LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Erna Marija Meškytė
Porphyromonas spp. fimbrilino A genų įvairovės tyrimas
Lietuvos šunų dantų apnašose
Diversity of fimbrillin A of Porphyromonas spp. in the
dental plaque of Lithuanian dogs
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: Prof. dr. Ilona Teodora Miceikienė
2
DARBAS ATLIKTAS BIOLOGINIŲ SISTEMŲ IR GENETINIŲ TYRIMŲ INSTITUTE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Porphyromonas spp. fimbrilino A genų įvairovės tyrimas Lietuvos šunų dantų apnašose“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5 SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 7 ĮVADAS ... 8 1 LITERATŪROS APŽVALGA ... 101.1 Periodonto ligos ir jų klasifikacija ... 10
1.2 Periodonto ligų paplitimas, periodontopatinės bakterijos ... 13
1.3 Porphyromonas genties bakterijos ir jų FimA baltymai ... 14
1.4 Molekuliniai tyrimo metodai. HRM metodas Porphyromonas spp. bakterijų genotipavimui 17 2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 20
2.1 Mėginio paėmimas ir tyrimo eiga ... 20
2.2 Terpės ... 20
2.3 Pradmenys ... 21
2.4 Genominės DNR skyrimas: ZR Fungal/Bacterial DNA Kit metodas ... 21
2.5 DNR elektroforezė agarozės gelyje ... 21
2.6 16S RNR polimerazės grandininė reakcija ... 21
2.6.1 PGR reakcija su Woo1 ir Woo2 pradmenimis ... 21
2.6.2 PGR reakcija su Phusion DNR polimeraze ... 22
2.6.3 PGR reakcija su Phusion DNR polimeraze ir DMSO ... 22
2.6.4 PGR reakcija su Hot Start Green polimeraze ... 22
2.6.5 Naudotos PGR programos ... 22
2.6.6 PGR produkto gryninimas ... 23
2.7 DNR ligavimas ... 23
2.8 Elektroimliųjų ląstelių ruošimas ... 23
2.9 E. coli DH5α transformacija elektroporacijos būdu ... 23
2.10 Plazmidžių skyrimas šarminės denatūracijos būdu ... 24
4
2.12 Tikro laiko PGR ir aukštos skiriamosios gebos lydymasis (HRM) ... 25
3. TYRIMO REZULTATAI ... 26
4. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS ... 37
IŠVADOS ... 40
PADĖKA ... 41
5
SANTRUMPOS
BHI – Brain heart infusionDMSO – dimetilsulfoksidas DNR – deoksiribonukleorūgštis dNTP – deoksinukleotidtrifosfatas EDTA – etilendiaminotetraacto rūgštis
HRM (ASGL) – aukštos skiriamosios gebos lydymas IL-β – interleukinas beta
IPTG – izopropil-β-D-tiogalaktozidas kDa – kilodaltonas
NA – Nutrient agar NB – Nutrient broth
NCBI – National Center for Biotechnology Information PGR – polimerazės grandininė reakcija
SDS – natrio dodecilsulfatas
TAE – TRIS-acto rūgšties-EDTA buferinis tirpalas TNF-α – navikų nekrozės faktorius alfa
TRIS – (hidroksimetil)-aminometanas
6
SANTRAUKA
Porphyromonas spp. fimbrilino A genų įvairovės tyrimas Lietuvos šunų dantų apnašose
Erna Marija Meškytė Magistro baigiamasis darbas
Periodonto ligos yra labai dažnos šunų tarpe ir paveikia apie 80 proc. šunų. Dauguma bakterijų, izoliuotų iš šunų periodonto kišenių, yra anaerobinės ir priskiriamos Porphyromonas genties bakterijoms. Porphyromonas gulae rūšies bakterija yra siejama su šunų periodontitu. P. gingivalis bakterija yra siejama su žmonių periodontitu. P. gulae ir P. gingivalis bakterijų sintetinamas 41 kDa masės baltymas yra šios bakterijos fimbrijos dalis. Ši fimbrija yra laikoma pagrindiniu
Porphyromonas spp. patogeniškumo veiksniu. Fimbrilino baltymo variacijos daro įtaką periodonto
ligų vystymuisi. Priklausomai nuo fimbrilino A geno nukleotidų sekos, koduojančios fimbrilino baltymą, yra nustatyti trys P. gulae genotipai: A, B ir C, iš kurių B ir C genotipai yra laikomi patogeniškesniais. P. gingivalis atveju yra išskirti šeši genotipai: I–V ir Ib, iš kurių II genotipas laikomas patogeniškiausiu. Šunų periodonto ligas sukeliančių patogeninių bakterijų identifikavimas ir genotipavimas yra labai svarbus ir leidžia pritaikyti tinkamą prevenciją bei skirti tikslingą gydymą. Norint įvertinti, kokios Porphyromonas genties bakterijos ir kokie Porphyromonas spp. fimA genų variantai yra paplitę Lietuvos šunų dantų apnašose šio tyrimo metu buvo ištirti 36 šunų dantų apnašų mėginiai. Šio tyrimo metu optimizuotos PGR reakcijos sąlygos Porphyromonas spp. fimA geno padauginimui PGR reakcijos būdu ir nustatyta, kad labiausiai tinka naudoti Hot Start Green polimerazė (ThermoFisher Scientific) ir pirma PGR programa: pradinė denatūracija – 94°C 5 min., DNR grandinių atskyrimas – 94°C 30s 30 ciklų, pradmenų prijungimas – 50°C 30 s 30 ciklų, grandinės ilginimas – 72°C 1,5 min 30 ciklų, galutinis grandinės ilginimas –72°C 5 min. PGR būdu padauginus ieškomus Porpyromonas spp. fimA geno DNR fragmentus, išskirtus iš tirtų šunų dantų apnašų ir nustačius jų nukleotidų sekas, identifikuoti 47 nauji fimA geno variantai. Taip pat šio tyrimo metu ištirta, kad Lietuvos šunų dantų apnašose yra paplitusios P. gulae (73,33 proc.), P. gingivalis (20 proc.) arba abiejų rūšių (6,67 proc.) bakterijos. Atlikus 47 FimA baltymo sekų filogenetinė analizę nustatyta, kad Lietuvos šunų dantų apnašose aptinkami P. gulae fimA A (46,67 proc.), P. gulae fimA B (26,67 proc.), P. gingivalis fimA II (20 proc.) ir mišrūs genotipai (6,67 proc.). Ieškant greitesnių ir paprastesnių genotipavimo šio tyrimo metu Porphyromonas spp. bakterijų genotipavimas atliktas ir taikant aukštos skiriamosios gebos lydymosi metodą ir nustatyta, kad ASGL tinka Porphyromonas spp. bakterijų fimA, išskirtų iš šunų dantų apnašų genotipavimui.
Raktažodžiai: Porphyromonas, gulae, gingivalis, periodonto ligos, šunų, periodontopatinės, aukštos skiriamosios gebos lydymasis.
