LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Eglė Steniukynaitė
Įvairių cheminių medžiagų įtaka Listeria
monocytogenes bakterijoms mėsos žaliavoje
Influence of various chemicals on Listeria
monocytogenes bacteria in raw meat
Veterinarinės maisto saugos nuolatinių studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: prof. dr. A. Stimbirys
2 DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Įvairių cheminių medžiagų įtaka
Listeria monocytogenes bakterijoms mėsos žaliavoje“.
1. Yra atliktas mano pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
2014 m. gegužės 5 d. Eglė Steniukynaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
2014 m. gegužės 5 d. Eglė Steniukynaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
2014 m. gegužės 5 d. Prof. dr. A. Stimbirys
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
Prof. dr. M. Malakauskas
(aprobacijos data) (katedros/instituto vedėjo/jos vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9 1.1 Listeria monocytogenes ... 9 1.2 Listeriozė ... 10 1.2.1 Epidemiologija ... 10 1.2.2 Klinikiniai požymiai ... 12 1.2.3 Invazinė listeriozė ... 121.2.4 Neinvazinė listeriozė (gastroenteritas) ... 14
1.3 Listeria monocytogenes jautienoje ... 14
1.4 Listeria monocytogenes nukenksminančios medžiagos ... 16
1.4.1 Organinės rūgštys ... 17 1.4.1.1 Pieno rūgštis ... 18 1.4.1.2 Acto rūgštis ... 18 1.4.2 Eteriniai aliejai ... 18 1.4.2.1 Cinamaldehidas ... 20 1.4.3 Chloro dioksidas ... 20
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS ... 22
2.1 L. monocytogenes skaičiaus nustatymas ... 22
2.2 Bendro mikroorganizmų skaičiaus nustatymas ... 24
2.3 Statistinė duomenų analizė ... 24
3. TYRIMO REZULTATAI ... 25
3.1 Įvairių cheminių medžiagų poveikis Listeria monocytogenes bakterijoms ... 25
3.2 Įvairių cheminių medžiagų poveikis bendram mikroorganizmų skaičiui... 32
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 35
IŠVADOS ... 37
4
SANTRAUKA
Autorius: Eglė Steniukynaitė
Įvairių cheminių medžiagų įtaka Listeria monocytogenes bakterijoms mėsos žaliavoje
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: prof. dr. Artūras Stimbirys
Atlikimo vieta: tyrimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Maisto saugos ir kokybės katedroje, 2014 metais, sausio – spalio mėnesiais. Darbo apimtis: 42 puslapiai, 5 lentelės, 10 paveikslų.
Tyrimo tikslas – nustatyti įvairių cheminių medžiagų įtaką Listeria
monocytogenes bakterijoms mėsos (jautienos) žaliavoje.
Mėsos žaliava (jautiena) buvo perkama įvairiose mėsos ir jos produktų prekybos vietose. Tyrimų laboratorijoje buvo ištirtas Listeria monocytogenes bakterijų atsparumas įvairioms cheminėms medžiagoms: pieno rūgščiai, acto rūgščiai, cinamaldehidui, chloro dioksidui. Buvo naudotos įvairios šių medžiagų koncentracijos: pieno rūgšties – 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, acto rūgšties – 2 %, 3 %, 5 %, cinamaldehido - 0,5 %, 1,5 %, 3 %, chloro dioksido – 5 ppm ir 15 ppm. Atsparumas buvo vertintas užkrečiant žalią jautieną. Taip pat buvo nustatytas šių cheminių medžiagų poveikis bendram mikroorganizmų skaičiui.
Atlikus tyrimą nustatyta, kad iš visų tyrime naudotų cheminių medžiagų didžiausią neigiamą poveikį Listeria monocytogenes ir BMS augimui daro pieno rūgštis, nes per 48 valandas L. monocytogenes skaičius sumažėjo 129 kartus, o bendras mikroorganizmų skaičius – 22,6 karto (p<0,05). Lyginant naudotų cheminių medžiagų poveikį nustatyta, kad pieno rūgštis ir chloro dioksidas stipresnį neigiamą poveikį darė L. monocytogenes bakterijoms, o cinamaldehidas ir acto rūgštis – bendram mikroorganizmų skaičiui.
5
SUMMARY
Author: Eglė Steniukynaitė
Influence of various chemicals on Listeria monocytogenes bacteria in raw meat
Master's thesis
Work supervisor: prof., dr. Artūras Stimbirys
The place of work: the research was conducted in the Lithuanian University of Health Sciences Veterinary Academy Faculty of Veterinary Medicine Department of Food Safety and Quality between January and October in 2013.
Scope of work: 42 pages, 5 tables and 10 pictures.
The goal of the research is to determine the influence of various chemicals on
Listeria monocytogenes bacteria in raw meat (beef).
Raw meat was purchased in various markets of meat and meat products. The resistance of Listeria monocytogenes to various chemicals like lactic acid, acetic acid,
cinnamaldehyde, chlorine dioxide was tested in the laboratory. These chemicals were used in various concentrations: lactic acid – 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, acetic acid – 2 %, 3 %, 5 %,
cinnamaldehyde – 0,5 %, 1,5 %, 3 %, chlorine dioxide – 5 ppm and 15 ppm. Resistance was evaluated by infecting raw beef. The effects of these chemicals to the total number of microorganisms was also determined.
The research revealed that the most influencing chemical from the ones tested was lactic acid. Within 48 hours the amount of L. monocytogenes decreased 129 times and the total number of microorganisms decreased 22,6 times (p<0,05). While comparing the effects of the chemicals used in the research it was determined, that lactic acid and chlorine dioxide has a stronger negative impact on the growth of L. monocytogenes bacteria and cinnamaldehyde and acetic acid has a bigger influence on the total number of microorganisms.
6
SANTRUMPOS
ALOA – (angl. Agar Listeria acc. to Ottaviani & Agosti) Listeria agaras pagal Ottaviani ir Agosti;
BHI – (angl. Brain Heart Infusion) smegenų ir širdies mišinio sultinys; BPV – buferinis peptono vanduo;
BMS – bendras mikroorganizmų skaičius; CNS – centrinė nervų sistema;
EFSA – (angl. European Food Safety Authority) Europos maisto saugos tarnyba; ES – Europos Sąjunga;
FDA – (angl. Food and Drug Administration) Amerikos maisto ir vaistų administracija; GRAS – (angl. Generally Recognized as Safe) paprastai pripažinta saugia (medžiaga); KSV/g – kolonijas sudarančių vienetų skaičius 1 grame;
NMVRVI – Nacionalinis maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutas; ppm - (angl. Parts per million) milijoninė dalis (1 ppm ~ 1 mg/l);
PCA – (angl. Plate count agar) mitybinė terpė; PSO – Pasaulio sveikatos organizacija;
USDA – (angl. United States Department of Agriculture) Jungtinių Amerikos Valstijų žemės ūkio departamentas;
ULAC – Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centras; µl – mikrolitrai;
X – vidurkis;
7
ĮVADAS
Per maistą plintančios ligos yra didelė problema visuomenės sveikatai ir šalių ekonomikai.
PSO apskaičiavo, kad dėl nesaugaus maisto vartojimo suserga vienas iš trijų žmonių kiekvienais metais visame pasaulyje, tačiau per maistą plintančių ligų atvejų tikriausiai yra daug daugiau (Buckley, Reid, 2010).
Remiantis literatūros duomenimis, iš visų žinomų sukėlėjų, kurie gali sukelti infekciją žmogui, net 61 proc. sukelia zoonozes. Žmonės užsikrečia nuo gyvūnų arba valgydami užkrėstą maistą (NMVRVI, 2009). Pranešta, kad infekcija paveikia apie 380 000 ES piliečių kasmet (EFSA, 2011; Lahuerta et al., 2011).
Listeria monocytoges (L. monocytogenes) yra vienas iš svarbiausių patogenų,
keliančių pavojų visuomenės sveikatai visame pasaulyje. Pagrindinis užsikrėtimo šaltinis yra maistas – šviežia mėsa, mėsos produktai, žuvis ir kt. Taip yra dėl to tai, kad L. monocytogenes bakterijos yra prisitaikiusios prie nepalankių aplinkos sąlygų (žema temperatūra, deguonies stygius ir kt.) (Elmali et al., 2012).
Listeriozė – liga, kurą sukelia L. monocytogenes bakterijos. JAV kasmet šia liga suserga apie 2500 žmonių, iš kurių – 500 miršta. EFSA duomenimis, ES šalyse 2007 m. užregistruoti ir patvirtinti 1554 žmonių susirgimo listerioze atvejai, 20 proc. sirgusių šia liga ─ mirė (NMVRVI, 2012). Lietuvoje žmonių susirgimų listerioze atvejai registruojami kasmet. Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centro duomenimis, 2007 metais užregistruoti 4 atvejai, 2008 metais – 7, 2009 ir 2010 metais po 5 žmonių listeriozės atvejus. Siekiant apsaugoti Lietuvos gyventojus nuo užsikrėtimo listerioze, Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institute nuolat atliekami maisto mėginių laboratoriniai tyrimai dėl monocitogeninių listerijų (NMVRVI, 2009).
Mokslininkų duomenys rodo, kad užsikrėtimas maistu yra pagrindinis listeriozės plitimo būdas. Pagrindinis infekcijos šaltinis yra gyvūninis maistas, vartojamas be pakankamo šiluminio paruošimo. Kadangi gyvūnai dažniausiai yra bakterijų nešiotojai, todėl tokių gyvūnų mėsa, pienas ir jų produktai gali būti infekcijos šaltiniu. Listerijomis maistas gali būti užterštas ir jį tvarkant (ULAC, 2012).
