DMEM terpės. Ląstelių kultūra laikoma inkubatoriuje, kuriame palaikoma 37 °C temperatūra ir 5 proc. CO 2 koncentracija.

Mitybinė terpė keičiama 2 kartus per savaitę ir palaikomas eksponentinis ląstelių augimas (9 pav. pavaizduotas 10´ padidintas U87 MG glioblastomos ląstelių vaizdas, nufotografuotas panaudojant invertuotą mikroskopą). Kai 80 proc. ląstelių auginimo indo paviršiaus padengia ląstelių monosluoksnis, ląstelės yra persėjamos.

9 pav. U87 MG glioblastomos ląstelės, prikibusios prie auginimo indo paviršiaus.

Skalė – 200 µm

2.3. U87 MG glioblastomos ląstelių navikų suformavimas ant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos

Norint U87 MG glioblastomos ląsteles panaudoti tolesniems tyrimams arba persėti, laminare steriliomis sąlygomis iš ląstelių auginimo indo yra nupilama mitybinė terpė. Kad pašalinti jos likučius, priešinga indo sienele, nei yra navikinių ląstelių monosluoksnis, pilama 5 ml fosfatinio buferio druskų tirpalo (PBS, angl. Phosphate Buffered Saline), nupilant į atliekų indą. Tuomet, norint nuo auginimo indo paviršiaus atkabinti ląstelių monosluoksnį, ant jo pilama 10 ml tripsino tirpalo (10´

koncentracija) ir 5 min. laikoma inkubatoriuje, kuriame palaikoma 37 °C temperatūra ir 5 proc. CO 2

koncentracija. Kad patikrinti ar ląstelės atkibo nuo indo paviršiaus, pasitelkiamas invertinis mikroskopas. Juo turi būti matomos suapvalėję ląstelės, o pajudinus ląstelių auginimo indą, jos turi laisvai plaukioti mitybinėje terpėje. Ląstelėms atkibus, kad inaktyvuoti tripsino poveikį, į auginimo indą pilama 10 ml mitybinės DMEM terpės. Tuomet gauta suspensija perpilama į 50 ml talpos konusinį centrifuginį mėgintuvėlį ir centrifuguojama 1000 apsisukimų per minutę greičiu 5 min. 37 °C temperatūroje. Supernatantas yra nupilamas, o nuosėdos resuspenduojamos 1 ml mitybinės DMEM terpės ir disperguojamos pipetuojant.

Panaudojant hematocitometro kamerą yra nustatomas ląstelių skaičius, o su tripano mėlio (TM, angl. Trypan Blue) dažu nustatomas ląstelių gyvybingumas. Pirmiausia paruošiama hematocitometro kamera: ant jos uždedamas dengiamasis stiklelis taip, kad matytųsi Niutono žiedai.

Tuomet 10 µl gautos ląstelių suspensijos ir 10 µl TM dažo (santykiu 1:1) sumaišoma ant dengiamojo stiklelio ir automatinės pipetės pagalba įleidžiama į paruoštą hematocitometro kamerą. Invertuojančiu mikroskopu 4´ padidinimu skaičiuojamos gyvos (mėlynai nenusidažę) ląstelės visuose keturiuose kvadratuose, kurie kiekvienas padalinti dar į 16 kvadratėlių. Ląstelės, besiribojančios su kairiąja ir viršutine kvadrato ribomis yra įskaičiuojamos, o su dešiniaja ir apatiniąja, neįskaičiuojamos. Gyvų ląstelių skaičius 1 ml DMEM terpės apskaičiuojamas taip: suskaičiuotų gyvų ląstelių skaičius keturiuose kvadratuose susumuojamas ir dauginamas iš 10 000 (vieno kvadrato tūrio dalis mililitre), dauginama iš 2 (skiedimų skaičius su TM) ir dalijama iš 4 (kvadratų skaičius).

Suskaičiavus ląsteles, suspensija vėl centrifuguojama, supernatantas nupilamas ir automatine pipete yra pamatuojamas ląstelių nuosėdų kiekis µl. Žinant bendrą suskaičiuotą ląstelių skaičių ir ląstelių nuosėdų užimamą tūrį µl, apskaičiuojama kokiame tūryje µl yra 1 mln. ląstelių. Būtent 1 mln.

ląstelių reikalingas užsodinti ant vieno kiaušinio CAM.