7
SUMMARY
Diversity of fimbrillin A of Porphyromonas spp. in the dental plaque of Lithuanian dogs Erna Marija Meškytė
Master‘s Thesis
Periodontal diseases are one of the most common infectious diseases in dogs. It has been estimated that appoximately 80 % of dogs demonstrate some degree of periodontal diseases. Black-pigmented anaerobic bacteria were isolated from the periodontal pockets of dogs, in particular
Porphyromonas spp.. Porphyromonas gulae is associated with canine periodontitis. Human
periodontitis is associated with P. gingivalis. Both P. gulae and P. gingivalis produce 41 kDa fimbrillin protein. The cell surface filmbrillin, a subunit of fimbriae, is known to be one of the major factors of Porphyromonas spp. for periodontitis. The fimbria variations have an influence on the development of periodontal diseases. There are three genotypes of P. gulae of fimA encoding FimA (A, B, C), among which types B and C are considered more invasive. There are six genotypes of P.
gingivalis of fimA encoding FimA (I through V and Ib), among which type II is considered the most
invasive. The identification and genotyping of canine periodontal pathogens, such as P. gulae allows for a more directed approach to companion animal periodontitis pervention and treatment. In the present study 36 oral swab probes of dogs were analysed to determined which Porphyromonas spp and which fimA genotypes are perdominant in the dental plaque of Lithuanian dogs. During this study the PCR reaction was optimised according to Porphyromonas spp. fimA gene and it was figured out that the best results are accomplished using Hot Start Green polymerase (ThermoFisher Scientific) and the fist PCR program: initial denaturation – 94°C 5 min., denaturation – 94°C 30s 30 cycles, annealing – 50°C 30 s 30 cycles, extention – 72°C 1,5 min 30 cycles, final extention – 72°C 5 min.. 47 new variations of Porphyromonas spp. fimA in the dental plaque of the Lithuanian dogs were identified using PCR amplification and DNR sequencing.Analysis of 36 speciments from the dental plaque of dogs revealed that 73,33 %, 20 % and 6,67 % of them contained Porphyromonas gulae,
Porphyromonas gingivalis and both species. Phylogenetic analysis of 47 sequence of amino acids of
FimA protein revealed that 46,67 %, 26,67 %, 20 % and 6,67% of them contained P. gulae fimA A,
P. gulae fimA B. P. gingivalis fimA II and both P. gulae fimA A and P. gingivalis fimA II genotypes.
To overcome the disadvantages of other typing techniques the new HRM-based genotyping methode was applied and it was suitable for the Pophyromonas spp. fimA genotyping of the dental plaque of dogs.
Key words: Porphyromonas, gulae, gingivalis, dog, periodontal disease, HRM, periodontopathic.
8
ĮVADAS
Periodonto ligos (gingivitas ir periodontitas) yra viena iš dažniausiai suaugusius šunų tarpe sutinkamų infekcinių ligų. Skirtingų tyrimų duomenimis periodonto ligos nustatytos apie 80 proc. tirtų šunų. Periodonto ligos paveikia visų veislių šunis ir ligos pasireiškimas progresuoja su šuns amžiumi. Gingivitas yra visiškai grįžtamas ligos etapas, kurio metu pasireiškia hialitozė, dantenų uždegimas, kraujavimas bei patinimas. Tuo tarpu periodontito sukeliami pažeidimai yra negrįžtami ir šio etapo metu pažeidžiamos gilesnės danties atraminės bei kaulinės struktūros, periodonto raištis, susiformuoja periodonto kišenės ir prarandamas danties stabilumas (1).
Juodą pigmentą sintetinačios bakterijos buvo išskirtos iš šunų periodonto kišenių, dauguma šių izoliuotų bakterijų yra anaerobinės ir priskiriamos Porphyromonas genties bakterijoms, ypatingai dažnai šunų burnos ertmėje nustatoma Porphyromonas gulae rūšies bakterija (2). Ši bakterija žymiai dažniau ir didesniais kiekiais aptinkama periodontitu sergančių šunų periodonto kišenėse nei sveikų šunų burnos ertmėje. Dėl to P. gulae yra siejama su šunų periodontitu (2, 3). Nors Porphyromonas spp. bakterijų svarba šunų periodonto vystymuisi jau yra įrodyta, tačiau yra atlikta palyginus mažai tyrimų, kurių metu būtų tiriamos šunų burnos ertmę kolonizuojančios Porphyromonas spp. bakterijos bei jų patogeniškumo faktoriai (2, 3).
Hamada ir kiti mokslininkai nustatė, kad P. gulae bakterijų sintetinamas 41 kDa masės baltymas yra šios bakterijos fimbrijos dalis. Būtent ši fimbrija ir yra laikoma pagrindiniu
Porphyromonas spp. patogeniškumo veiksniu (4). Šis veiksnys yra siejamas su bakterijų adhezinėmis
savybėmis – invazija į dantenų ląsteles ir uždegiminio proceso sukėlimu (5). Šunų ir žmonių etiologiniai periodonto ligų faktoriai yra labai panašūs. P. gingivalis bakterija yra siejama su žmonių periodontitu (6), o P. gingivalis ir P. gulae fimbrilino A geną koduojančios nukleotidų sekos yra labai homologiškos (4).
Fimbrilino baltymo variacijos daro įtaką periodonto ligų vystymuisi (7). Priklausomai nuo fimbrilino A geno nukleotidų sekos, koduojančios fimbrilino baltymą, yra nustatyti trys P. gulae genotipai: A, B ir C, iš kurių B ir C genotipai yra laikomi patogeniškesniais (3,8). P. gingivalis atveju yra išskirti šeši genotipai: I–V ir Ib, iš kurių II genotipas laikomas patogeniškiausiu (2,5,6).
Šunų periodonto ligas sukeliančių patogeninių bakterijų identifikavimas ir genotipavimas yra labai svarbus ir leidžia pritaikyti tinkamą prevenciją, norinti išvengti šių ligų bei skirti tikslingą gydymą (7). Pastaruoju metu bakterijų identifikavimui dantų apnašose pradėti naudoti molekuliniai metodai. 16S rRNR genų sekų analizė leidžia identifikuoti bakterijas, kurios neauga laboratorinėmis
9
sąlygomis arba kurios reikalauja ypatingų sąlygų augimui, taip pat leidžia nustatyti visiškai naujas bakterijų rūšis (9,10).
Atsižvelgiant į mokslinėje literatūroje skelbtus rezultatus ir į tai, kad trūksta duomenų apie
Porphyromonas spp. genotipų paplitimą Lietuvoje, buvo iškeltas toks darbo tikslas:
įvertinti, kokie Porphyromonas spp. fimA genų variantai yra paplitę Lietuvos šunų dantų apnašose. Šiam tikslui pasiekti buvo suformuluoti darbo uždaviniai:
1. Parinkti tinkamiausias polimerazės grandininės reakcijos sąlygas Porphyromonas spp. bakterijų fimA geno aptikimui.
2. Klonuoti padaugintus DNR fragmentus ir atlikti klonuotų fragmentų nukleotidų sekų analizę.
3. Nustatyti kokios Porphyromonas spp. bakterijų rūšys yra paplitusios Lietuvos šunų dantų apnašose.
4. Įvertinti Porphyromonas spp. fimA genų ir FimA baltymų įvairovę Lietuvos šunų dantų apnašose.
5. Įvertinti, ar aukštos skiriamosios gebos DNR fragmentų lydymosi (HRM) metodas tinka
10
1 LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Periodonto ligos ir jų klasifikacija
Periodonto ligos yra chroniškos, multifaktorinės ligos, kurių eigai įtakos turi tiek šeimininko, tiek bakteriniai faktoriai (11). Periodonto ligos skirstomos į dvi stadijas: gingivitą ir periodontitą. Gingivitas yra pirmoji, grįžtama ligos stadija, kurios metu uždegiminis procesas vyksta tik dantenų audiniuose. Šį uždegimą paprastai sukelia dantų apnašose esančios bakterijos ir šis procesas gali būti grįžtamas, jeigu atliekama nuodugni ir nuolatinė dantų profilaktika ir priežiūra (12). Dantenų eritema yra pirmas gingivito klinikinis požymis. Vėliau taip pat pasireiškia dantenų edema, ptializmas, dantenų kraujavimas ir hialitozė, čiaudėjimas, stebimos išskyros iš nosies ertmės bei elgsenos pokyčiai (2,3). Gingivitas praprastai yra siejamas su dantų akmenimis, bet pirminė gingivito priežastis yra minkštasis dantų apnašas (12). Periodontitas yra vėlesnė ligos stadija, taip pat sukeliama bakterijų, šios ligos stadijos metu pažeidžiami gilesni audiniai, atraminės dantų struktūros (periodonto raištis, danties šaknies cementas, alveolės kaulas) (5,6). Šių atraminių struktūrų pažeidimas sukelia dantenų atsitraukimą, periodonto kišenių formavimąsi. Nedidelės ar vidutinės periodonto kišenės gali būti sumažintos arba eliminuotos atliekant nuodugnų dantų apnašų ir akmenų šalininimą, tačiau alveolės kaulo pažeidimai yra negrįžtami (13). Kompanijos gyvūnų periodontitas yra liga, galinti turėti įvairių pasekmių, tokių kaip anoreksija ar svorio netekimas, chroniškas skausmas, ištinusios dantenos, klibantys, yrantys dantys, o tai gali būti dantų lūžių ar dantų netekimo, taip pat apatinio ar viršutinio žandikaulio lūžių priežastis. Negydant, periodonto ligas sukeliančios bakterijos gali išplisti į kitas kūno vietas ir sukelti inkstų, koronarines ar kepenų ligas (11,14).