Siekiant sumažinti skerdenos, mėsos ir mėsos produktų mikrobinį užterštumą bei užterštumą dėl asmens higienos nesilaikymo ir netinkamo mėsos tvarkymo, naudojamos įvairios cheminės medžiagos (organinės rūgštys, trinatrio fosfatas, parūgštintas natrio
8 chloridas ir kt.), fizinės (gyvūnų plovimas, pjaustymas, garai, karštas vanduo ir kt.) bei mikrobinės (bakteriocinai) (Elmali et al., 2012).
Darbo tikslas: nustatyti įvairių cheminių medžiagų įtaką Listeria monocytogenes
bakterijoms mėsos (jautienos) žaliavoje.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti įvairių cheminių medžiagų (pieno rūgšties, acto rūgšties, cinamaldehido, chloro dioksido) poveikį L. monocytogenes bakterijų dauginimuisi mėsos žaliavoje;
2. Nustatyti bendro bakterijų skaičiaus kitimus mėsos žaliavoje, paveiktoje pieno rūgštimi, acto rūgštimi, cinamaldehidu ir chloro dioksidu;
3. Palyginti gautus rezultatus ir nustatyti medžiagas, kurios daro didžiausią poveikį L. monocytogenes ir BMS.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Listeria monocytogenes
Listeria monocytogenes yra mažos, 0,5 μm skersmens ir 1 – 2 μm ilgio, apskritais
galais lazdelės. Sporų ir kapsulių jos nesudaro. Gramteigiamas, fakultatyvus anaerobas (mikroaerofilas). Listeria monocytogenes judrios esant + 20 – 25oC temperatūrai (iki 30oC). (Miettinen, 2006).
1 pav. Nudažytos Listeria monocytogenes vaizdas audiniuose per elektroninį
mikroskopą (http://emedicine.medscape.com/article/220684-overview)
Listeria gentyje yra žinomos septynios rūšys (L. monocytogenes, L. seeligeri L. innocua L. welshimeri L. martii, ir L. grayi), iš kurių tik dvi yra patogeniškos. L. monocytogenes yra patogeniška žmonėms ir gyvūnams; L. ivanovii užsikrečia gyvūnai ir labai
retai sukelia ligą žmonėms. Listeria genties serotipai yra identifikuojami remiantis ląstelių paviršiaus struktūra - O ir H antigenais. L. monocytogenes turi 12 serotipų (1/2a, 1/2B, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e ir 7), iš kurių trys (1/2a, 1/2B ir 4b) sukelia daugiausiai (95%) žmonių negalavimų, serotipas 4b dažniausiai susijęs su ligų protrūkiais (Scallan et al., 2011).
Minimalus L. monocytogenes augimą užtikrinantis vandens aktyvumas Aw = 0,92.
Gali augti terpėje, kurioje NaCl koncentracija 10 % ir apie metus išgyventi terpėje, kurioje NaCl koncentracija 16 %. Priklausomai nuo rūgšties tipo, gali augti terpėje, kurios pH yra nuo 4,0 iki 9,5 (optimalus 7 – 7,4). Optimali L. monocytogenes augimo temperatūra yra 37°C, bet gali daugintis esant temperatūrai nuo minus 0,4 iki + 45°C. Greitai inaktyvuojama esant
10 aukštesnei nei +70°C temperatūrai. Veikiamos tiesioginių saulės spindulių listerijos žūva per 2 – 15 parų. Jas inaktyvuoja chloro turinčios dezinfekcinės medžiagos. L. monocytogenes rezervuaras ir infekcijos šaltinis - laukiniai ir naminiai gyvūnai bei graužikai, todėl šios bakterijos plačiai paplitusios gamtoje. Su gyvūnų ekskrementais patekusios listerijos gali būti randamos dirvožemyje, vandenyje, ant žolės, mėšle, silose ir kt. (ULAC, 2012).
Listeria monocytogenes rūšies bakterijos sūdytoje mėsoje gali išgyventi iki 400
dienų, kopūstų sultyse – iki 25 dienų. Tvenkinių vandenyje listerijos išgyvena iki 3,5 mėnesio (NMVRVI, 2009).
Nors L. monocytogenes buvo pripažinta gyvūnų ligų sukėlėju daugiau kaip 80 metų, pirmasis 1983 m. Kanados jūrų provincijose įvykęs listeriozės protrūkis patvirtino netiesioginį šio sukėlėjo perdavimą nuo gyvūnų žmonėms. Šio protrūkio šaltinis buvo užkrėsti per avių mėšlą kopūstai, saugomi per žiemą.
Vėliau kilęs protrūkis Kalifornijoje 1985 metais patvirtino, kad listeriozė – per maistą plintanti liga. Nuo tada Listeria gentis buvo susijusi su daugeliu protrūkių plintančių per maistą, dažniausiai per užkrėstus pieno produktus ir paruoštus vartoti mėsos produktus, paštetus, greitą maistą, jūros gėrybės bei žuvies produktus.
Nors maistu plintančių ligų protrūkiai sukeliami listerijų nėra dažni, bet jie išlieka svarbia visuomenės sveikatos problema. Jungtinėse Amerikos Valstijose apie 20 – 65 % mirčių nuo visų su maistu plintančių infekcijų yra dėl Listeria monocytogenes. Todėl, nustačius protrūkį labai svarbu kuo greičiau nustatyti jo šaltinį, kad būtų apsaugoti sveiki vartotojai (Bortolussi, 2008).
1.2 Listeriozė
1.2.1 Epidemiologija
Listeria monocytogenes nėra dažnas patogenas, su kuriuo susiduria žmogus.
Dažniausiai nustatomi invaziniai ligos atvejai, protrūkiai ar kaip pavienės infekcijos. Neperinatalinių (> 7 dienų naujagimiai) atvejų invazinės listeriozės, kaip apskaičiuota visame pasaulyje, sergamumas svyruoja 0,1 – 1,1 atvejų 1000000 gyventojų. CNS infekcijos būna vidutiniškai 47 % infekuotų pacientų, kurių mirtingumas vidutiniškai siekia 36 %. Listeria
monocytogenes yra trečioje ar ketvirtoje vietoje dėl sergamumo bakteriniu meningitu Šiaurės
11 listerioze sumažėjimas pastebėtas 2007 ir 2008 metais ES 2009 metais išaugo. Tais metais, ES pranešė apie 19 % padidėjusį žmonių sergamumą listerioze, lyginant su 2008 metais (EFSA, 2011 m., Lahuerta et al., 2011). Padidėjimas daugiausiai atspindėjo tarp vyresnio
amžiaus žmonių (Allerberger, Wagner, 2010). 2011 metais užfiksuota listeriozės JAV dažnis
buvo 0,28 atvejo 100000 gyventojų (CDC, 2013). Tuo tarpu daug didesnė rizika yra gyventojams, kurie yra priskiriami rizikos grupėms. Pavyzdžiui, nėščių moterų sergamumo dažnis – 12 atvejų 1000000 gyventojų, o AIDS sergančių pacientų buvo – 115 atvejų 1000000 gyventojų.
1 lentelė. Listeriozės atvejai 2007 – 2011 metais ES (EFSA, 2011)
Šalis 2011 2010 2009 2008 2007 Atvejai Patvirtinti atvejai Patvirtinti atvejai/ 100 000 Patvirtinti atvejai Austrija 26 26 0,31 34 46 31 20 Belgija 70 70 0,64 40 58 64 57 Bulgarija 4 4 0,05 4 5 5 11 Kipras 2 2 0,25 1 0 0 0 Čekija 35 35 0,33 26 32 37 51 Danija 49 49 0,88 62 97 51 58 Estija 3 3 0,22 5 3 8 3 Suomija 44 43 0,08 71 34 40 40 Prancūzija 282 282 0,43 312 328 276 319 Vokietija 337 330 0,4 377 394 306 356 Graikija 9 9 0,08 10 4 1 10 Vengrija 11 11 0,11 20 16 19 9 Airija 7 7 0,16 10 10 13 21 Italija 83 83 0,14 95 88 118 89 Latvija 7 7 0,31 7 4 5 5 Lietuva 6 6 0,18 5 5 7 4 Liuksemburgas 2 2 0,39 0 3 1 6 Malta 2 2 0,48 1 0 0 0 Nyderlandai 87 87 0,52 72 44 45 68 Lenkija 62 62 0,16 59 32 33 43 Rumunija 9 9 0,04 6 6 0 0 Slovakija 31 31 0,04 5 10 8 9 Slovėnija 5 5 0,57 11 6 3 4 Ispanija 91 91 0,24 129 121 88 82 Švedija 56 56 0,79 63 73 60 56 Jungtinė Karalystė 164 164 0,26 176 235 206 260
12 Nors kai kurios šalys leidžia nedidelį listerijų kiekį produktuose, tačiau USDA ir FDA teigia, kad listerijų paruoštuose vartoti maisto produktuose iš viso neturi būti. Šios pastangos lėmė tai, kad 24 % buvo sumažinta invazinių listeriozės atvejų ir 37 % sumažinta su nėštumu susijusių infekcijų nuo 1996 metų (Voetsch et al., 2007).
