Studio del ruolo funzionale e caratterizzazione strutturale del cuprocomplesso TFF1-Cu

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Studio del ruolo funzionale e caratterizzazione strutturale del cuprocomplesso TFF1-Cu

Dottorato in Biochimica e Patologia dell’Azione dei Farmaci Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e Biomediche IX ciclo

Tutor:

Prof. Liberato Marzullo

Dottorando:

Sandro Montefusco 26/01/2012

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Introduzione:

Famiglia dei Trefoil Factors

Costituita da: peptide gastrico pS2/TFF1, peptide spasmolitico SP/TFF2 e fattore intestinale ITF/TFF3

Struttura

- Motivo caratterizzato da tre anse e stabilizzato da tre ponti disolfuro

Funzione

- Ruolo essenziale nei processi di restituzione e rigenerazione epiteliale nel tratto GI

- Coinvolgimento in cruciali processi fisio- patologici: insorgenza e sviluppo neoplastico, proliferazione, differenziamento, migrazione cellulare, apoptosi

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Introduzione:

Lacrimal Glands Hypothalamus – Hypophysis

Bladder

Siti di espressione:

TFF1: stomaco, duodeno, colon, pancreas, ghiandole di Brunner, vescica, ghiandole salivari e lacrimali, epitelio respiratorio, ghiandole mammarie, dotti biliari.

TFF2: stomaco, ghiandole di Brunner, epitelio del dotto pancreatico e biliare.

TFF3: epitelio intestinale, cellule goblet, ghiandole Brunner, utero, mammella, ipotalamo, ipofisi.

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Introduzione:

Carcinoma della mammella

TFF1 indotto da estrogeni TFF1 marker tumorale

Infiammazione

Ulcere intestinali, soggetti affetti dal morbo di Crohn e infezioni da H.

pylori presentano, nelle aree compromesse, elevati livelli di TFF1

Tumor-suppressor

TFF1 ridotto in metaplasie intestinali e adenomi gastrici, TFF1 completamente assente nel 40-60% di carcinomi gastrici

Topi tff1 knockout

sviluppano adenoma gastrico e carcinoma intramucosale

Variazioni dei livelli dei peptidi TFF sembrano essere coinvolte nei

processi neoplastici

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Trefoil Factor 1

TFF1 lega specificamente il rame.

L’interazione induce un cambio di conformazione nella struttura terziaria della proteina.

L’analisi effettuata su intestino di ratti, resi nutrizionalmente carenti di rame, ha mostrato aumento dell’espressione del peptide TFF1.

Real Time tff1

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- Valutare l’espressione di TFF1 in condizioni di depletamento di rame.

- Studiare l’influenza del rame sull’attività biologica della proteina.

- Studiare il ruolo del cuprocomplesso TFF1-Cu nelle infezioni da Helicobacter pylori.

Obiettivi:

- Analizzare il ruolo di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame.

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Espressione di TFF1 in cellule AGS

L’espressione di TFF1 aumenta in condizioni di depletamento di rame

Real Time PCR

** p value = 0,08 * p value < 0,05

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Analisi del promotore: Saggi di Luciferasi

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0 5 10 15

1

Analisi del promotore: Saggi di Luciferasi

anova p<0,05

Nella regione -583/-435 esistono elementi sensibili alle variazioni di concentrazione del metallo che regolano positivamente l’espressione del gene in condizioni di deprivazione di rame

controllo BCS -435

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Analisi del promotore

L’analisi della sequenza -583/-435 con il software Transfac ha mostrato la presenza di un sito putativo Sp1 tra le sequenze consensus con score più elevato

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sonda: p Sp1

sonda: c Sp1

Analisi del promotore

p Sp1: sequenza putativa di legame ad Sp1 del promotore di tff1 m Sp1: sequenza mutata nella regione putativa di legame

c Sp1: sequenza di legame canonica ad Sp1 Scr: sequenza scrambled

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Le proteine degli estratti nucleari legano in modo specifico la

sequenza putativa di legame ad Sp1

sonda: p Sp1

sonda: c Sp1

Analisi del promotore

p Sp1: sequenza putativa di legame ad Sp1 del promotore di tff1 m Sp1: sequenza mutata nella regione putativa di legame

c Sp1: sequenza di legame canonica ad Sp1 Scr: sequenza scrambled

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Obiettivi:

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Rame e forma omodimerica di TFF1

Il rame promuove la formazione dell’omodimero

condizioni riducenti condizioni non riducenti

Western Blot: surnatanti di cellule AGS-AC1

TFF1 dimero TFF1

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Migrazione Cellulare: Wound Healing

AGS-AC1

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BCS

+ dox - dox

* p-value < 0,05

+ dox - dox

distance (m)

*

Migrazione Cellulare: Wound Healing

* p-value < 0,05

(Tosco A, Monti MC, Fontanella B, Montefusco S, D'Andrea L, Ziaco B, Baldantoni D, Rio MC, Marzullo L., Cell Mol Life Sci. 2010)

L’induzione di TFF1 determina un aumento della migrazione cellulare La chelazione di Cu modula negativamente l’attività motogenica di TFF1

AGS-AC1

TFF1

distanza (µm)

24 h

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- Studiare l’influenza del rame nella formazione dell’omodimero di TFF1 e sulla sua attività motogenica.

Obiettivi:

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Rame e secrezione di TFF1 in AGS-AC1

In cellule incubate in eccesso di rame, si osserva un ritardo nella secrezione della proteina

Controllo Cu 10 M Cu 100 M

controllo Cu 10 μM Cu 100 μM

r TFF1

72 h

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KO tff1

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45

1

mg/gr

Fegato Stomaco Intestino

+/+

-/-

AGS-AC1

TFF1 e omeostasi del rame

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TFF1 e omeostasi del rame

AGS-AC1

24 h -S +/- dox

0 20 80 300

Cu 10 M

Cellule iper-esprimenti TFF1 accumulano quantità

maggiori di rame

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AGS-AC1

24 h -S Cu 10 M

+/- dox

0 20 80 120 300 600

BCS 500 M

Cellule iper-esprimenti TFF1 trattengono il rame

per tempi più lunghi

TFF1 e omeostasi del rame

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Alti livelli di rame

Bassi livelli di rame

TFF1 Cu²⁺

TFF1 e omeostasi del rame

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Obiettivi:

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Helicobacter pylori: interazione con TFF1

H. pylori interagisce con TFF1

Ipotesi per l’infezione tessuto- specifica caratteristica del batterio

La porzione oligosaccaridica degli LPS di H. pylori legano TFF1 nella forma dimerica

Il pH ottimale di questa interazione è tra 5.0 - 6.0

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Helicobacter pylori: introduzione

1892 - Il medico italiano Giulio Bizzozero descrisse per la prima volta batteri spiraliformi nello stomaco di animali.

1893, Arch Mickrobiol Anat

1984 - Due ricercatori australiani, Marshall e Warren, descrissero per la prima volta una relazione tra strani bacilli ricurvi, dapprima classificati entro il genere Campylobacter, con forme di gastrite attiva e ulcere duodenali

1984, Lancet; 8390:1311-5

1989 - Classificazione del genere Helicobacter

Goodwin et al 1989, int j syst bacteriol, 39:397

2005 - I due ricercatori australiani ricevono il Nobel per la medicina

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Helicobacter pylori: introduzione

• Gram Negativo

• Dimensioni: 0,5-1 m x 2-4 m

• Microaerofilo: 37°C 3-5 giorni

• Mobile per la presenza di 4-6 flagelli

• Genoma: 1,4 - 1,7 Mb

• Patogeno per l’uomo

• Ureasi positivo

• Trasmissione: orale-orale / fecale-orale / gastro-orale

• Epidemiologia: endemica

adulti bambini

>50 anni 2-10 anni

paesi industrializzati 35-40% 5-10%

paesi in via di sviluppo 80-90% 45-50%

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Helicobacter pylori: fattori di virulenza

Cag island: locus ~ 40 kb, 31 geni.

Molti di questi geni codificano per il sistema di secrezione di tipo IV.

CagA: proteina batterica che transloca nella cellula ospite promuovendo cambiamenti morfologici e alterazioni della membrana plasmatica.

VacA: ^altera ^la permeabilità della membrana mitocondriale promuovendo l’apoptosi; stimola segnali pro-infiammatori;

altera il normale traffico delle vescicole del compartimento endosomiale provocando la formazione di canale e formazioni di vacuoli.

BabA2: lega l’antigene Lewis(b) delle cellule epiteliali gastriche.