Periodonto ligų sukeliamos pasekmės skirstomos į vietines ir sistemines. Dantų netekimas nėra vienintelė vietinė periodonto ligų pasekmė. Jau yra įrodytos šešios papildomos sunkios vietinės pasekmės, kurias sukelia periodonto ligos. Dažniausia iš šių pasekmių yra oronazalinė fistulė. Ši fistulė atsiranda periodonto ligai progresuojant ir išplintant į gomurinį paviršių, dažniausiai tai nutinka, esant viršutinio iltinio danties pažeidimui, tačiau visų viršutinių dantų pažeidimai gali sukelti fistulės formavimąsi (12). Oronazalinės fistulės atsiradimas sujungia burnos ir nosies ertmes, dėl ko sukeliamas sinusitas (15). Kita svarbi dažniausiai sutinkama periodonto ligų pasekmė, kai yra pažeidžiami daugiašakniai (krūminiai) dantys. Pažeidus šiuos dantis, neretu atveju, susiformuoja periodontiniai abscesai (12). Dar viena potenciali periodonto pasekmė yra apatinio žandikaulio lūžiai, kuriuos sukelia nuolatinis periodonto audinių praradimas, o tai susilpnina kaulą pažeidimo vietoje ir sukelia lūžius (16). Kai periodonto ligų pažeisti dantys yra arti akies orbitos, tai pasireiškusi stipri uždegiminė reakcija gali sukelti gyvūno apakimą (17). Taip pat naujausi tyrimai parodė, kad periodonto ligos yra susijusios su burnos onkologinėmis ligomis. Ši sąsaja grindžiama nuolatiniu uždegiminiu procesu, kuris būdingas periodontitui (18,19). Chroniškas osteomielitas – taip pat viena
11
iš periodonto ligų pasekmių. Jis dažniausiai pasireiškia pažeistų, infekuotų kaulų regionuose, būtent dantų ligos yra dažniausia osteomielito priežastis burnos ertmėje (12).
Sisteminis periodonto ligų išplitimas taip pat yra gerai žinomas. Dantenose ir periodonto audiniuose pasireiškiantys uždegiminiai procesai ne tik padeda organizmui kovoti su ligą sukeliančiomis bakterijomis, tačiau taip pat suteikia galimybę bakterijoms išplisti (12). Naujausi moksliniai tyrimai teigia, kad periodonto ligas sukeliančio bakterijos išplinta po organizmą ir, galimai, neigiamai veikia inkstus bei kepenis, kas dažniausiai sutrikdo šių organų funkcijas. Nustatyta, kad chroninės azoteminės inkstų ligos rizika žymiai padidėja, esant sunkioms periodonto ligoms (20). Taip pat teigiama, kad šios bakterijos gali prisitvirtinti prie jau pažeistų širdies vožtuvų ir sukelti endokarditą, kas gali sukelti nuolat grįžtančią infekciją ar tromboembolines ligas. Kiti moksliniai tyrimai susiejo periodonto ligas su smegenų ir širdies miokardo infarktais ar kitais šių audinių histologiniais pakitimais (21–24). Žmonių medicinoje vykdyti tyrimai susiejo periodonto ligas su padidėjusiu chroninių kvėpavimo takų ligų pasireiškimu, taip pat ir plaučių uždegimu (25,26). Taip pat yra atlikta daug mokslinių tyrimų, kurie sieja periodonto ligas su padidėjusiu atsparumu insulinui, todėl žymiai pablogėja cukrinio diabeto kontrolės galimybės, dėl ko kyla daugiau cukrinio diabeto komplikacijų (sutrikęs žaizdų gijimo procesas, kraujagyslių ligos) (26,27). Galiausiai tyrimų su gyvūnais metu buvo nustatyta, kad periodonto ligų metu organizme padaugėja uždegiminių lipidų ir padidėja bendras lipidų kiekis organizme. Tai reiškia, kad šių ligų metu sukeliamas uždegiminis procesas visame organizme, tai lemia chroniškus uždegiminius procesus ir nenormalų organizmo imuninį atsaką (26,28–30).
Periodonto ligos – tai daugiaveiksnės ligos. Individo jautrumui bei klinikinių požymių pasireiškimui įtakos turi mikrobiologiniai, elgsenos, aplinkos, sisteminiai bei genetiniai faktoriai. Nors dantų apnašos laikomos svarbiausiu veiksniu sukeliančiu ligą, tačiau svarbūs yra ir veiksniai, kurie skatina dantų apnašų kaupimąsi (pavyzdžiui: per didelis dantų skaičius, netaisyklingas sąkandis, šėrimas minkštu pašaru, burnos higienos trūkumas) ar kurie mažina organizmo atsaką į infekciją (pavyzdžiui: medžiagų apykaitos ligos, netinkama mityba, imunodeficitas) (7,14). Periodonto ligos prasideda tada, kai burnoje esančios bakterijos prisitvirtina prie dantų paviršiaus ir suformuoja dantų apnašas (12). Dantų apnašos – tai danties paviršuje esanti bioplėvėlė, kuri formuojama burnos ertmėje esančių bakterijų, įsitvirtinusių matricoje, sudarytoje iš seilių glikoproteinų ir užląstelinių polisacharidų (14). Dantų akmenys – tai dantų apnašos, kurios kalcifikuojasi dėl seilėse esančių mineralų (12). Dantų akmenų formavimuisi įtakos turi burnos ertmės šarmingumas ir gyvūno mityba. Nors dantų apnašos yra pirminė periodonto ligų priežastis, tačiau dantų akmenys prisideda prie tolimesnio dantų apnašų formavimosi, nes bakterijoms yra žymiai lengviau prisikabinti prie šiurkštaus jų paviršiaus. Taip pat dantų akmenys labiau žaloja dantenas (31). Viename grame dantų apnašų ar akmenų gali būti iki 1011 bakterijų (12). Bakterijos sudarančios bioplėveles pasižymi šiek
12
tiek kitomis savybėmis nei pavienės bakterijos. Yra žinoma, kad jos nuo 1000 iki 1500 kartų atsparesnės antibiotikams, palyginus su laisvai gyvenančiomis pavienėmis bakterijomis. Apnašos esančios ant danties paviršiaus yra vadinamos supragingivalinėmis apnašomis. Kai šios išplinta aukščiau dantenų karšto, į dantenų vagą (regioną tarp datenų ir danties ar alveolės kaulo), jos yra vadinamos subgingivalinėmis apnašomis (6,12). Pirminės dantų apnašos, esančios sveikose srityse, susideda iš nejudrių, gramteigiamų, fakultatyviai aerobinių lazdelių ir kokų (pirminės bakterijos kolonizuojančios danties paviršių: Actinomyces spp., Streptococcus spp.) (6,12). Gingivitas pasireiškia, kai padidėja bendras bakterijų skaičius, apie 50 proc. šio skaičiaus padidėjimo lemia gramneigiamos lazdelės ir anerobinės bakterijų rūšys. Tuo tarpu, esant periodontitui apie 74 proc. padidėjusio bakterijų skaičiaus sudaro gramneigiamos lazdelės (12). Chroninių periodonto ligų atvejais randamas padidėjęs spirochetų skaičius ir apie 90 proc. mikrofloros yra sudaryta iš anaerobinių organizmų (1,2). Iš pradžių buvo manoma, kad periodonto ligas sukelia būtent padidėjęs bendras bakterijų skaičius (nespecifinių dantų apnašų hipotezė), tačiau naujausi tyrimai rodo, kad tik kelios specifinės bakterijų rūšys yra atsakingos už periodonto ligų atveju matomą atraminės danties strūktūros pažeidimą (specifinių dantų apnašų hipotezė) (11,12). Kai dantenų vagoje susiformavusiose subgingivalinėse apnašose pradeda dominuoti fakultatyvios anaerobinės bakterijos (Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas spp., Prevotella spp., Tannerella forsythia ir Treponema spp.), tada yra sukeliamas periodonto audinių uždegimas (32). Dantų apnašų susikaupimas sukelia gingivitą, bet tolimesnis progresavimas į periodontitą priklauso tiek nuo šeimininko veiksnių, tiek ir nuo virulentiškų bakterijų buvimo burnos ertmėje (6).