Atliekant eksperimentus su viščiukų embrionais, 1 mln. U87 MG glioblastomos ląstelių yra

sumaišomas su I tipo žiurkės uodegos kolagenu (angl. Rat Tail Collagen, type I), ir galutinis šio

mišinio 20 µl kiekis sodinamas ant CAM. Formuojant eksperimentines grupes su DCA, navikinės

ląstelės sumaišomos su kolagenu ir DCA tirpalu, kad DCA koncentracija 20-tyje µl būtų 5 mM arba 10

mM. Tuomet ant absorbuojančios odontologinės kempinės, skalpeliu supjaustytos 9 mm ³ (3 × 3 ×

1 mm) dydžio, užlašinama 20 µl ląstelių suspensijos ir kolageno (kolageno ir atitinkamos koncentracijos DCA suspensija) (10 pav. A). 10 pav. B dalyje pavaizduota ir rodykle pažymėta odontologinė kempinė, ant kurios jau yra užlašinta navikinių ląstelių ir kolageno suspensija. 7-tą kiaušinio inkubacijos parą ši kempinė uždedama ant CAM šalia stambiausios kraujagyslės. Inkubacija tęsiama iki 12-tos viščiuko embriono vystymosi paros.

10 pav. U87 MG ląstelių navikų suformavimo, naudojant absorbuojančią odontologinę kempinę, vaizdai. A – ant absorbuojančios odontologinės kempinės pipete lašinama 20 µl navikinių

ląstelių ir kolageno suspensijos; B – absorbuojanti odontologinė kempinė, ant kurios užlašinta (rodyklė) 20 µl navikinių ląstelių ir kolageno suspensijos.

2.4. Eksperimentinės grupės

7-tą viščiuko embriono vystymosi parą ant CAM buvo persodinti suformuoti U87 MG ląstelių ksenograftiniai navikai. Buvo tirtos 3 eksperimentinės grupės:

1. U87 MG glioblastomos ląstelių suformuoti ant CAM navikai (U87 MG), n = 7.

2. U87 MG glioblastomos ląstelių, gydytų 5 mM DCA doze, ant CAM suformuoti navikai (U87 MG+5 mM DCA), n = 14.

3. U87 MG glioblastomos ląstelių, gydytų 10 mM DCA doze, ant CAM suformuoti navikai (U87+10 mM DCA), n = 14.

2.5. In vivo biomikroskopija ir CAM nuėmimas

Embrionai ir ant jų CAM suformuoti navikai buvo stebimi 9-tą, 10-tą, 11-tą ir 12-tą

inkubacijos paromis ir fiksuojami pasitelkiant in vivo biomikroskopiją ir stereomikrosopą OLYMPUS

SZX16 su skaitmenine fotokamera (Olympus Life Science Europa GMBH, Hamburg, Vokietija), naudojant 3,2´ ir 5´ padidinimus.

12-tą inkubacijos parą į stambiausią viščiuko embriono CAM kraujagyslę insulininiu švirkštu buvo sušvirkščiama 20 µl fluoresceino izotiocianato-dekstrano tirpalo. Praėjus 1 min., kai dekstranas tolygiai pasiskirsto embriono kraujagyslėse, ant CAM užpilama 4 ml 10 proc. formalino tirpalo. Po to CAM buvo nuimamos, tikslu atlikti tolimesnį histologinį ir imunohistocheminį tyrimą. Ant CAM suformuotas navikas ir jį supanti CAM dalis iškerpama žirklutėmis ir patalpinama į Petri lėkštelę su 10 proc. formalino tirpalu. CAM vaizdai fiksuojami stereomikroskopo skaitmenine fotokamera iš abiejų CAM pusių dienos šviesoje ir panaudojant žaliai fluorescuojantį proteino filtrą su ultravioletinę spinduliuotę generuojančiu filtru.

Atlikus in vivo biomikroskopiją, CAM paliekamos fiksuotis 10 proc. formalino tirpale 24 val.

2.6. Medžiagos paruošimas histologiniam ir imunohistocheminiam tyrimui (įliejimas ir pjaustymas)

Po 24 val. fiksacijos 10 proc. formalino tirpale, CAM yra sudedamos į histologines kasetes, apruošiamos įvairiais tirpalais (2 lentelė), įliejamos į parafiną ir pjaustomos mikrotomu.