Cag Island

Suerbaum S. & Josenhans C., Nature 2007

Cover T.L.. & Blanke S.R.., Nature 2005 Effects of VacA

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Helicobacter pylori: LPS

-Bassa immunogenicità degli LPS di H. pylori

-Particolari variazioni nella componente “Lipide A”

-Infezioni a lungo termine

-Infiammazione cronica promuove un danno gastrico

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Helicobacter pylori: LPS

Lisati Cellulari Frazioni Subcellulari LPS

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Helicobacter pylori:

Influenza di TFF1 nella colonizzazione

Effetti dei trattamenti sulla vitalità di H. pylori

Cu 10 µM BCS 500 µM Dox

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Helicobacter pylori:

Infezione di H. pylori in AGS-AC1

Controllo

+ Dox

AGS-AC1

rosso - H. pylori verde - TFF1

blu - nuclei

130 kDa

CagA

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Infezioni con ceppo H. pylori P12 wild-type

Helicobacter pylori:

T-test : p-value **< 0,01 * <0,05

TFF1 svolge un ruolo significativo nelle infezioni di H. pylori

Il rame modula positivamente l’infezione di H. pylori mediata da TFF1

Cu - + - + Dox - - + +

BCS - + - + Dox - - + +

Hp Hp ^{Cu 10 M}BCS 500 M

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Helicobacter pylori:

P12HP479

(Dolan B. et al.,

dati confidenziali, in stampa)

P12HP1191

Wt P12

HP479 codifica una D-glycero-D-manno-heptosyltrasferase HP1191 codifica una LD heptosyltransferase

Il ceppo mutato P12HP∆1191 non interagisce con TFF1

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Infezioni con ceppo mutato HP479

Helicobacter pylori:

T-test : p-value **< 0,01 * <0,05 Cu - - +

Dox - + +

BCS - - +

Dox - + +

Cu 10 M BCS 500 M

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Infezioni con ceppo mutato HP1191

Helicobacter pylori:

control Dox Dox Cu Cu - - + Dox - + +

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Helicobacter pylori: interazione con TFF1

HT29 MTX E12 (E12):

Subclone di cellule HT29, colon carcinoma umano, caratteristiche per la formazione di uno strato mucoso.

(Alemka A., et al., Infect Immun. 2010)

TFF1 e H. pylori colocalizzano nello strato mucoso

(Dolan et al., dati confidenziali, in stampa)

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Helicobacter pylori: interazione con TFF1

Infezioni in HT-29 E12 con ceppo H. pylori P12 wild-type

T-test : p-value * <0,05

Cu 10 M BCS 500 M

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Rame e strato mucoso

(Alemka A., et al., Infect Immun. 2010)

HT29 MTX E12 (E12):

Subclone di cellule HT29, colon carcinoma umano,

caratteristiche per la formazione di uno strato mucoso.

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Rame e strato mucoso

A B C

D E F

controllo

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controllo Cu

Rame e strato mucoso

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Risultati

• Il rame influenza l’espressione della proteina. Nel promotore di tff1 sono presenti elementi sensibili alle variazioni di concentrazione del metallo.

• Il rame favorisce l’omodimerizzazione di TFF1 e la sua attività motogenica.

• TFF1, nel modello cellulare AGS-AC1, è coinvolto nei processi di assorbimento/secrezione del metallo.

• TFF1 favorisce l’infezione di H. pylori. Il rame modula positivamente l’infezione di H. pylori mediata da TFF1.

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Prospettive future

• Verificare l’effettivo legame di Sp1 sul promotore di TFF1.

• Approfondire il coinvolgimento di TFF1 nei meccanismi di omeostasi del rame.

• Individuare la regione di TFF1 coinvolta nel legame con i LPS di H. pylori.

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Università di Salerno

Dipartimento Scienze Farmaceutiche e Biomediche University College Dublin School of Medicine & Medical Science

Ringraziamenti

Prof. Liberato Marzullo Prof. Alessandra Tosco

Dr. Bianca Fontanella Dr. Roberta Esposito

Dr. Marguerite Clyne

Considero valore sapere in una stanza dov’è il nord, qual è il nome del vento che sta asciugando il bucato. E. de Luca Dr. M.-C. Rio

Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology - CNRS.

Strasbourg, France

Dr. D. Baldantoni

Dipartimento di Chimica - Università di Salerno

Coordinatrice del Dottorato Prof. Antonella Leone