1 pav. Porphyromonas spp. bakterijų sukeliamo periodontito patogenezės schema. Autorė Erna Marija Meškytė
Bakterijos esančios subgingivalinėse apnašose išskiria toksinus bei medžiagų apykaitos produktus, taip pat citokinus bei bakterinius endotoksinus, kurie gali įsiskverbti į audinius ir sukelti dantenų bei periodonto audinių uždegimą. Taigi uždegiminis procesas yra inicijuojamas labiau ne pačių bakterijų, bet jų išskiriamų medžiagų apykaitos produktų. Leukocitai ir kiti uždegiminiai mediatoriai migruoja iš periodonto minkštųjų audinių. Baltieji kraujo kūneliai kovoja su infekcija fagocituodami baterijas, šio proceso metu išskiriami fermentai, kurių tikslas sunaikinti patogenines bakterijas. Kai šie fermentai yra išskiriami į dantenų vagą, jie sukelia tolimesnį audinių uždegimą
13
(2,5). Periodonto audiniai bei viršutinis ar apatinis žandikauliai yra pažeidžiami labiau dėl organizmo uždegiminių procesų, nei dėl periodonto patogenų išskiriamų toksiškų produktų (14,33). Šis bakterijų ir šeimininko imuninės reakcijos sukeltas uždegimas ir sukelia minkštųjų periodonto audinių pažeidimus, bei susilpnina kaulinę atraminio mechanizmo dalį, padidindamas osteoklastų aktyvumą. Tai sukelia apikalinę epitelinės jungties migraciją, t.y. link danties šaknies galo. Progresuojant ligai danties įsitvirtinimas vis labiau nyksta, tai galutinėje ligos stadijoje lemia danties netekimą. Vis dėlto reikšmingi pakitimai įvyksta dar prieš prarandant dantį (12).
Pagrindinis šiuo metu taikomas periodonto ligų gydymas yra mechaninis dantų apnašų bei akmenų šalinimas, kuris esant agresyviai infekcijai ar nustačius anaerobines bakterijas papildomas antimikrobine terapija (34). Svarbu atkreipti dėmesį, kad žmonių medicinoje jau yra pastebėtas didelis anaerobinių bakterijų (indeksiniai periodonto ligų mikroorganizmai) rezistentiškumas antimikrobinėms medžiagoms (7,35).
1.2 Periodonto ligų paplitimas, periodontopatinės bakterijos
Naminių gyvūnų ir žmonių periodontito eiga ir klinikinė išraiška yra labai panaši. Periodonto ligos yra labai svarbios smulkių gyvūnų medicinoje dėl labai dažno jų paplitimo. Epidemiologiniai tyrimai teigia, kad ligos pasireiškimas didėja su amžiumi bei dažniau pasireiškia mažų ar miniatiūrinių veislių šunims (6). Nomura ir kiti nustatė, kad gingivitas pasireiškia 95–100 procentų šunų, o periodontitas 50–70 procentų šunų populiacijos (3,5). Hardham ir kiti teigia, kad nuo 4 metų amžiaus apie 80 proc. šunų ir kačių pasireiškia įvairaus sunkumo periodonto ligų požymiai. Kiti autoriai teigia, kad periodonto ligos pasireiškia jau nuo 2 metų amžiaus 80 proc. šunų ir 70 proc. kačių (3,5,11). Daugumos tyrimų rezultatai rodo, kad periodonto ligų paplitimas šunų populiacijoje yra apie 60–80 procentų (7,31,36). Chroninis periodontitas taip pat yra laikoma viena dažniausių uždegiminių ligų žmonių tarpe, pasireiškianti apie 30 procentų suaugusiųjų (6).
Mokslinių tyrimų metu yra nustatyta, kad kasdieninio gyvenimo metu motina vaikui perduoda burnos ertmėje esančias bakterijas ir patogeninius organizmus. Todėl buvo manoma, kad burnos ertmės bakterijas šuo gali perduoti šeimininkui, o šeimininkas šuniui. Mokslininko Yamasaki ir jo komandos atlikto tyrimo metu nustatyta, kad esant artimam kasdieniniui kontaktui su šunimi, periodontopatinės bakterijos gali būti perduodams žmogaus šuniui ir atvirkščiai (3).
Nors net apie 700 bakterijų rūšių gali kolonizuoti burnos ertmę, tik keletas jų yra atsakingos už periodonto ligų atsiradimą. Pirminės dantų apnašos daugiausiai yra sudarytos iš gramteigiamų bakterijų, kurios didėjant apnašų kiekiu yra pakeičiamos gramneigiamomis anaerobinėmis bakterijomis. Būtent šios anaerobinės bakterijos ir laikomos periodonto ligų sukėlėjomis (31). Informacijos apie naminių gyvūnų periodonto ligų sukėlėjus palyginus nedaug (11). Iš kačių ir šunų periodonto ligų metu susiformavusių kišenių buvo izoliuotos juodą pigmentą gaminančios
14
anaerobinės bakterijos. Daugelis šių izoliatų yra priskiriami Porphyromonas genties (39,2 proc.) bakterijoms (11,37). Smulkių gyvūnų medicinoje dažniausiai randamos šios Porphyromonas genties bakterijos: P. gulae, P. gingivalis, P. macacae, P. cangivalis, P. gingivicanis, P. circumdentaria (4,11,20,38). Taip pat izoliuotos Fusobacterium (4,5 proc.) ir Capnocytophaga (3,8 proc.), Prevotella genties bakterijos (34,37). Iki šiol būtent Porphyromonas gulae yra laikomas pagrindiniu šunų periodonto ligų sukėlėju (4). Žmonių medicinoje anaerobinė bakterija Porphyromonas gingivalis yra dažniausiai sutinkama bakterijų rūšis, kuri yra siejama su periodontitu. Ji randama 85 proc. periodontito atvejų (4,39,40). Kadangi šunys artimai kontaktuoja su žmonėmis, tai dažnu atveju galimas tarpusavio apsikeitimas šiomis virulentiškomis bakterijomis (36).