FDA duomenimis Listeria monocytogenes bakterijos išskiriamos iš įvairių produktų, įskaitant pieno (įvairių rūšių sūriai ir kt.), žemės ūkio (braškės, supjaustyti švieži vaisiai, grybai) ir įvairių paruoštų vartoti maisto produktų, pavyzdžiui, kopūstų salotos, krabai, rūkyta lašiša ir kalakutiena, salotos, bulvių salotos ir kt. Dažniausiai išskirtos bakterijos priklauso serotipams: 4b, 1/2a ir 1/2b (Swaminathan, Gerner-Smidt, 2007).
1.2.2 Klinikiniai požymiai
Žmogaus listeriozė paprastai pasireiškia vienu iš trijų klinikinių požymių t.y. gastroenteritu, motinos-vaisiaus / naujagimio listerioze ar bakteriemija, kuri gali sukelti smegenų infekcijas, tokias kaip meningitas, meningoencefalitas, galvos smegenų kamieno encefalitas arba smegenų abscesas. Retesnės būna židininės infekcijos – endokarditas, peritonitas, sepsinis artritas. Taip pat aprašytos židininės infekcijos, įskaitant cholecistitą, sąnarių infekciją. Galiausiai – odos listeriozė, kuri gali apsunkinti tuos, kurie serga odos egzema (Allerberger et al., 2010).
Yra dviejų tipų ligos susijusios su L. monocytogenes infekcija: invazinės ir neinvazinės:
Invazinės listeriozės forma – meningitas, septicemija, neurologiniai
sutrikimai, nėščioms moterims abortas, bendrieji negalavimai, mirtis.
Neinvazinė listeriozė - gastroenteritas ar gastroenterititas, kuris susijęs su nežymiais "gripą primenančiais" simptomais. Jie gali atsirasti ir sveikiems žmonėms, jei yra suvartojama daug L. monocytogenes bakterijų (Lake et al., 2005).
1.2.3 Invazinė listeriozė
Invazinės žmonių L. monocytogenes infekcijos paprastai pasireiškia kaip bakteriemija, su arba be akivaizdžių infekcijos simptomų arba gali pasireikšti CNS infekcijos,
13 tarp jų meningitas, meningoencefalitas, galvos smegenų kamieno encefalitas ir smegenų abscesas. Dauguma listerinio meningito / menigoencefalito atvejų nustatomi pacientams, kurie vyresni nei 50 metų ir pasireiškia karščiavimu, pojūčių sutrikimu, galvos skausmais. Tipiški bakterinio meningito požymiai: karščiavimas, kaklo sustingimas ir psichinės būsenos pokyčiai pastebimi 43 % pacientų (Brouwer et al, 2006). Židininiai neurologiniai požymiai gali pasireikšti 16-37 %, o traukuliai 4-17 % atvejų.
Dvi mažiau pasitaikančios CNS infekcijos yra smegenų kamieno encefalitas ir smegenų abscesas. Smegenų kamieno encefalitas sudaro 10 % listerinių sukeltų CNS infekcijų ir yra dviejų fazių: pradžioje būdinga galvos skausmas, pykinimas, vėmimas, karščiavimas, o po to seka progresuojanti smegenų kamieno ir smegenėlių disfunkcija (Drevets et al., 2008).
Daugumai nėščių moterų ši bakterinė liga pasireiškia karščiavimu, šaltkrėčiu, galvos skausmais ir leukocitoze dar 6 – 7 dienos prieš ligos diagnozavimą.
L. monocytogenes bakterijos gali būti išskirtos iš gimdos kaklelio, amniono ir
placentos. Komplikacijos gali būti savaiminis persileidimas ar negyvo vaisiaus gimimas 20 % pacienčių, ypač jei infekcija atsiranda pradžioje nėštumo, taip pat gali sukelti priešlaikinį gimdymą ir naujagimių infekciją.
Invazine listerioze vaisius gali užsikrėsti per motinos placentą. Perinatalinė listeriozė gali sukelti abortą, negyvo vaisiaus gimimą arba kūdikis gali gimti su generalizuota infekcija, sepsiu ar meningitu.
Naujagimių listeriozė yra skirstoma į dvi klinikines formas: anksti prasidėjusią (paprastai atsiranda per pirmą gyvenimo savaitę) ir vėliau atsiradusią (gali atsirasti nuo vienos iki kelių savaičių po gimimo). Listeriozė nėštumo metu yra rimta grėsmė negimusiam kūdikiui.
Medicinos praktikoje trečdalis patvirtintų atvejų, kai motina serga listerioze pasibaigia abortu arba negyvo vaisiaus gimimu. Tačiau gyviems gimusiems kūdikiams didelio pavojaus nėra, net jeigu jiems sunki listeriozės forma.
Su nėštumu susiję atvejai būna tada, kai serga nėščios moterys arba naujagimiai iki 28 gyvenimo dienos, o ne nėštumo atvejai, kai suserga vyresni kaip 28 dienų kūdikiai. Listeriozė per pirmuosius 3 nėštumo mėnesius pasireiškia labai retai. Daugumai nėščiųjų infekcija pasireiškia po šešių nėštumo mėnesių, kai T-ląstelių imunitetas būna labiausiai sutrikęs. Užsikrėtę moterys paprastai jaučia į gripą panašius simptomus, tačiau gali pasireikšti ir tipiški listeriozės simptomai.
14 Su nėštumu nesusiję listeriozės atvejai daugiausia pasireiškia meningoencefalitu ar septicemija. Vidutiniškai inkubacinis laikotarpis yra maždaug 3 savaites. Protrūkių atvejai trunka maždaug 3 – 70 dienų po vieno kontakto su užkrato šaltiniu ar užkrėsto produkto suvartojimo. Esant meningoencefalitui (retas nėščioms moterims) gali būti staigus karščiavimas, stiprus galvos skausmas, pykinimas, vėmimas, smegenų dangalų dirginimas. L.
monocytogenes taip pat gali sukelti įvairias židinines infekcijas: konjunktyvitą, odos infekciją,
limfadenitą, kepenų abscesą, smegenų abscesą, cholecistitą, peritonitą, blužnies abscesą, sąnarių infekciją, osteomielitą, perikarditą, miokarditą, artritą, nekrozuojantį fascitą ir kt. (Pena-Sagredo et al., 2008).
Europoje maždaug 10 - 20 % klinikinių atvejų yra susiję su nėštumu (įskaitant naujagimius per pirmąsias 4 savaites po gimimo), tačiau dauguma atvejų pasitaiko asmenims su imuninės sistemos sutrikimais, ypač pagyvenusiems žmonėms. Maždaug 10 % pacientų užsikrėtimo šaltiniai nėra nustatomi (Allerberger et al., 2010).
1.2.4 Neinvazinė listeriozė (gastroenteritas)
Keli listerinio gastroenterito protrūkiai buvo aprašyti, kurie pasitaikė ir kliniškai sveikiems asmenims (Ooi, Lorber, 2005).
Po inkubacijos laikotarpio 6 – 49 val. (vidutiniškai 20 – 25 val.), daugumai pacientų pasireiškė viduriavimas, karščiavimas, pilvo skausmai, šaltkrėtis, galvos skausmai.
Tai savaime praeinanti liga, vidutinės trukmės karščiavimas ir viduriavimas trunka 27 – 42 val. atitinkamai, dauguma pacientų pasveiksta ir be antimikrobinio gydymo (Drevets et al., 2008).
1.3 Listeria monocytogenes jautienoje
Mikrobinis užteršimas ant jautienos skerdenų ir mėsos žaliavos gali atsirasti kryžminio užteršimo būdu skerdimo metu ir vėliau perdirbant. Viso proceso metu užteršimas gali įvykti bakterijoms patenkant ant mėsos žaliavos nuo gyvulio odos, kailio, iš virškinamojo trakto, nuo darbuotojų ir aplinkos.
Nustatyti skerdenų užterštumo lygį yra pirmas esminis žingsnis kuriant maisto saugos elementus tam tikrose jautienos gamybos sistemose. Jautienos pramonėje dirbantys žmonės pripažįsta, kad mikrobinis užteršimas gali atsirasti, tačiau jie ėmėsi kelių veiksmų,
15 siekiant sumažinti taršos potencialą. Taip buvo įtrauktos antimikrobinės priemonės, kurios gali būti taikomos atskirai arba kartu su kitais nukenksminimo metodais, siekiant sumažinti patogenų skaičių mėsos žaliavoje (Winkler, Harris, 2009).
Skerdenų užteršimas L. monocytogenes bakterijomis gali ženkliai skirtis priklausomai nuo daugelio faktorių. Tyrimo metu, kurį atliko Rhoades et al. (2009), vidutinis paplitimas L. monocytogenes ant odos buvo 12 % (10 – 13 %).
Taip pat mėsos užterštumas priklauso nuo regiono. Atlikus tyrimus buvo nustatyta dviejų toli viena nuo kitos esančių jautienos perdirbimo įmonių jautienos užterštumas listerijomis ir gauti rezultatai buvo labai skirtingi (0,8 palyginti su 18,7 %) (Rivera-Betancourt et al., 2004).
Maltos jautienos mėginiai rodo aukštą L. monocytogenes užkrėtimo lygį, o tai įrodo, kad mėsos perdirbimas ir tvarkymas gali žymiai padidinti taršą. Pagal Rhoades et al. (2009), vidutinis L. monocytogenes paplitimas žalios jautienos produktuose yra 10 % (1,6 – 24 %). Taigi, Listeria spp. yra ne retai aptinkami patogenai mėsos žaliavoje ir produktuose. Kadangi listerijomis gali būti užkrėsta mėsa ir jos produktai, tai jie gali tapti ir kitų produktų užkrėtimo šaltiniu jei tie produktai ruošiami ar tvarkomi toje pačioje aplinkoje.