2 lentelė. CAM apruošimo tirpalais eiga prieš įliejant į parafiną

Eiga Tirpalas Laikymo

trukmė, val.

Fiksatoriaus pašalinimas Tekantis vandentiekio vanduo 4

Dehidratacija

70 proc. etilo alkoholis 1

80 proc. etilo alkoholis 1

96 proc. etilo alkoholis 1

Įliejimas į parafiną

96 proc. etilo alkoholis ir chloroformas (santykis 1:1) 1

Chloroformas 1

Chloroformas ir parafinas (62 °C temperatūroje) 1

Parafinas I (62 °C temperatūroje) 1

Parafinas II (62 °C temperatūroje) 1

CAM paveikus pagal protokolą tirpalais, parodytais 1 lentelėje, CAM buvo įliejama į stingdančią medžiagą parafiną, panaudojant liejimo formeles. Tai atliekama 62 °C temperatūroje termostate. Gautas parafino blokas atšaldomas ir pjaustomas mikrotomu 3 µm storio pjūviais. Pjūviai ištiesinami 37 °C temperatūros vandens vonelėje ir uždedami ant švarių, nuriebalintų objektinių stiklelių. Nupjauti CAM preparatai laikomi 37 °C temperatūroje termostate iki dažymo pradžios.

2.7. Dažymas hematoksilino ir eozino metodu

Hematoksilino ir eozino dažymo metodas yra dažniausiai naudojamas dažymo metodas histologinėse laboratorijose, naudojamas nuo XVI a. [164]. Dažymo metu ląstelės branduolys ir citoplazma nudažomi kontrastingomis spalvomis, kad būtų galima lengvai diferencijuoti visus ląstelinius komponentus.

Baziniai hematoksilino dažai nudažo branduolio chromatiną ir kitus bazofilinus ląstelės komponentus mėlynai violetine spalva, o rūgštiniai eozino dažai nudažo citplazmą ir kitas acidofilines struktūras rožine spalva [165]. Dažymo eiga hematoksilino ir eozino metodu pateikta 3 lentelėje.

3 lentelė. Hematoksilino ir eozino dažymo metodo eiga (protokolas)

Prosesas Reagentas Laikymo trukmė

Deparafinavimas

Ksilenas I 16 val.

Ksilenas II

5 min.

Ksilenas III 5 min.

Rehidratavimas

96 proc. etilo alkoholis

2 min.

80 proc. etilo alkoholis 2 min.

70 proc. etilo alkoholis

2 min.

Tekantis vandentiekio vanduo 3 min.

Distiliuotas vanduo 1 min.

Branduolių dažymas Meyer hematoksilino dažai 6 min.

Plovimas Tekantis vandentiekio vanduo 1 min.

Branduolių diferenciacija 37 mM amonio vanduo 30 s.

Plovimas Tekantis vandentiekio vanduo 1 min.

Citoplazmos dažymas Etanolinis eozino Y tirpalas 1 min.

Plovimas Tekantis vandentiekio vanduo

1 min.

Dehidratacija

70 proc. etilo alkoholis 2 min.

80 proc. etilo alkoholis

2 min.

96 proc. etilo alkoholis 2 min.

Skaidrinimas

Ksilenas I

5 min.

Ksilenas II 5 min.

Po skaidrinimo ksilenu, nudažyti preparatai, naudojant histologinius klijus, uždengiami dengiamaisiais stikleliais ir išdžiovinami kambario temperatūroje.

2.8. Imunohistocheminis dažymas

Imunohistochemija (IHC, angl. Immunohistochemistry) – metodas, kurio metu, panaudojant monokloninius ar polikloninius antikūnus, kokybiškai ir kiekybiškai identifikuojami antigenai (baltymai) audinio pjūvio, esančio ant objektinio stiklelio, ląstelėse, panaudojant principą, kad antikūnai speficiškai jungiasi su antigenais [166].

IHC plačiai naudojama vėžio diagnostikai, nes šiuo metodu nustatomi baltymai, onkogenai, naviko-speficiniai antigenai, naviko slopinimo genai, naviko proliferacijos žymenys, padedantys atskirti piktybinį vėžį nuo gėrybinio, nustatyti jo rūšį, stadiją, laipsnį. Taip pat, vėžiui yra būdinga specifinių baltymų ekspresija de novo ar padidėjusi tam tikrų baltymų raiška.