1.3 Porphyromonas genties bakterijos ir jų FimA baltymai
Porphyromonas genties bakterijos jau kurį laiką laikomos pagrindinėmis periodonto ligas
žmonėms sukeliančiomis bakterijomis (34,41). Naujausi tyrimai taip pat rodo dažną šios genties bakterijų paplitimą šunų burnos ertmėje (41). Porphyromonas gentis yra laikoma viena svarbiausių, tiriant žmonių periodontitą, o ypatingai didelio mokslininkų susidomėjimo sulaukė Porphyromonas
gingivalis rūšis, su kuria ir buvo atlikta dauguma mokslinių tyrimų. P. gingivalis šiuo metu laikomas
kertiniu periodonto ligų patogenu, kurio net nedidelis kiekis gali sukelti esminių pokyčių burnos mikrobiome. Naujausi tyrimai parodė, kad Porphyromonas gentis turi panašų vaidmenį ir šunų burnos sveikatoje ir periodonto ligų pasireiškime. P. gulae, kuris yra giminingas P. gingivalis, yra dažniausiai sutinkama Porphyromonas genties bakterijų rūšis, tiriant periodontitu sergančių šunų dantų apnašose (42). Mokslinių tyrimų metu nustatyta, kad P. gulae žymiai labiau paplitusi šunų grupėje, kuriai yra diagnozuotos periodonto ligos, nei sveikų šunų grupėje. Brazilijos mokslininkų atliktų tyrimų duomenimis P. gulae bakterijos buvo randamos 92 proc. šunų, turinčių periodontitą, tačiau tik 56 proc. sveikų šunų (7). Panašūs rezultatai buvo gauti ir Japonijos mokslininkų atliktų tyrimų metu. P. gulae buvo identifikuotas 63,6 proc. sveikų šunų, 77,7 proc. gingivitu sergančių šunų, visų šunų, sergančių periodontitu, mėginiuose buvo aptikta P. gulae (100 proc) (3). P. gingivalis ir
P. gulae yra artimos viena kitai rūšys, tai patvirtina genetinis šių rūšių panašumas, o taip pat
fenotipinis panašumas (pvz., į tripsiną panašių proteazių sintezė, fluorescensijos po ultravioletiniais spinduliais nebuvimas ir kt.) ir panašus imuninis reaktyvumas (3,38,42). Vis dėlto, P. gulae gamina katalazę, kai tuo tarpu P. gingivalis – ne (3,43). Japonijos mokslininkų komanda atliko tyrimą, kurio metu buvo tiriama šunų ir jų šeimininkų burnos mikroflora. Gauti rezultatai rodo, kad 13-kos šeimininkų burnoje buvo aptiktos P. gulae bakterijos, kurios įprastai nekolonizuoja žmonių burnos ertmės. Be to, P. gulae bakterijos buvo nustatytos visuose mėginiuose, paimtuose iš tų šeimininkų auginamų šunų. Šie mokslininkų gauti rezultatai rodo, kad patogeniškos periodontopatinės bakterijos gali būti perduotos iš šuns šeimininkui (44).
15
P. gingivalis – juodą pigmentą gaminanti, anaerobinė, gramneigiama, lazdelinė bakterija (5).
Šiai bakterijai būdingi virulentiškumo faktoriai yra kolagenazė, lipopolisacharidai, į tripsiną panašios proteazės ir fimbrijos. 41 kDa masės fimbrijos elementas ypatingai svarbus periodonto ligų vystymuisi (4,5). Porphyromonas gulae yra juodą pigmentą gaminanti, anaerobinė, nejudri, sporų neformuojanti, gramneigiama, lazdelinė bakterija. Mokslininkų atlikti tyrimai nustatė, kad P. gulae fimbrijas sudarantis didysis baltymas yra taip pat 41 kDa masės elementas (4). Nukleotidų sekos analizė parodė, kad P. gulae fimA genas yra 94 procentais homologiškas P. gingivalis fimA genui. Šių bakterijų FimA baltymą sudarančios aminorūgštys yra 96,8 procentais identiškos (4). Yra atlikta daug tyrimų, skirtų nustatyti P. gingivalis virulentiškumo veiksniams bei fimbrijų funkcijoms periodonto ligų progresavime. P. gulae rūšis yra kiek mažiau tirta, tačiau naujausi tyrimai tai pat teigia, kad fimbrijos yra pagrindinis ir specifinis šių bakterijų virulentiškumo veiksnys, lemiantis ligos sukėlimą (2).
Tiek P. gingivalis, tiek ir P. gulae turi išskirtinę savybę, tai gebėjimą prisitvirtinti prie įvairių šeimininko audinių bei įsiskverbti į audinių ląsteles ir jose pasidauginti (45). Pirminis šių bakterijų patogeniškumą rodantis veiksmas, tai yra gebėjimas prisitvirtinti burnos ertmės paviršiuose. Tam pasiekti Porphyromonas spp. bakterijos naudoja keletą bakterinių komponentų: fimbrijas, proteazes, hemagliutinus ir lipopolisacharidus. Didžioji P. gingivalis/P.gulae fimbrija (sudaryta iš FimA baltymo) dalyvauja beveik visose šios bakterijos sąveikose su šeimininko organizmui, taip pat ir tarpusavio sąveikose su kitomis bakterijomis. Bakterijų prisitvirtinimas prie gleivinių bei danties paviršiaus, kaip ir bakterijų kooagregacija (koagregacija – tai procesas, kurio metu genetiškai skirtingos bakterijos susijungia viena su kita, naudodamosi specifinėmis molekulėmis (3); tai yra ypač būdinga burnos ertmę kolonizuojančioms bakterijoms, kurios formuoja daugelį bakterijų rūšių įtraukiančias dantų apnašas) yra pagrindiniai burnos ertmės kolonizavimo etapai. P.
gingivalis/P.gulae fimbrijos yra lemimas veiksnys, sėkmingam visų šių žingsnių įvykdymui (46,47).
Moksliniai tyrimai taip pat rodo, kad būtent fimbrijų gebėjimas prisitvirtinti paviršiuje lemia šių periodontopatinių bakterijų kolonizacijos sėkmę bei periodonto ligų sukėlimą. P. gingivalis/P.gulae fimbrijos taip pat gali jungtis su daug prolino turinčiais seilių baltymais (32). Namikosh ir kiti mokslininkai įrodė, kad 40 kDa masės P. gingivalis fimbrijų baltymas yra kritiškai svarbus koagregacijai su kitomis bakterijų rūšimis (48). Sveiką dantį bioplėveles formuojančios bakterijos pradeda kolonizuoti iš pradžių prisitvirtindamos prie danties paviršiaus ir tada plisdamos iki dantenų vagos. Šios vagos pagrinde yra dantenų epitelio suformuotas plonas jungiamojo epitelio sluoksnis, kuris tiesiogiai sujungia dantenas su dantimi (45). Šių ilgųjų fimbrijų ekspresija sumažėja, esant įvairiems aplinkos streso veiksniams, pavyzdžiui, aukštai temperatūrai, ribotam geležies kiekiui arba kai aplinkoje atsiranda daug maisto medžiagų. Ilgoji fimbrija taip pat gerai jungiasi su seilių makromolekulėmis, užląstelininės matricos baltymais bei kitais bakteriniais komponentais. P.
16
gingivalis/P. gulae sugeba prisitvirtinti ir įsiskverbti į įvairias šeimininko ląsteles, pvz. makrofagus,
fibroblastus, epitelio ir endotelio ląsteles (3).
P. gingivalis/P. gulae sąveika su dantenų epitelio ląstelėmis suteikia galimybę sėkmingai
sunaikinti šeimininko audinius ir sumažinti danties stabilumą. Taip pat šios genties bakterijos turi daug molekulių ir struktūrų, kurios sąveikauja su šeimininko makromolekulėmis ir ląstelėmis. Tiek
P. gingivalis, tiek ir P. gulae demonstruoja puikiai išvystytą prisitvirtinimo prie šeimininko paviršių
mechanizmą, tačiau vien to neužtenka. Sėkmingam bakterijų populiacijos plitimui taip pat reikalinga replikacija bei gebėjimas kovoti dėl maisto medžiagų šeimininko organizme. Tokioje ribotoje aplinkoje, kaip burnos ertmė, bakterijų proteazės aprūpina bakterijas augimui reikalingomis maisto medžiagomis, dėl to P. gingivalis proteazės laikomos svarbiu virulentiškumo faktoriumi (49). P.
gingivalis išskiriamos proteazės degraduoja I ir IV tipo kolageno baltymus, kurie yra pagrindiniai
periodonto jungiamo audinio ir užląstelinės matricos baltymai (32). P. gingivalis taip pat gamina egzopetidazes, proliltripeptidilpeptidazes, dėl to šios bakterijos gali perdirbti polipeptidus į mažesnius peptidų fragmentus. Šis procesas vyksta P. gingivalis ląstelės paviršiuje, dėl to šie fragmentai labai lengvai transportuojami į ląstelių vidų ir yra panaudojami kaip anglies, azoto ir energijos šaltinis. Šios egzopetidazės taip pat gali dalyvauti perdirbant galutinius kolageno degradacijos produktus, kurių kiekis supančiuose audiniuose, pasireiškus periodonto ligoms, yra labai didelis (50,51). Be to, daugelis P. gingivalis galutinių medžiagų apykaitos produktų yra citotoksiški (52). P. gingivalis taip pat trukdo funkcionuoti peridonto sveikatą palaikančiam citokinų tinklui (53).