Skerdyklose ir mėsos perdirbimo patalpose paprastai L. monocytogenes nėra kontroliuotamos, todėl žalios mėsos produktų, kuriems netaikomas terminis apdorojimas (pvz.: fermentuota mėsa) stebėsenai turėtų būti skirtas ypatingas dėmesys, siekiant išvengti L.
monocytogenes taršos.
Visų galimų fekalinio produktų užteršimo šaltinių sumažinimas yra svarbiausias veiksnys siekiant išlaikyti reikiamus maisto saugos reikalavimus šviežiai jautienai. Net L.
monocytogenes buvimas gyvūnų virškinimo trakto turinyje gali turėti reikšmingą poveikį
vėlesniam jautienos skerdenų užkrėstumo lygiui.
Melžiamos karvės gali būti listerijų nešiotojos, todėl sumažinus sukėlėjų kiekį bandose (galvijų žarnyne) galėtų būti sumažinama užteršimo rizika skerdykloje (Esteban et al., 2009), (Adam, Brülisauer, 2010).
Listeria monocytogenes paplitimas tarp galvijų ir jų kiekis mėsos žaliavoje gali
būti sumažintas taikant šias priemones:
Mėšlo nukenksminimas;
Siloso fermentacijos ir pašarų kokybės stebėsena atsižvelgiant į L.
monocytogenes. Praktiškiausias būdas sumažinti L. monocytogenes silose yra
16
Higienos taisyklių laikymasis, bandos sveikatos priežiūra, mažas gyvulių tankis, uždaras gyvūnų šėrimas, streso mažinimas;
Užkirsti kelią L. monocytogenes plitimui fekaliniu būdu;
Higienos palaikymas skerdyklose ir galvijų bei mėsos laikymo ir tvarkymo patalpose (Santorum et al., 2012).
1.4 Listeria monocytogenes nukenksminančios medžiagos
L. monocytogenes kontrolė yra sunki dėl jos:
1) didelio paplitimo aplinkoje, 2) būdingo fiziologinio atsparumo,
3) gebėjimo prisitaikyti prie išorinių poveikių
4) gebėjimo daugintis įvairiose temperatūrose (Lungu et al., 2009).
Kontroliuojant Listeria maisto produktų gamybos ir maisto perdirbimo įmonėse reikia pastangų. Siekiama plėtoti naujus ir patobulintus metodus, siekiant užkirsti kelią šių patogenų išgyvenimui ir augimui. L. monocytogenes gebėjimas išgyventi nepalankiomis sąlygomis, įskaitant rūgštis, žemą temperatūrą ir didelę natrio chlorido koncentraciją įrodo, kad maisto pramonėje šį organizmą sunku kontroliuoti.
Pasaulyje atliekami tyrimai, naudojant įvairius konservavimo metodus siekiant pagerinti Listeria monocytogenes kontrolę maisto produktuose. Dauguma iš jų siekiama užtikrinti maisto saugą, nepakenkiant juslinėms ir maistinėms produktų savybėms (Gandhi, Chikindas, 2007).
Antimikrobinių medžiagų naudojimas maisto produktuose yra tinkamas būdas, kuris turi daug privalumų:
pratęsia maisto produktų tinkamumo vartoti terminą;
suteikia papildomą apsaugą prieš terminį apdorojimą;
sumažina riziką plisti per maistą plintančių ligų sukėlėjams maisto grandinėje;
sumažina ekonominius nuostolius dėl maisto gedimo;
leidžia žemesnės temperatūros terminį apdorojimą nekeliant rizikos maisto saugai: geriau išsaugomos maistinės medžiagos, vitaminai, taip pat organoleptinės savybės;
leidžia kurti "naujus" maisto produktus (mažiau naudojant rūgšties, druskos, daugiau vandens), kurie padeda patenkinti pramonės ir vartotojų poreikius.
17 Kai kurios tendencijos maisto pramonėje pasiteisina, bent jau iš dalies, taikant natūralias antimikrobines medžiagas. Daugybė antimikrobinių medžiagų egzistuoja augaluose, gyvūnuose ir mikroorganizmuose, kur jos dažniausiai dalyvauja įvairiuose gynybos mechanizmuose. Šie junginiai tai – bacteriocinai, organinės rūgštys, eteriniai aliejai ir kt. Dauguma jų pripažinti kaip saugūs junginiai (GRAS) (Campos et al., 2011).
1.4.1 Organinės rūgštys
Organinės rūgštys, kaip pavyzdžiui: acto, pieno, obuolių, citrinų – natūralios sudedamosios dalys daugelyje maisto produktų ir jos jau nuo seno buvo naudojamos maisto konservavimui. Jų antimikrobinis veikimas daugiausiai grindžiamas gebėjimu sumažinti pH vandeninėje maisto fazėje. Atsižvelgiant į silpnas lipofilines organines rūgštis, pavyzdžiui, acto arba sorbo, nedisocijavusi jų forma taip pat gali įsiskverbti į ląstelės membraną. Patekusi į citoplazmą rūgštis suyra, todėl sumažėja ląstelių vidaus pH ir sutrinkai ląstelių funkcijos. Taip pat jos slopina fermentų veiklą, maistinių medžiagų transportą ir bendrą medžiagų apykaitą.
Nors natūraliai organinės rūgštys randamos augalų audiniuose, tačiau jos komerciniam naudojimui yra gaminamos cheminės sintezės būdu, nes taip yra patogiau ekonominiu požiūriu. Dėl savo didesnio tirpumo negu organinės rūgštys dažniausiai naudojamos jų druskos.
Antimikrobinis organinių rūgščių ir jų druskų poveikis priklauso nuo pH, temperatūros, vandens aktyvumo, rūgšties rūšies, jos koncentracijos ir taikymo būdo. Be to, sąveika su kitais priedais ar komponentais gali padidinti arba sumažinti antimikrobinį aktyvumą. Apskritai, veikla yra sustiprinama esant žemam pH ir / arba kartu su papildomais stresoriais. Remiantis vienoda moline koncentracija, organinių rūgščių veiksmingumas slopinant L. monocytogenes išsidėstė tokia tvarka: citrinos – obuolių – pieno – acto.
Keletas tyrimų parodė, kad rūgščių slopinamasis poveikis yra didesnis esant žemesnei temperatūrai (Campos et al., 2011). Be to, bendras temperatūros, pH ir organinių rūgščių poveikis vaidina svarbų vaidmenį slopinimo procese (Johnson, 2008).
Galiausiai, reikėtų pabrėžti, kad Listeria monocytogenes ląstelės veikiamos organinių rūgščių gali išgyventi šaldymo metu ir pradeda daugintis, jei nėra veikiamos kitais inhibitoriais. Be to, rūgščių poveikis sukelia streso reakciją, kas daro bakterijas labiau tolerantiškesnes kitiems stresą sukeliantiems veiksniams (Campos et al., 2011).
18
1.4.1.1 Pieno rūgštis
Skerdenų ir mėsos žaliavos purškimas ir plovimas pieno arba acto rūgščių tirpalais yra plačiai naudojamas mėsos pramonėje po gyvulio paskerdimo ir žaliavų apdorojimo metu, siekiant sumažinti patogeninių bakterijų skaičių ir taip prailginti tinkamumo vartoti terminus.
Maisto pramonėje, pieno rūgštis gali būti naudojama pH reguliavimui, vandens aktyvumo mažinimui, dėl sinergistinio poveikio su antioksidantais ir dėl antimikrobinio aktyvumo. Dažnai pieno rūgšties panaudojimas derinamas su karštu vandeniu, baktericidinis poveikis pasireiškia todėl, kad paveikus rūgštimi sumažėja pH. Pieno rūgštis nukenksminti patogeninius mikroorganizmus ant mėsos žaliavos dažniausiai naudojama nuo 1 iki 3 %. Atliktų tyrimų duomenimis, naudojant tokią koncentraciją patogenų skaičius vidutiniškai sumažinamas 2 log10 (Carpenter et al., 2011). Tačiau kai kurių tyrimų rezultatai parodė, kad
pasterizacija garais ar karštu vandeniu yra efektyvesnė nei apdorojimas rūgštimi (Koohmaraie et al., 2005).
1.4.1.2 Acto rūgštis
Acto rūgštis – bespalvis skystis, turintis aštrų kvapą ir rūgštų skonį. Tai pigi, paprastai pripažįstama saugia (GRAS) medžiaga, kuri tarnauja kaip puikus organinių junginių tirpiklis bei turi antimikrobinį poveikį. Acto rūgštis taip pat buvo plačiai išbandyta kaip maisto produktų konservantas ir medžiaga žudanti maistu plintančias patogenines bakterijas. Jos antimikrobinis aktyvumas visų pirma buvo paremtas gebėjimu sumažinti pH.
Kelių tyrimų duomenimis, kurių metu buvo lyginamas acto rūgšties, pieno rūgšties ir citrinų rūgšties poveikis Listeria monocytogenes bakterijoms, acto rūgštis Listeria
monocytogenes veikė efektyviau nei kitos rūgštys. Taip pat buvo pastebėta, kad acto rūgštis
veikė geriau nei pieno ar citrinos rūgštis kontroliuojant E. coli O157: H7, esant 4,7 pH ir +30 ° C temperatūrai (Beverly, 2004).