Prieš atliekant IHC dažymą, svarbus etapas yra antigeno išlaisvinimas, vykdomas greitpuodyje, 20 min. virinant preparatus 96 °C temperatūroje su Tris/EDTA pH 9.0 ar natrio citrato pH 6.0 buferiniais tirpalais. Šis etapas yra reikšmingas, nes formalino fiksacijos metu susiformuoja metileno tilteliai, kurie sujungia baltymus ir taip užmaskuoja antigenus, esančius audinio pjūvyje.

Antigeno išlaisvinimo metu suardomi metileno tilteliai ir išryškėja antigeno prisijungimo vietos

(epitopai), o tai leidžia antikūnui prisijungti prie antigeno IHC dažymo metu [167].

Imunohistochemijai dažniausiai naudojami 10 proc. formalinu fiksuoti, parafinu įlieti audinių pjūviai, o antigeno ir antikūno sąveika dažniausiai išryškinama naudojant chromogeninę detekcijos sistemą. Naudojami pirminiai antikūnai specifiškai prisijungia prie antigenų epitopų, esančių audinyje.

Tuomet pridedamas antrinis antikūnas, kuris pažymimas fermentu, dažniausiai, krienų peroksidaze (HRP, angl. Horseradish peroxidase). Po to pridedama chromogenas 3,3'Diaminobenzidinas (DAB, angl. 3,3' Diaminobenzidine). HRP fermentas pakeičia chromogeno DAB struktūrą į rudos spalvos precipitatą, kuris nusėda audinyje antigeno (baltymo) buvimo vietoje.

IHC dažymas pradedamas preparatus iš 37 °C temperatūros termostato perkeliant 30 min. į 62°C termostatą. Tuomet preparatai deparafinuojami ir rehidratuojami (3 lentelė). Po to atliekamas anksčiau aprašytas antigeno išlaisvinimo etapas. Visiems trims antikūnams (PLBA, KMT6/EZH2 ir p53) naudotas Tris/EDTA pH 9.0 buferinis tirpalas. Išėmus preparatus iš greitpuodžio, jie uždedami ant IHC dažymo plokštelių su šulinėliais, kurios patalpinamos į plastikines dažymo stoteles (11 pav.).

Tarp preparato ir dažymo plokštelės susidaro tarpas, ir, veikiant kapiliarinei traukai, naudojamas reagentas lieka tame tarpe iki tol, kol į šulinėlį įpilamas kitas reagentas. Veikiant gravitacijai, antrojo reagento spaudimas priverčia pirmąjį reagentą ištekėti į atliekų indą, esantį dažymo stotelėje.

11 pav. Imunohistocheminio dažymo preparatai uždėti ant IHC dažymo plokštelių su šulinėliais ir patalpinti į plastikines dažymo stoteles

Uždėjus preparatus ant dažymo plokštelių, automatine pipete į šulinėlius ant audinių pjūvių

pilami reagentai, dažymas vyksta kambario temperatūroje. Pirmiausia naudojamas 1´ koncentracijos

plovimo buferinis tirpalas, kuris buvo naudojamas norint nuplauti kiekvieną reagentą, jo buvo pilama 2

ml. ir inkubuojama 5 min. Po pirmojo plovimo, buvo užpilama 200 µl peroksidazės blokavimo tirpalo

ir inkubuojama 10 min. Peroksidazės blokavimo tirpalas užblokuoja endogeninę peroksidazę, esančią

ląstelėse ir taip išvengiama nespecifinio foninio dažymosi. Po peroksidazės blokavimo tirpalo pilama

100 µl pirminio antikūno (PLBA, p53 arba KMT6/ EZH2), skiesto antikūno skiedikliu su foninį

dažymą mažinančiais komponentais santykiu 1:100 ir inkubuoja 30 min. Po to 30 min. buvo

inkubuojama su antriniu antikūnu Flex + Mouse Linker ir HRP fermentu (100 µl). Antigeno ir

antikūno sąveikai išryškinti 1 min. Buvo inkubuojama su 100 µl kiekiu DAB chromogeno. Galiausiai,