P. gingivalis bakterijai būdingos dvi skirtingos ląstelės išorinėje membranoje išsidėsčiusios
fimbrijų molekulės. Vienas struktūra yra sudaryta iš fimbrilino baltymo (FimA), kuris yra užkoduotas vienintelio fimA geno ir yra vadinamas didžiąja fimbrija. Kita struktūra sudaryta iš Mfa baltymo, kurį koduoja mfa1 genas, ir ši struktūra vadinama mažąja arba trumpąja fimbrija. Abi fimbrijos susijusios su periodonto ligų vystymusi (6). Ilgoji fimbrija yra kritinis veiksnys susijęs su P. gingivalis įsitvirtinimu subgingivaliniame regione. Ši fimbrija lemia tiek bakterijos adheziją paviršiuje, tiek ir su mikroorganizmo įsiskverbimą į epitelio ląsteles (54). P. gulae bakterijų rūšiai taip pat būdingos didžoji ir mažoji ląstelės išorinėje membranoje išsidėsčiusios fimbrijos. Didžiosios fimbrijos virulentiškumas ir funkcijos ligos procese yra panašios į P. gingivalis didžiosios fimbrijos. Mažosios fimbrijos įtaka ir funkcija nėra pakankamai ištirta (55).
FimA genas – tai monocitroninis genas, kurio P. gingivalis/P. gulae chromosomoje yra tik
viena kopija. P. gingivalis/P. gulae mutantai, kuriems buvo pašalintas šis, fimbrilino baltymą koduojantis genas, nebesugeba prisijungti prie paviršių ar įsiskverbti į epitelio ląsteles bei nebesugeba sukelti burnos ertmės infekcijos. Amino rūgščių sekos tyrimai parodė, kad šis baltymas neturi jokių panašumų į kitų bakterijų plaukelius ar fibrijas koduojančius genus. Tai parodo, kad didžioji P.
17
savo mase – nuo 40,5 iki 49 kDa, priklausomai nuo bakterijų kamieno. P. gingivalis buvo suskirstytas į skirtingas genotipines grupes priklausomai nuo fimA geno variacijų (6). Šiuo metu yra išskiriami šeši P. gingivalis geno fimA koduojančio fimbrilino baltymą genotipai. II, IV ir Ib laikomi invazyviais, o tuo tarpu I, III ir V laikomi neinvazyviais genotipais (5). Buvo atlikta nemažai tyrimų, kurie nagrinėjo šių skirtingų genotipinių grupių paplitimą ir pasiskirstymą žmonių tarpe, esant skirtingoms periodonto ligų stadijoms bei skirtingose geografinėse vietose (56–64). Porphyromonas
gulae pagal fimA geno įvairovę yra skirstomas į A ir B genotipus, B genotipo bakterijų kamienai yra
laikomi labiau virulentiškais, nei A tipo. Be to, B tipo fimbrilino baltymo amino rūgščių seka yra panaši į P.gingivalis fimA III genotipo kodojamo baltymo amino rūgščių seką. Naujausi tyrimai taip pat rodo, kad egzistuoja ir C tipas, kuriam priklausančios P. gulae yra labiausiai patogeniškos ir sugeba sukelti žymiai didesnį uždegiminį procesą (3). Be to, Porphyromonas gulae fimA C genotipas yra siejamas su šunų mitralinių vožtuvų nepakankamumu(21). Tai dar kartą įrodo, kad periodonto ligos gali sukelti sistemines komplikacijas, kurių sukėlime tiesiogiai dalyvauja periodonto ligoms specifinės bakterijos (21,41). Mokslinių tyrimų metu taip pat rasta mėginių, kurių nebuvo galima priskirti prie A, B ar C fimA genotipų, tai leidžia manyti, kad gali būti ir daugiau P. gulae fimA geno variantų (3).
Nors pirminė didžiųjų fimbrijų funkcija yra prisitvirtinti prie šeimininko burnos ertmėje esančių paviršių, tačiau mokslininkai taip pat nustatė, kad būtent šios bakterijų paviršiaus struktūros sužadina šeimininko organizme uždegiminį procesą (32). P. gulae fimbrilino baltymas stimuliuoja osteoklastų formavimąsi ir fukcionavimą ir taip inicijuoja kaulinio audinio rezorbciją. Šis 41 kDa masės baltymas taip pat skatina makrofagus ir fibroblastus gaminti IL-β bei TNF-α. Šie uždegiminiai citokinai stimuliuoja osteoklastų diferenciaciją ir sukelia dantenų jungiamojo audinio destrukciją bei alveolinio kaulo praradimą (2).
1.4 Molekuliniai tyrimo metodai. HRM metodas Porphyromonas spp. bakterijų
genotipavimui
Žinoma apie 500 bakterijų rūšių, galinčių kolonizuoti burnos ertmę, 50 procentų šių bakterijų gali būti kultivuojamos laboratorinėmis sąlygomis, tačiau mažiau nei 10 iš šių kultivuojamų rūšių yra susijusios su periodonto ligomis. Molekulinės biologijos metodai buvo pritaikyti, norint nustatyti žmonių periodonto ligas sukeliančius patogenus, šie metodai yra jautrūs ir specifiški nustatant pagrindinius periodonto ligų sukėlėjus (pvz.: Porphyromonas spp. bakterijas) (1,65). Veiksmingas šunų burnos ertmės mikrobiomo ištyrimas yra kritiškai svarbus, norint išsiaiškinti, kokias funkcijas atlieka natūrali šunų mikroflora, kokią įtaką ji daro burnos ertmės sveikatai bei norint gauti informacijos apie periodonto ligas sukeliančias bakterijas bei jų virulentiškumo veiksnius, įtaką ligų vystymuis (37).
18
Patogeniškų P. gingivalis/P. gulae genotipų nustatymas šunų burnos apnašų mėginiuose yra laikomas periodonto ligų rizikos žymeniu (65). Ankstyvas periodonto ligų ar šunų, esančių rizikos grupėje nustatymas yra svarbus, norint išlaikyti sveiką burnos ertmę ir joje esančias anatomines struktūras, užkirsti kelią periodonto audinių destrukcijai bei išvengti sisteminių komplikacijų rizikos (37). Ankstyva ligos diagnozė bei jos sukėlėjų identifikavimas yra ypač svarbūs, norint pritaikyti tinkamas ligos gydymo strategijas bei tolimesnę ligos prevenciją (37,41). Šiuo metu naudojamos genotipavimo technologijos paremtos pagrindiniais molekulinės biologijos metodais, tokiais kaip DNR išskyrimas, DNR hidrolizė, DNR ligavimas ir polimerazės grandininė reakcija, tikro laiko PGR. DNR fragmentų elektroforezė, DNR sekos nustatymas ir aukštos skiriamosios gebos DNR lydymosi temperatūros analizė (ASGL, angl. HRM) naudojami rezultatų interpretavimui (66).
Aukštos skiriamosios gebos DNR lydymosi temperatūros analizė yra sąlyginai naujas molekulinis tyrimo metodas, paremtas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metu gautų produktų lydymosi temperatūros vertinimu (67,68). HRM analizė yra pagrįsta dvigrandės DNR grandinės denatūracija, paveikus aukšta temperatūra, bei DNR grandinės lydymosi temperatūros (Tm – angl. melting temperature) nustatymu (69,70). Šis metodas yra greitas, tikslus ir vyksta uždarame mėgintuvėlyje, tuo sumažinant užkrėtimo ar nespecifinių reakcijų įtaką. Šiuo metodu padaugintuose DNR fragmentuose galima nustatyti skirtingus genetinius variantus (paprastą nukleotidų polimorfizmą, metilinimą, mutacijas ir kt.), pagal DNR grandinės ilgį, sudėtį, guanino ir citozino kiekį bei grandinių komplementarumą (69–71).
2 pav. Aukštos skiriamosios gebos lydymosi metodu gautos lydymosi kreivės pavyzdys. Modifikuota pagal N. Sharma (72).