1.4.2 Eteriniai aliejai
Eteriniai aliejai yra aliejingo lakaus skysčio mišiniai, sudėtingi junginiai, kurie ekstrahuojami iš skirtingų aromatinių augalų dalių (gėlės, pumpurai, lapai, sėklos, žievė,
19 stiebai, šakelės, vaisiai, vaistažolės, mediena ir šaknys). Jie augalų yra sintetinami kaip antriniai metabolitai ir juos galima gauti distiliuojant vandens garais arba naudojant ekstrahavimą. Eteriniai aliejai gali būti sudaryti iš 20 – 60 komponentų priklausomai nuo medžiagos iš kurios jie yra gaunami ir gavybos metodo. Dažniausiai jie yra terpenai ir terpenoidai, tačiau gali būti ir mažos molekulinės masės aromatiniai ir alifatiniai junginiai (Bakkali et al., 2008).
Anksčiau eteriniai aliejai maisto produktuose buvo naudojami kaip kvapiosios medžiagos. Nors yra žinoma, kad eteriniai aliejai turi platų antimikrobinų aktyvumą, jų naudojimas kaip konservantas maiste nebuvo pratęstas. Per pastaruosius kelis dešimtmečius, buvo atliekami tyrimai siekiant nustatyti minimalią slopinančią koncentraciją, kuri butų veiksminga ir nedarytų poveikio maisto produktams.
Buvo ištirta daugybės eterinių aliejų aktyvumas siekiant sustabdyti Listeria
monocytogenes dauginimąsi laboratorinėmis sąlygomis. Gauti tyrimai parodė, kad eteriniai
aliejai gauti iš kalendros, cinamono, gvazdikėlių, saldymedžio, muskato, pipirų, raudonėlio, eglės ir čiobrelių parodė didžiausią slopinamąjį poveikį. Baziliko, citrinų balzamo, mairūno, rozmarino ir šalavijo efektyvumas buvo mažesnis, o didžiausią atsparumą listerijos turi anyžių, kmynų, pankolių, česnakų, imbiero, svogūnų ir petražolių eteriniams aliejams.
Antimikrobinis eteriniu aliejų aktyvumas daugiausiai priklauso nuo jų sudėties. Slopinantys veiksmai yra labiau susiję su pagrindiniais komponentais, tačiau ir kiti komponentai gali moduliuoti antimikrobinį pagrindinių komponentų poveikį. Pagrindiniai komponentai, kurie yra susiję su eterinių aliejų veiksmingumu yra karvatrolis, timolis, linalolis, eugenolis, cinamaldehidas ir kt. Antimikrobinis eterinių aliejų veikimo mechanizmas nėra gerai žinomas. Buvo aprašyta, kad eterinių aliejų komponentai gali paveikti ląstelių sieneles, citoplazmos ir baltymų membranas, sukelti citoplazmos koaguliaciją (Campos et al., 2011).
Be antibakterinių savybių, eteriniai aliejai arba jų sudedamosios dalys turi ir antivirusinį, priešgrybelinį, antiparazitinį ir insekticidinį poveikį.
Dauguma tyrimų buvo atliekama laboratorijos sąlygomis. Todėl įterpiant eterinių aliejų komponentus į maisto matricą reikia atsižvelgti į maisto priedus, perdirbimo ir laikymo sąlygas, maisto produkto struktūrą, nes šie veiksniai gali pakeisti eterinių aliejų veiksmingumą. Daugumoje tyrimų veiksmingos dozės įterpiant į maisto sistemas yra didesnės nei laboratorinėmis sąlygomis (Gutierrez et al., 2009).
20
1.4.2.1 Cinamaldehidas
Cinamaldehidas yra aromatinio, eterinio aliejaus komponentas, plataus veikimo spektro, pasižymintis antimikrobiniu aktyvumu. Jis pratęsia maisto tinkamumo vartoti terminą, neigiamai veikia patogeninius mikroorganizmus įskaitant net ir tuos, kurie yra atsparūs daugumai inhibitorių bei gamina bioplėveles. Cinamaldehidas yra pagrindinis cinamono aliejaus, cinamono žievės komponentas. Jis yra klasifikuojamas kaip saugi vartojimui medžiaga (GRAS), patvirtinta FDA, kaip galima naudoti maistui. Pramonėje jis naudojamas kaip priedas ir dedamas į nealkoholinius gėrimus, ledus, saldainius, kepinius, kramtomąją gumą, pagardus ir mėsos produktus nuo 9 iki 4,900 ppm (Nostro et al., 2012).
Galimi cinamaldehido slopinamieji mechanizmai susiję su bakterijų energijos gamybos slopinimu, slopina gliukozės įsisavinimą arba panaudojimą ir veikia membranos pralaidumą. Cinamaldehido antibakterinis aktyvumas buvo priskirtas prie didelį poveikį turinčių medžiagų citoplazminės membranos struktūrinėms ir funkcinėms savybėms (Gill, Holley, 2004).
Literatūros duomenimis maisto srityje cinamaldehido poveikis buvo tiriamas įvairių maisto produktų, įskaitant daržovių, vaisių, pieno produktų, žuvies ir mėsos išsaugojimui (Burt, 2004).
Buvo nustatyta, kad cinamono eterinis aliejus, geriau veikia daugelį bakterijų, lyginant su česnakais ir gvazdikėlių eteriniu aliejumi. Tačiau tiriant S. aureus, E. coli ir C.
jejuni buvo nustatyta, kad šios bakterijos yra jautriausios eterinių aliejų deriniui (česnakų,
gvazdikėlių ir cinamono). Visos tirtos patogeninės bakterijos buvo jautrios cinamono eteriniam aliejui. Listeria monocytogenes cinamono eteriniam aliejui buvo jautresnė lyginant su Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus ir Salmonella
typhimurium. O palyginus kaip veikia L. monocytogenes česnako, gvazdikėlių ir cinamono
eteriniai aliejai atitinkamai gauti tokie rezultatai (slopinimo zona, mm): 17,00 ± 0,18; 21,00 ± 0,08; 25,00 ± 0,06 (Jagadeesh et al., 2011).
1.4.3 Chloro dioksidas
Chloro dioksidas žudo mikroorganizmus pažeisdamas ląstelių membranas ir oksiduodamas ląstelių komponentus. Ši medžiaga tirpi vandenyje, tačiau su vandeniu ji nereaguoja. Chloro dioksido antimikrobinis veiksmingumas neturi įtakos pH ir yra
21 efektyvesnis negu ozonas ir chloras. Chloro dioksidas inaktyvuoja bakterijas arba stabdo jų tolimesnę replikaciją (bakteriostatinis veikimas). Todėl jis naudojamas siekiant sumažinti pradinę mikroorganizmų koncentraciją. Jis taip pat naudojamas apdoroto maisto tinkamumo vartoti terminui prailginti; tinkamas apdoroti maltai mėsai ir mėsos produktams (Pohlman et al., 2002).
22
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS
Mokslinis tiriamasis darbas buvo atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Maisto saugos ir kokybės katedroje 2013 m. sausio – spalio mėn.
Tyrimų laboratorijoje buvo ištirtas Listeria monocytogenes bakterijų atsparumas įvairioms cheminėms medžiagoms: acto rūgščiai, pieno rūgščiai, cinamaldehidui, chloro dioksidui. Buvo naudotos įvairios šių medžiagų koncentracijos: acto rūgšties – 2 %, 3 %, 5 %, pieno rūgšties – 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, cinamaldehido - 0,5 %, 1,5 %, 3 %, chloro dioksido – 5 ppm ir 15 ppm. Atsparumas buvo vertintas užkrečiant žalią atšildytą (prieš tai užšaldytą) jautieną. Taip pat buvo nustatytas šių medžiagų poveikis bendram mikroorganizmų skaičiui. Mėsos žaliava buvo perkama įvairiose mėsos ir jos produktų prekybos vietose.
2.1 L. monocytogenes skaičiaus nustatymas
Mėsos žaliavos ir bakterijų kultūros paruošimas tyrimui. Prieš tai užšaldyta
mėsos žaliava (jautiena) buvo atšildoma per naktį + 4 °C temperatūroje (šaldytuve).
Naudota bakterijų kultūra (išskirta iš šaltai rūkytų žuvies produktų ir laikyta –80 °C temperatūroje) per 24 valandas buvo išauginta BHI sultinyje + 37 °C (Gill et al., 2004). Bakterijų skaičius nustatytas pamatavus tirpalo su bakterijomis optinį tankį spektrofotometru, kai bandos ilgis 600 nm. Atliekant OD (optical density – optinis tankis) optimizavimą, matuojamas pradinės (nepraskiestos) kultūros optinis tankis ir stengiamasi privesti prie OD600=0,05 (~107 bakterijų).
Tyrimo eiga ir bakterijų skaičiaus nustatymas. Listeria monocytogenes
auginimui naudotos Petri lėkštelės su Listeria agaru pagal Ottaviani ir Agosti (ALOA). Lėkštelės markeriu iš dugno pusės padalintos į aštuonias dalis ir surašoma reikiama informacija (0 – 7 skaičiai reiškia praskiedimo laipsnį) (2 pav.).
