RIASSUNTO ...I ABSTRACT ... IV
1. INTRODUZIONE ... 1
XENOPUS LAEVIS COME ORGANISMO MODELLO ... 2
SVILUPPO PRECOCE DELLO XENOPUS LAEVIS... 4
INDUZIONE DEL TESSUTO NEURALE... 6
LA NEURULAZIONE... 7
DIFFERENZIAMENTO DEL TESSUTO NEURALE... 7
LO SVILUPPO DELL’OCCHIO ... 9
STRUTTURA ... 7
La sclera... 10
La cornea... 10
La coroide ... 10
Il corpo ciliare... 10
L’iride ... 10
Il cristallino ... 11
La retina ... 12
EVENTI MORFOGENETICI DELLO SVILUPPO DELL’OCCHIO... 13
La retina ... 13
Il cristallino ... 14
EVENTI MOLECOLARI DELLA SPECIFICAZIONE E DELLO SVILUPPO DELL’OCCHIO... 16
Specificazione del campo morfogenetico dell’occhio (“Eye field”)... 16
Sviluppo e compartimentalizzazione delle vescicole ottiche... 19
Ruolo dei fattori di trascrizione nello sviluppo dell’occhio... 19
LA ZONA DEL MARGINE CILIARE (CMZ)... 26
Zona di specificazione ... 27
Zona proneurale e neurogenica... 27
Zona di determinazione cellulare... 27
Zona differenziativa ... 28
2. SCOPO DELLA TESI ... 29
3. MATERIALI E METODI ... 32
TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE ... 33
AMPLIFICAZIONE DI DNA PLASMIDICO IN CELLULE DI E. COLI ... 33
Plasmidi ... 33
Cloni di ESTs... 35
Preparazione di cellule competenti ... 36
Trasformazione batterica ... 36
Estrazione di DNA plasmidico su piccola scala mediante lisi alcalina (“mini-prep”) ... 37
Estrazione di DNA plasmidico su media scala (“midi-prep”) mediante colonne NUCLEOBOND © AX-100 (Macherey-Nagel) ... 37
Elettroforesi su gel di agarosio ... 37
Stima della concentrazione di DNA e RNA in soluzione... 39
PREPARAZIONE DI DNA LINEARIZZATO... 39
Digestione di DNA con enzimi di restrizione... 39
Purificazione del DNA linearizzato ... 40
PREPARAZIONE DELLA SONDA... 40
Trascrizione in vitro... 40
PREPARAZIONE DEL cDNA PER SUCCESSIVE REAZIONI DI PCR O PCR REAL TIME ... 42
Estrazione e purificazione dell’mRNA ... 42
Retrotrascrizione dell’mRNA in cDNA... 43
PCR... 43
PCR Real Time ... 44
LA MICROINIEZIONE ... 46
Trascrizione e purificazione dell’mRNA “cappato”... 47
LA LIPOFEZIONE... 47
TECNICHE EMBRIOLOGICHE ... 49
COLTURA DI EMBRIONI DI XENOPUS LAEVIS ... 49
FISSAGGIO DEGLI EMBRIONI ... 50
REAZIONE CROMOGENICA DELLA GALATTOSIDASI ... 51
MICRODISSEZIONE DI EMBRIONI ... 51
Asportazione di vescicole ottiche e occhi comletamente differenziati per ibridazioni in situ ... 52
Asportazione di occhi interi e retine per reazioni di PCR e Real Time PCR... 52
PREPARAZIONE DELLE SEZIONI PER L’IBRIDAZIONE IN SITU ... 53
IBRIDAZIONE IN SITU SU EMBRIONI INTERI (WHOLE MOUNT) ... 53
FISSAGGIO DEGLI EMBRIONI DOPO LA RIVELAZIONE ... 56
BLEACHING ... 56
IBRIDAZIONE IN SITU SU CRIOSEZIONI ... 57
FISSAGGIO DELLE SEZIONI DOPO LA RIVELAZIONE... 59
FOTOGRAFIE... 59
4. RISULTATI ... 60
DESCRIZIONE DEL PROGETTO ... 61
PROGETTO DI LAVORO ... 62
ANALISI DELL’ESPRESSIONE DEI TRASCRITTI... 63
IBRIDAZIONE IN SITU SU EMBRIONI NON TRATTATI ... 63
IBRIDAZIONE IN SITU SU ESPIANTI OCULARI E MICRODISSEZIONI DI EMBRIONI... 71
REAL TIME PCR ... 75
STUDI FUNZIONALI ... 78
IBRIDAZIONI IN SITU SU EMBRIONI MICROINIETTATI CON XRX1 O CON MORFOLINO DIRETTO CONTRO XRX1 ... 78
PCR REAL TIME SU EMBRIONI MICROINIETTATI CON XRX1 ... 86
LIPOFEZIONE DI JHDM1D FULL LENGHT ... 88
MICROINIEZIONE DI JHDM1D FULL LENGHT ... 89
5. DISCUSSIONE... 91
ANALISI DEI GENI MUSCOLARI ... 92
MyoD ... 92
Mastr... 95
Pri-mir133/1 ... 96
ANALISI DI JHDM1D ... 97
Jhdm1D... 97
BIBLIOGRAFIA... 103