HRM metodu galima genotipuoti bei nustatyti mutacijas, naudojant universalius fluoresuojančius dažus, pvz. SYBR Green I, kurie interkaliuojasi į dvigrandininę DNR. Šių dažų fluorescencija yra nuolat registruojama optinių sistemų ir brėžiama DNR lydymosi kreivė. Šie dažai fluoresuoja tik įjungti į dvigrandininę DNR. Keliant temperatūrą termocikleryje, DNR grandinės
19
pradeda denatūruoti, grandinės atsiskiria ir fluorescencija pradeda slopti. Kai temperatūra pasiekia padaugintų DNR fragmentų lydymosi temperatūrą, fluorescencija sumažėja maksimaliai. Lydymosi temperatūra (Tm) yra lydymosi kreivės vieta, kur 50 proc. DNR fragmentų yra viengrandininiai. DNR lydymosi temperatūra gali kisti, kai vienas nukleotidas grandinėje yra pakeičiamas kitu, taip pat gali keistis ir lydymosi kreivės forma. Atsižvelgiant į DNR fragmentų lydymosi temperatūra (Tm) ir lydymosi kreivės formą, galima identifikuoti skirtingus genotipus (1 pav.) (68). Toks metodas yra pranašesnis už įprastą PGR analizę bei papildo tikro laiko PGR analizę, nes įgalina atskirti identiško ilgio, bet skirtingas nukleotidų sekas turinčius DNR fragmentus.
Apibendrinant literatūros apžvalgoje pateiktus duomenis, galima teigti, kad Porphyromonas spp. bakterijos yra svarbios burnos ertmės patogenezėje, o jų sintetinamas FimA baltymas – vienas iš kertinių patogenezės faktorių. Vienok, Porphyromonas spp. bakterijų paplitimas šunų populiacijose menkai tirtas. Išimtis – keletas studijų, skirtų šių patogenų paplitimui analizuoti Japonijoje ar Brazilijoje(5,35,44). Duomenų apie Porphyromonas spp. bakterijų rūšinę įvairovę Europoje ar Lietuvoje nėra, o tai yra svarbu, suprantant periodonto ligų plitimo tendencijas. Be to, tradiciniai molekuliniai patogenezės faktorių genotipų tyrimo metodai (PGR ar tikro laiko PGR) ne visuomet tinkami ir ne visuomet leidžia tiksliai identifikuoti geno variantą, naudojant tik vieną oligonukleotidų porą, todėl anksčiau nenaudotas aukštos skiriamosios gebos DNR fragmentų lydymosi metodo taikymas Porphyromonas spp. genotipavimui leistų greičiau, paprasčiau ir tiksliau nustatyti periodonto ligų etiologiją, prognozę bei pritaikyti tinkamas prevencines priemones ir tikslingą gydymą.
20
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1 Mėginio paėmimas ir tyrimo eiga
Šunų dantų apnašų mėginiai surinkti 2014 liepos mėn. – 2016 sausio mėn. Priklausomai nuo dantų būklės tiriami šunys suskirstyti į 4 grupes (1 lent.).
1 lentelė. Tiriamųjų šunų suskirstymas pagal dantų būklę. Grupė Dantų būklė
1 Nėra matomų dantų apnašų, burnos gleivinė ir dantenos nepažeistos.
2 Dantų apnašos/akmenys matomos ant 2–4 dantų, dantenos nepažeistos arba silpnai paraudusios.
3 Dantų apnašos/akmenys matomos ant daugelio dantų, dantenos paraudusios, matomas danties kaklelis.
4 Dantų apnašos/ akmenys matomos ant daugelio dantų, dantenos paraudusios, edemiškos, susiformavusios periodontinės kišenės, dantys praradę stabilumą.
Mėginiai imti nuo viršutinių ir apatinių iltinių dantų vienkartiniu vatos tamponėliu, dedami į sterilius mėgintuvėlius ir laikomi šaldiklyje (temperatūra ne mažesnė nei –18°C) iki tolimesnės analizės.
3 pav. Atlikto tyrimo eiga. Autorė Erna Marija Meškytė
2.2 Terpės
Šio tyrimo metu naudotos terpės:Nutrient agar terpė (NA, 28 g/l, gamintojas OXOID, Jungtinė Karalystė) Brain heart infusion terpė :37 g/l
21
Nutrient broth (NB, 13 g/l, gamintojas OXOID, Jungtinė Karalystė)
Visos terpės buvo autoklavuojamos 20 min 1 atmosferos slėgyje, 121°C temperatūroje. Visi bakteriniai kamienai auginami ant agarizuotų terpių 30°C temperatūroje.
2.3 Pradmenys
Šio tyrimo metu naudoti pradmenys:W001 5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC -3' (73) W002 5'-GNT ACC TTG TTA CGA CTT-3' (73)
FIMAM11 5'-CTC CCT GTA TTC CGA ATA TAG AC-3' (62) FIMAM12 5'-AAT CTG AAC GAA CTG CGA CGC TAT-3' (62)
2.4 Genominės DNR skyrimas: ZR Fungal/Bacterial DNA Kit metodas
Į mėginį įdedama 750 µl lizės buferio, mėgintuvėlis kratomas 5 minutes ir centrifuguojamas 1 minutę (16000 g), supernanatas (400 µl) perkeliamas į mėgintuvėlį su filtru ir centrifuguojamas vieną minutę (7000 g). Tada į filtratą pridedamas 1200 µl Fungal/Bacterial DNR surišimo buferio. 800 µl mišinio perkeliama į Zymo-SpinTM IIC kolonėlę, kuri įdėta į mėgintuvėlį ir centrifuguojama(10000 g) vieną minutę. Šis etapas pakartojamas du kartus. Į mėgintuvėlį pridedama 200 µl praplovimo buferio ir centrifuguojama (10000 g) 1 minutę. Kolonėlė perkeliama į naują mėgintuvėlį (1,5 ml) ir į jį pridedama 100 µl DNR eliucijos buferio ir centrifuguojama (10000 g) 30 sekundžių. Surinkti DNR pavyzdžiai iki tolimesnės analizės laikomi šaldiklyje (temperatūra ne mažesnė nei –18 °C).
2.5 DNR elektroforezė agarozės gelyje
DNR elektroforezė vykdoma horizontaliame agarozės gelyje (1 proc.) TAE buferyje, esant 120 V įtampai. Po elektroforezės gelis buvo dažomas 5–10 min 0,005 proc. etidžio bromido tirpale ir analizuojamas ultravioletinėje šviesoje. DNR fragmentai lyginami su GeneRulerTM DNR ladder Mix
žymenimis (Thermo Fisher Scientific, Lietuva).
TAE buferinis tirpalas (50-kartinis): Tris – 121 g, Na2EDTA – 18,6 g, acto rūgštis 99,5 proc.
– 28,6 ml, distiliuoto vandens pilti iki 500 ml).
2.6 16S RNR polimerazės grandininė reakcija
2.6.1 PGR reakcija su Woo1 ir Woo2 pradmenimisĮ reakcijos mišinį dedama po 0,2 µl Woo1 ir po 0,2 µl Woo2 pradmenų, 10,5 µl Hot Start Green PCR MM (į mišinį įeina: Hot Start Taq DNR polimerazė, PGR buferinis tirpalas, magnio jonai ir dNTP; gamintojas ThermoFisher Scientific) dukartinio mišinio ir 9 µl distiliuoto vandens. Į gautą mišinį įdedama po 1 µl atitinkamo mėginio DNR ir pradedama pirma polimerazės grandininės reakcijos programa.
22
2.6.2 PGR reakcija su Phusion DNR polimeraze
Į reakcijos mišinį dedama po 0,2 µl FIMAM11 ir po 0,2 µl FIMAM12 pradmenų, 10 µl Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (į sudėtį įeina: Phusion DNR polimerazė, nukleotidai ir buferinis tirpalas su MgCl2, ThermoFisher Scientific) dukartinio mišinio ir 8 µl distiliuoto vandens. Į gautą
mišinį įdedama po 1 µl atitinkamo mėginio DNR ir pradedama antra polimerazės grandininės reakcijos programa. Reakcija pakartota su trečia PGR pograma, kurios temperatūros ir ciklų ilgiai optimizuoti pagal FIMAM11 ir FIMAM12 pradmenis.