2 pav. Informacija, kuri surašoma ant lėkštelės prieš atliekant sėjimą
1
2
3
4
5
6 7
0
Kultūros Nr. kita info.23
Jautienos užkrėtimas: užkrėstos mėsos mėginiai sudedami į maišelį ir užpilami
100 ml skysčio su bakterijomis ir laikomi 2 min. 20 °C temperatūroje. Mėsos mėginiai nuvarvinami ir dedami i kitus sterilius maišelius ir laikomi 1 val. 4 °C temperatūroje, kad prisitvirtintų bakterijos. Po laikymo 1 val. šaldytuve į atskirus maišelius su mėsos žaliava įpilama 200 ml atitinkamos koncentracijos tiriamos cheminės medžiagos ir laikoma 2 min. 20 °C temperatūroje. Tada 10 g mėsos skiedžiama su 90 ml buferinio peptono vandens (BPV), homogenizuojama ir atliekami praskiedimai.
Tyrimui paruošiami maišeliai su mėginiais: 1 – užkrėtimo kontrolei (užkrėstas, bet nepaveiktas chemine medžiaga), 2 – užkrėstas, paveiktas tam tikros koncentracijos chemine medžiaga (pvz.: 2 % pieno rūgštimi), kiti mėginiai ruošiami analogiškai, panaudojant kitokią koncentraciją arba kitą cheminę medžiagą. Tiriama buvo iškart paveikus užkrėstą mėsos žaliavą, po 4, 24 ir 48 valandų.
Pradinės bakterijų kultūros praskiedimai atliekami taip:
į stovą sudedami 7 sterilūs 1,5 ml mėgintuvėliai, kurių kiekvienas pripildomas 900 µl skiediklio (BPV). Uždarius mėgintuvėlius ant dangtelių surašomi skaičiai nuo 1 iki 7, kas atitinka bakterijų kultūros praskiedimo laipsnį.
100 µl pradinės bakterijų kultūros (0 kultūra) perkeliama į 1 mėgintuvėlį su 900 µl skiediklio (pirmas praskiedimas). Gerai sumaišius „Vortex“ maišykle 100 µl iš pirmo mėgintuvėlio perkeliama į antrą (antras praskiedimas) ir t.t. iki 7 praskiedimo.
Iš kiekvieno mėgintuvėlio (0 – 7) dedami trys taškai po 10 µl bakterijų suspensijos ant atitinkamo trikampėlio lėkštelėje (du taškai išoriniame lėkštelės krašte ir vienas link centro) taip, kad jie nesusilietų. Palaukiama kol išdžius ir inkubuojama 37 °C temperatūroje 48 val. Praėjus inkubacijos laikui skaičiuojamos kolonijos visuose trijuose taškuose tame trikampyje, kuriame kolonijos aiškiai matomos ir įmanoma jas suskaičiuoti. Pvz.: trikampyje 4 suskaičiuojamos 8, 10 ir 15 kolonijų. Kolonijas sudarančių bakterijų skaičius (KSV/g), išvedant vidurkį apskaičiuojamas taip:
8 + 10 + 15 / 3 = 11
11 x 102 x 104 = 11 x 106 = 1,1 x 106 ksv/g
102 pridedama todėl, kad tyrimui naudota tik 100 µl t.y. 1/10 nuo 1 ml pradinės kultūros ir
24
2.2 Bendro mikroorganizmų skaičiaus nustatymas
Bendras mikroorganizmų skaičius (BMS) nustatytas vadovaujantis LST EN ISO 4833:2003 „Maisto ir pašarų mikrobiologija. Bendras metodas.“ Šiame standarte pateiktas mikroorganizmų kolonijų, išaugusių standžioje terpėje aerobinėmis sąlygomis 30 °C temperatūroje, bendras skaičiavimo metodas.
Bendras mikroorganizmų skaičius buvo nustatytas taip: į dvi Petri lėkšteles įpilta po 1 ml 10-1 paruoštos pradinės suspensijos, o į kitas dvi – po 1 ml 10-2 produkto mėginio praskiedimo ir įpilta 10 – 15 ml Plate count agar (PCA) mitybinės terpės ir sukamaisiais judesiais išmaišoma. Tokiomis pačiomis sąlygomis paruoštos ir kitos Petri lėkštelės su dešimtkarčiais tiriamo mėginio skiediniais. Sustingus terpei, lėkštelės inkubuotos į termostatą 30 °C ± 1 °C temperatūroje 72 ± 3 val. Įvertintos lėkštelės turinčios ne mažiau kaip 15 ir ne daugiau kaip 300 kolonijų.
Po inkubacijos mikroorganizmų skaičius nustatytas pagal tokią formulę: N = _________ΣC_______
V (n1 + 0,1 x n2) x d
Čia: ΣC – kolonijų, suskaičiuotų ant visų neatmestų lėkštelių suma; n1 – pirmojo
skiedinio neatmestų lėkštelių skaičius; n2 – antrojo skiedinio neatmestų lėkštelių skaičius; d –
skiedimo laipsnis, atitinkantis pirmąjį skiedinį.
2.3 Statistinė duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė atlikta statistiniu paketu „R“. Apskaičiuotos rodiklių vidutinės reikšmės (X ), vidurkių paklaidos (±m), standartiniai nuokrypiai. Paklaidos
apskaičiuojamos tais pačiais dydžiais, kaip ir atitinkami statistiniai rodikliai. Statistinio įvertinimo tikslumui ir patikimumui nustatyti apskaičiuoti vidurkių skirtumų patikimumai lyginti pagal Studento (t) kriterijų (reikšmė statistiškai patikima, kai P<0,05).
25
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1 Įvairių cheminių medžiagų poveikis Listeria monocytogenes
bakterijoms
Žinoma, kad įvairios cheminės bei natūralios medžiagos gali sumažinti bakterijų kiekį arba slopinti jų kiekio didėjimą produktuose.
Mūsų tyrimų duomenimis efektyviausia cheminė medžiaga slopinanti Listeria
monocytogenes bakterijų augimą buvo pieno rūgštis.
2 lentelė. Listeria monocytogenes skaičiaus kitimas jautienoje paveikus
skirtingų koncentracijų pieno rūgštimi
Mėginio Nr.
Pieno rūgšties koncentracija
(%)
Listeria monocytogenes skaičius (KSV/g)
Prieš paveikiant
Iškart po
paveikimo Po 4 val. Po 24 val. Po 48 val.
Kontrolė 0 2,0 x 105 2,1 x 105 3,1 x 105 1,0 x 106 5,0 x 106 1 2 2,0 x 105 6,3 x 104 3,0 x 103 5,3 x 103 3,0 x 103 2 2 1,0 x 105 8,3 x 104 4,0 x 103 6,3 x 103 4,0 x 103 3 2 3,1 x 105 8,3 x 104 3,3 x 104 1,7 x 104 3,3 x 103 X ± m 2,0 x 10 5 ± 7,4 x 104 7,6 x 104 ± 8,2 x 103 1,3 x 104 ± 1,2 x 104 9,5 x 103 ± 4,6 x 103 3,4 x 103 ± 3,6 x 102 1 3 3,1 x 105 1,0 x 104 3,0 x 104 1,6 x 103 8,0 x 103 2 3 1,0 x 105 4,0 x 104 1,3 x 103 1,3 x 103 3,3 x 103 3 3 2,0 x 105 3,3 x 104 1,7 x 103 1,3 x 103 4,0 x 103 X± m 2,0 x 10 5 ± 7,4 x 104 2,8 x 104 ± 1,1 x 104 1,1 x 104 ± 1,2 x 104 1,4 x 103 ± 1,2 x 102 5,1 x 103 ± 1,8 x 103 1 4 3,1 x 105 8,3 x 103 6,3 x 104 3,3 x 104 3,3 x 103 2 4 1,0 x 105 6,3 x 102 8,3 x 103 7,7 x 103 8,3 x 102 3 4 2,0 x 105 6,0 x 102 6,3 x 103 6,3 x 103 6,3 x 102 X± m 2,0 x 10 5 ± 7,4 x 104 3,2 x 103 ± 3,1 x 103 2,6 x 104 ± 2,3 x 104 1,6 x 104 ± 1,1 x 104 1,6 x 103 ± 1,1 x 103 1 5 3,1 x 105 9,0 x 103 1,6 x 105 2,0 x 104 4,0 x 103 2 5 1,0 x 105 3,0 x 102 3,6 x 103 6,0 x 102 3,3 x 102 3 5 2,0 x 105 6,0 x 102 3,6 x 103 4,0 x 10³ 4,0 x 102 X± m 2,0 x 10 5 ± 7,4 x 104 3,3 x 102 ± 3,5 x 103 7,7 x 103 ± 5,1 x 103 8,2 x 103 ± 7,3 x 103 1,6 x 103 ± 1,5 x 103
26 Lyginant pradinę Listeria monocytogenes bakterijų koncentraciją mėginiuose su jų koncentracija po paveikimo pieno rūgštimi, praėjus 48 valandoms, bakterijų skaičius sumažėjo net 59,2 karto paveikus 2 % koncentracijos pieno rūgštimi, 39,9 karto paveikus 3 % koncentracijos pieno rūgštimi, 128,2 karto paveikus 4 % koncentracijos ir 129 kartus paveikus 5 % koncentracijos pieno rūgštimi (p<0,05). Lyginant su kontroliniu mėginiu listerijų skaičius nuo pradinės koncentracijos per 48 valandas padidėjo 25 kartus. Iškart po užkrėstų mėginių peveikimo pieno rūgštimi silpnesniu poveikiu pasižymėjo 3 % ir 2 % pieno rūgštis, tačiau laikui bėgant jų poveikio stiprumas beveik prilygo 4 % ir 5 % koncentracijos pieno rūgšties poveikiui.
Žemiau pateiktoje diagramoje (3 pav.) pavaizduota, kaip kito Listeria
monocytogenes bakterijų skaičius jautienoje per tam tikrą laiko tarpą, paveikus 2 %, 3 %, 4 %
ir 5 % pieno rūgštimi.
3 pav. Listeria monocytogenes skaičiaus kitimas jautienoje, paveikus skirtingų
koncentracijų pieno rūgštimi
Paveikus acto rūgštimi mėsos žaliavą užkrėstą L. monocytogenes buvo nustatyta, kad bakterijų skaičius kinta netolygiai, jis žymiai sumažėja iškart po paveikimo rūgštimi, tada pradeda didėti ir praėjus 48 valandoms vėl mažėja.
27 3 lentelė. Listeria monocytogenes skaičiaus kitimas jautienoje, paveikus skirtingų
koncentracijų acto rūgštimi
Mėginio Nr.
Acto rūgšties koncentracija
(%)
Listeria monocytogenes skaičius (KSV/g)
Prieš paveikiant
Iškart po
paveikimo Po 4 val. Po 24 val. Po 48 val.
Kontrolė 0 6,3 x 105 6,3 x 105 7,3 x 105 1,2 x 106 1,6 x 106 4 2 6,3 x 105 3,3 x 105 3,6 x 105 4,0 x 105 3,6 x 105 5 2 1,0 x 106 2,3 x 105 2,6 x 105 5,6 x 105 2,6 x 105 6 2 4,0 x 105 2,3 x 105 3,3 x 105 2,0 x 105 4,0 x 105 X ± m 6,8 x 10 5 ± 2,1 x 105 2,6 x 105 ± 4,1 x 104 3,2 x 105 ± 3,6 x 104 3,9 x 105 ± 1,2 x 105 3,4 x 105 ± 5,1 x 104 4 3 4,0 x 105 3,6 x 105 4,6 x 105 5,6 x 105 4,6 x 105 5 3 1,0 x 106 1,6 x 105 1,3 x 105 4,3 x 105 8,3 x 104 6 3 6,3 x 105 2,3 x 105 3,3 x 105 5,6 x 105 7,3 x 104 X ± m 6,8 x 10 5 ± 2,1 x 105 2,5 x 105 ± 7,2 x 104 3,1 x 105 ± 1,2 x 105 5,2 x 105 ± 5,3 x 104 2,1 x 105 ± 1,6 x 105 4 5 4,0 x 105 2,2 x 105 2,6 x 105 4,0 x 105 3,3 x 105 5 5 1,0 x 106 2,0 x 105 2,6 x 105 3,6 x 105 1,2 x 105 6 5 6,3 x 105 2,3 x 105 2,0 x 105 3,3 x 105 2,6 x 105 X ± m 6,8 x 10 5 ± 2,1 x 105 2,2 x 105 ± 1,1 x 104 2,4 x 105 ± 2,4 x 104 3,6 x 105 ± 2,5 x 104 2,4 x 105 ± 7,6 x 104
Iškart po paveikimo acto rūgštimi bakterijų skaičius sumažėja 2,6 karto (paveikus 2 % koncentracijos acto rūgštimi.), 2,7 karto (paveikus 3 % koncentracijos acto rūgštimi), 3,1 karto (paveikus 5 % koncentracijos acto rūgštimi), tačiau laikui bėgant bakterijų skaičius vėl pradeda didėti ir praėjus 24 valandoms jis padidėja 1,5 karto (paveikus 2 % acto rūgštimi), 2,1 karto (paveikus 3 % acto rūgštimi) ir 1,7 karto (paveikus 5 % acto rūgštimi) (p>0,05). O praėjus 48 valandoms bakterijų skaičius vėl pradeda mažėti, tačiau tik 3 % koncentracijos acto rūgšties poveikis yra stipresnis po 48 valandų lyginant su poveikiu iškart paveikus, kitų koncentracijų acto rūgšties poveikis (2 % ir 5 %) buvo silpnesnis. Lyginant su kontroliniu mėginiu, listerijų skaičius per 48 valandas padidėjo 2,5 karto. Acto rūgšties poveikio L.
28 4 pav. Listeria monocytogenes skaičiaus kitimas jautienoje, paveikus skirtingų
koncentracijų acto rūgštimi
Cinamaldehido poveikis Listeria monocytogenes bakterijoms buvo nustatytas iškart paveikus, praėjus 24, 48 ir 96 valandoms. Bakterijų kiekis iki 24 valandų tolygiai mažėjo, o praėjus 24 valandoms L. monocytogenes kiekis ėmė didėti ir po 96 valandų jų kiekis žymiai išaugo (4 lentelė).
29 4 lentelė. Listeria monocytogenes skaičiaus kitimas jautienoje, paveikus
skirtingomis cinamaldehido koncentracijomis
Mėginio Nr.
Cinamaldehido koncentracija
(%)
Listeria monocytogenes skaičius (KSV/g)
Prieš paveikiant
Iškart po
paveikimo Po 24 val. Po 48 val. Po 96 val.
Kontrolė 0 4,3 x 105 4,3 x 105 5,7 x 105 1,2 x 106 1,0 x 107 7 0,5 4,3 x 105 6,3 x 105 2,6 x 105 4,6 x 105 8,0 x 105 8 0,5 5,7 x 105 1,4 x 105 1,3 x 105 1,0 x 105 2,7 x 105 9 0,5 4,0 x 105 2,6 x 105 1,4 x 105 2,8 x 105 3,0 x 105 X± m 4,7 x 10 5 ± 6,4 x 104 3,4 x 105 ± 1,8 x 105 1,8 x 105 ± 5,1 x 104 2,8 x 105 ± 1,8 x 104 4,6 x 105 ± 2,1 x 105 7 1,5 4,3 x 105 6,0 x 105 1,3 x 105 1,3 x 105 3,6 x 105 8 1,5 5,7 x 105 1,0 x 105 9,7 x 104 2,0 x 105 2,0 x 105 9 1,5 4,0 x 105 2,0 x 105 3,6 x 104 2,2 x 105 2,3 x 105 X± m 4,7 x 10 5 ± 6,4 x 104 3,0 x 105 ± 1,9 x 105 2,0 x 105 ± 1,0 x 105 1,8 x 105 ± 3,3 x 104 2,6 x 105 ± 6,0 x 104 7 3 4,3 x 105 2,8 x 105 1,3 x 105 8,3 x 105 1,0 x 106 8 3 5,7 x 105 4,0 x 105 1,3 x 105 2,0 x 105 6,0 x 105 9 3 4,0 x 105 3,0 x 105 1,0 x 105 2,6 x 105 5,7 x 105 X± m 4,7 x 10 5 ± 6,4 x 104 3,3 x 105 ± 4,5 x 104 1,2 x 105 ± 1,2 x 104 4,3 x 105 ± 2,5 x 105 7,2 x 105 ± 1,7 x 105
Paveikus 0,5 % cinamaldehido koncentracijos tirpalu L. monocytogenes kiekis mėsos žaliavoje po 24 valandų sumažėjo 2,6 karto, 1,5 % koncentracijos tirpalu – 2,4 karto ir 1,5 % koncentracijos tirpalu – 3,9 karto (p<0,05). Po to listerijų skaičius pradėjo didėti ir praėjus 96 valandoms lyginant su jų kiekiu buvusiu po 24 valandų padidėjo 2,6 karto (0,5 % cinamaldehido), 1,3 karto (1,5 % cinamaldehido), 6 kartus (3 % cinamaldehido). 3 % koncentracijos cinamaldehido tirpalo poveikis bakterijoms po 24 val. buvo reikšmingai mažesnis negu 0,5 % ir 1,5 % koncentracijos tirpalų (p<0,05). Lyginant su kontroliniu mėginiu (užkrėstas, bet nepaveiktas cinamaldehidu), listerjų skaičius per 48 valandas padidėjo 2,8 karto, o per 96 valandas – 23,3 karto.
Skirtingų koncentracijų cinamaldehido poveikis listerijoms mėsos žaliavoje (jautienoje) pavaizduotas 5 pav.
30 5 pav. Listeria monocytogenes skaičiaus kitimas jautienoje, paveikus
skirtingomis cinamaldehido koncentracijomis
Ištyrus chloro dioksido poveikį L. monocytogenes bakterijoms buvo nustatytas tik trumpalaikis listerijų augimą slopinantis poveikis, kuris trunka iki 4 valandų, po to bakterijų skaičius ima sparčiai didėti.
5 lentelė. Listeria monocytogenes skaičiaus jautienoje kitimas, paveikus chloro
dioksidu Mėginio Nr. Chloro dioksido koncentracija (ppm)
Listeria monocytogenes skaičius (KSV/g)
Prieš paveikiant
Iškart po
paveikimo Po 4 val. Po 24 val. Po 48 val.
Kontrolė 0 1,0 x 104 1,0 x 104 1,0 x 104 1,2 x 104 1,7 x 104 10 5 1,0 x 104 4,0 x 103 2,4 x 103 2,6 x 104 2,3 x 104 11 5 1,2 x 104 3,0 x 103 3,3 x 103 1,7 x 103 1,0 x 104 12 5 1,0 x 104 3,3 x 103 3,0 x 103 2,0 x 103 1,6 x 104 X± m 1,1 x 10 4 ± 8,2 x 102 3,4 x 103 ± 3,6 x 102 2,9 x 103 ± 3,2 x 102 9,9 x 103 ± 9,8 x 103 1,6 x 104 ± 4,6 x 103 10 15 1,0 x 104 1,0 x 103 1,3x 103 2,3 x 103 1,3 x 103 11 15 1,2 x 104 2,3 x 103 2,4 x 103 7,0 x 103 4,3 x 104 12 15 1,0 x 104 1,7 x 103 2,0 x 103 5,6 x 103 3,3 x 104 X± m 1,1 x 10 4 ± 8,2 x 102 6,8 x 103 ± 6,3 x 103 1,9 x 103 ± 3,9 x 102 5,0 x 103 ± 1,7 x 103 2,6 x 104 ± 1,5 x 104
31 Paveikus chloro dioksidu Listeria monocytogenes bakterijas, iki 4 valandų bakterijos veikiamos slopinančiai ir jų kiekis sumažėja 3,7 karto (5 ppm koncentracijos tirpalu) ir 5,6 karto (paveikus 15 ppm koncentracijos tirpalu) (p<0,05). Vėliau listerijų kiekis sparčiai didėja, praėjus 48 valandoms atitinkamai 1,5 ir 2,4 karto viršija pradinę bakterijų koncentraciją (p>0,05). Lyginant bakterijų skaičių po 4 valandų su skaičiumi, kuris buvo nustatytas po 48 valandų, listerijų kiekis padidėjo 5,6 karto (5 ppm) ir 13,6 karto (15 ppm). Kontroliniame mėginyje L. monocytogenes skaičius per 48 valandas padidėjo 1,7 karto.
6 pav. Listeria monocytogenes skaičiaus jautienoje kitimas, paveikus chloro
32
3.2 Įvairių cheminių medžiagų poveikis bendram mikroorganizmų
skaičiui
Pieno rūgštis bendram mikroorganizmų skaičiui kaip ir L. monocytogenes bakterijoms turėjo didelę įtaką. Efektyviausiai veikė 3 % ir 4 % koncentracijos pieno rūgšties tirpalas. Mažiausiu slopinamuoju poveikiu pasižymėjo 2 % koncentracijos pieno rūgšties tirpalas. Lyginant su pradine bakterijų koncentracija jų skaičius paveikus 2 % koncentracijos pieno rūgštimi per 48 valandas sumažėjo 5,5 karto, 3 % - sumažėjo 22,6 karto, 4 % - sumažėjo 17,2 karto ir 5 % - sumažėjo 18 kartų (p<0,05). Lyginant su kontroliniu mėginiu (užkrėstas, bet nepaveiktas pieno rūgštimi), BMS per 48 valandas padidėjo 61,5 karto.
7 pav. Bendro mikroorganizmų skaičiaus kitimas jautienoje, paveikus įvairių
koncentracijų pieno rūgštimi
Pieno rūgšties slopinamasis poveikis Listeria monocytogenes bakterijoms ir bendram mikroorganizmų skaičiui yra panašus, tačiau palyginus gautus rezultatus galima teigti, jog didesnį slopinmąjį poveikį pieno rūgštis daro listerijoms.
33 Bendram mikroorganizmų skaičiui acto rūgštis slopinamąjį poveikį daro tik tam tikrais etapais (t.y. iki 4 val. ir nuo 24 iki 48 val.). Didžiausias poveikis pastebimas per pirmas 4 valandas nuo paveikimo, vėliau bakterijų skaičius ima sparčiai didėti ir po 24 valandų jis beveik pasiekia pradinį bakterijų skaičių (paveikus 3 % ir 5 % koncentracijos acto rūgšties tirpalu) (p>0,05), o 2 % koncentracijos acto rūgšties tirpalas veikia stipriau ir mikroorganizmų skaičius nuo 4 iki 48 valandos kinta nežymiai (8 pav.). Kontroliniame mėginyje (užkrėstas, bet nepaveiktas acto rūgštimi) BMS per 48 valandas padidėjo 18,3 karto.
Palyginus rezultatus gautus tikrinant acto rūgšties poveikį L. monocytogenes bakterijoms ir BMS galima teigti, kad listerijos šiai medžiagai yra atsparesnės.
8 pav. Bendro mikroorganizmų skaičiaus jautienoje kitimas, paveikus
skirtingų koncentracijų acto rūgštimi
Atlikus tyrimus su cinamaldehidu nustatyta, kad šios medžiagos poveikis BMS yra panašus kaip ir listerijoms. Iki 24 valandų visų naudotų koncentracijų tirpalai slopino bakterijų augimą, 0,5 % ir 3 % koncentracijos tirpalai bakterijų augimą slopino dar ir iki 48 valandų. Vėliau bakterijų skaičius pradėjo didėti. Veiksmingiausi buvo 0,5 % ir 3 % koncentracijos cinamaldehido tirpalai, kurie bakterijų skaičių nuo pradinio jų kiekio per 48 valandas sumažino atitinkamai 3,2 karto (nuo 6,1 x 105 ± 1,1 x 105 iki 1,9 x 105 ± 2,5 x 104 )
ir 2,9 karto (nuo 6,1 x 105 ± 1,1 x 105 iki 2,1 x 105 ± 4,0 x 104) (p<0,05). Gauti rezultatai
rodo, kad cinamaldehidas didesnį slopinamąjį poveikį turi BMS nei L. monocytogenes bakterijoms.
34
9 pav. Bendro mikroorganizmų skaičiaus kitimas jautienoje, paveikus
skirtingomis cinamaldehido koncentracijomis
Atlikus bandymus su chloro dioksidu (5 ppm ir 15 ppm koncentracija) nustatyta, kad bendras mikroorganizmų skaičius laikui bėgant tik didėjo. Per 48 valandas BMS padidėjo 2 kartus (p>0,05) (taip pat ir kontroliniame mėginyje). Lyginant šios medžiagos poveikį listerijoms ir BMS, L. monocytogenes buvo jautresnės šiai medžiagai, nes chloro dioksidas listerijoms sukėlė trumpalaikį slopinamąjį poveikį, kuris truko iki 4 valandų.
10 pav. Bendro mikroorganizmų skaičiaus jautienoje kitimas, paveikus
35
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Listeria monocytogenes – vienas pavojingiausių maisto produktuose randamų
patogeninių mikroorganizmų. Listeriozė – liga, kurią sukelia šis mikroorganizmas yra potencialiai mirtina (mirtingumas siekia 20–30 %) (Miettinen et al., 2006; Liu, 2006;
Ramaswamy et al., 2007). Listerijos yra nepaprastai gyvybingos, jos gali daugintis gamybos aplinkoje ir pakartotinai užkrėsti produktus. Ant daugelio paviršių L. monocytogenes gali sudaryti „bioplėvelę“, kurios dėka padidėja atsparumas plovimo ir dezinfekavimo
medžiagoms bei inaktyvavimo metodams (Wiedmann et al., 2002; Pan et al., 2006; Lemon et al., 2007). Dėl šių priežasčių listerijų kontrolei ir prevencijai žalioje mėsoje ir jos
produktuose turi būti skiriamas ypatingas dėmesys.
Listeria monocytogenes kelia didelį pavojų žmonių sveikatai, ypatingai rizikos
grupės asmenims (vaikams, vyresnio amžiaus asmenims, nėščioms moterims, asmenims su nusilpusia imunine sistema) (Liu, 2006; Ramaswamy et al., 2007; Garrido et al., 2010; ULAC, 2013), todėl šiuo tyrimu buvo norima nustatyti, kuri iš tirtų cheminių medžiagų (pieno rūgštis, acto rūgštis, cinamaldehidas, chloro dioksidas) daro didžiausią neigiamą poveikį šiems patogenams.
Nustatyta, kad iš visų tirtų medžiagų didžiausią inhibitorinį poveikį listerijoms mėsos žaliavoje turi pieno rūgštis. Palyginus naudotas pieno rūgšties koncentracijas poveikis labai panašus, tačiau veiksmingiausias buvo 5 % koncentracijos pieno rūgšties tirpalas. Bakterijų skaičius sumažėjo nuo 2,0 x 105 iki 1,6 x 103 KSV/g. Skirtumas tarp pradinės
bakterijų koncentracijos ir koncentracijos po 48 valandų buvo 129 kartai (p<0,05). Mūsų tyrimų metu gauti rezultatai panašūs ir į kitų autorių atliktų tyrimų rezultatus (Elmali et al., 2012; Özdemir et al., 2006). Šių autorių tyrimų duomenimis pieno rūgšties (2 % konc.) slopinamasis poveikis L. monocytogenes bakterijoms jautienoje išliko net po 5 dienų. Po 3 dienų listerijų skaičius sumažėjo beveik 60 kartų, o po 5 – apie 80 kartų.
Tyrimo metu gauti duomenys parodė, kad pieno rūgšties poveikis BMS taip pat buvo stiprus. Didžiausią neigiamą poveikį darė 3 % koncentracijos pieno rūgšties tirpalas, kuriuo paveikus mėginius, BMS per 48 valandas sumažėjo 22,6 karto (p<0,05). Lyginant pieno rūgšties poveikį L. monocytogenes bakterijoms ir BMS, žymiai didesnį slopinamąjį poveikį ši medžiaga darė listerijoms.
Antroji pagal veiksmingumą medžiaga buvo cinamaldehidas, kurios neigiamas poveikis išliko iki 24 valandų. Atlikto eksperimento duomenys parodė, kad veiksmingiausias buvo 3 % koncentracijos tirpalas, kuriuo paveikus mėsos žaliavą listerijų kiekis per 24