2.6.3 PGR reakcija su Phusion DNR polimeraze ir DMSO
Į reakcijos mišinį dedama po 0,2 µl FIMAM11 ir po 0,2 µl FIMAM12 pradmenų, 10 µl Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (į sudėtį įeina: Phusion DNR polimerazė, nukleotidai ir buferinis tirpalas su MgCl2, ThermoFisher Scientific) dukartinio mišinio, DMSO 0,6 µl ir 8 µl distiliuoto
vandens. Į gautą mišinį įdedama po 1 µl atitinkamo mėginio DNR ir pradedama antra polimerazės grandininės reakcijos programa. Reakcija pakartota su trečia PGR pograma, kurios temperatūros ir ciklų ilgiai optimizuoti pagal FIMAM11 ir FIMAM12 pradmenis.
2.6.4 PGR reakcija su Hot Start Green polimeraze
Į reakcijos mišinį dedama po 0,5 µl FIMAM11 ir po 0,5 µl FIMAM12 pradmenų, 25 µl Hot Start Green PCR MM (į mišinį įeina: Hot Start Taq DNR polimerazė, PGR buferinis tirpalas, magnio jonai ir dNTP; gamintojas ThermoFisher Scientific) dukartinio mišinio ir 23 µl distiliuoto vandens. Į gautą mišinį įdedama po 1 µl atitinkamo mėginio DNR ir pradedama pirma polimerazės grandininės reakcijos programa.
Visos polimerazės grandininės reakcijos atliktos, naudojant Sensoquest firmos termociklerį. Polimerazės grandininės reakcijos produktų analizė atliekama agarozės gelyje su DNA Gel Loading Dye (ThermoFisher Scientific) dažu: 2 µl dažo sumaišoma su 4 µl PGR produkto. DNR fragmentai lyginami su GeneRulerTM DNR Ladder Mix žymenimis (ThermoFisher Scientific).
2.6.5 Naudotos PGR programos Pirma programa:
1. Pradinė denatūracija: 94°C 5 min.
2. DNR grandinių atskyrimas: 94°C 30s – 30 ciklų. 3. Pradmenų prijungimas: 50°C 30 s – 30 ciklų. 4. Grandinės ilginimas: 72°C 1,5 min – 30 ciklų. 5. Galutinis grandinės ilginimas: 72°C 5 min. Antra programa
6. Pradinė denatūracija: 98°C 30 s.
7. DNR grandinių atskyrimas: 98°C 10s – 30 ciklų. 8. Pradmenų prijungimas: 51°C 10 s – 30 ciklų.
23
9. Grandinės ilginimas: 72°C 30 s – 30 ciklų. 10. Galutinis grandinės ilginimas: 72°C 5 min. Trečia programa
1. Pradinė denatūracija: 98°C 30 s.
2. DNR grandinių atskyrimas: 98°C 10s – 30 ciklų. 3. Pradmenų prijungimas: 60°C 10 s – 30 ciklų. 4. Grandinės ilginimas: 72°C 30 s – 30 ciklų. 5. Galutinis grandinės ilginimas: 72°C 5 min. 2.6.6 PGR produkto gryninimas
PGR produkto gryninimui naudojamas GeneJET Gel Extraction Kit (ThermoFisher Scientific). Gautas PGR produktas sumaišomas su surišimo buferiniu tirpalu santykiu 1:1 (100 µl PGR produkto su 100 µl buferinio tirpalo) GeneJET gryninimo kolonėlėje. Centrifuguoti 1 min (10000 g). Į mišinį pridėti 700 µl plovimo buferinio tirpalo ir centrifuguoti 1 min (10000 g). Centrifugavimą pakartoti du kartus. Perkelti GeneJET gyninimo kolonėlį į naują 1,5 ml mėgintuvėlį. Pridėti 50 µl eliucijos buferinio tirpalo ir centrifuguoti 1 min (10000 g).Išgryninti DNR pavyzdžiai iki tolimesnės analizės laikomi šaldiklyje (temperatūra ne mažesnė nei –18 °C).
2.7 DNR ligavimas
Polimerazės grandininės reakcijos būdu amplifikuotas ir išgrynintas ~1,4 kb dydžio fragmentas buvo liguojamas T4 DNR ligaze su pTZ57R/T plazmidžių vektoriumi. Į mišinį dedama 16 µl polimerazės grandininės reakcijos produkto, 1 µl pTZ57R/T plazmidžių vektoriaus, 1 µl T4 DNR ligazės ir 2 µl ligazės buferinio tirpalo ir liguojama 4°C temperatūroje 16–18 valandų. Po to ligazė inaktyvuojama, mišinį inkubuojant 15 minučių 65°C temperatūroje. Tokiu ligavimo mišiniu transformuojamos E. coli DH5α ląstelės.
2.8 Elektroimliųjų ląstelių ruošimas
Bakterijos užsėjamos į 20 mL NB terpės ir auginamos per naktį 30 °C temperatūroje aeruojant. 0,5 mL naktinės kultūros užsėjama į 20 mL NB terpės. Auginama aeruojant 3–4 val., kol E. coli ląstelių optinis tankis (A600) pasiekia 0,5–0,9. Tada, ląstelės 15 min laikomos ledo vonioje.
Centrifuguojama 10 min. 3220 g šaldant, supernantas nupilamas. Užpilama 10 mL šalto 10 proc. glicerolio tirpalo, ląstelės resuspenduojamos. Po to centrifuguojama tomis pačiomis sąlygomis. Ląstelės suspenduojamos 5 mL šalto 10 proc. glicerolio tirpalo, dar kartą centrifuguojama ir užpilama 1 mL šalto 10 proc. glicerolio tirpalo (74).
2.9 E. coli DH5α transformacija elektroporacijos būdu
Elektroporacijai naudojamos ląstelės ir kiuvetės atšaldomos ledo vonioje. Į 100 µl elektroimliųjų E. coli DH5α ląstelių įdedama 1 µg DNR ir inkubuojama kelias minutes lede. Tuomet
24
ląstelių suspencija su DNR perkeliama į atšaldytą kiuvetę. Ši dedama į elektroporacijos aparatą, kuriame nustatoma 20 kV/cm įtampa. Elektros impulso trukmė 4–5 ms. Po elektroporacijos nedelsiant ant ląstelių užpilama 200 µl BHI terpės ir suspencija perkeliama į mėgintuvėlį. Ląstelės inkubuojamos 1 val. 37°C temperatūroje. Paskui ląstelės (pridėjus į mišinį IPTG (20 µl) ir X-gal (20 µl) išsėjamos ant NA terpės su ampicilinu (74).
2.10 Plazmidžių skyrimas šarminės denatūracijos būdu
E. coli bakterijos auginamos 20 ml NB terpėje su ampicilinu (50 g/ml)30°C temperatūroje
aeruojant per naktį. Suspenzija centrifuguojama 10 min 3000 g. Supernantas nupilamas, ląstelės suspenduojamos viename tūryje I-o tirpalo ir laikoma 15–20 min kambario temperatūroje. Po to įpilami du tūriai II-o tirpalo ir laikoma 15–20 min kambario temperatūroje. Kai tirpalas tampa skaidrus, įpilama 1,5 tūrio 7,5 M amonio acetato ir laikoma 2–3 valandas ledo vonioje, kol iškrenta varškės pavidalo nuosėdos. Gautas tirpalas centrifuguojamas (30 min 3000 g). Supernantas perpilamas į švarų mėgintuvėlį ir užpilamas 2 tūriais etilo alkoholio ir dedamas į –20°C temperatūros šaldytuvą mažiausiai vienai valandai (plazmidinės DNR nusodinimas). Iškritus nuosėdoms tirpalas centrifuguojamas 15 min 3000 g. Supernantas nupilamas, nuosėdos išdžiovinamos ir ištirpinamos nedideliame kiekyje vandens (75).
I-as tirpalas: 250 µl 40 proc. gliukozės, 50 µl 1 M Tris-OH (pH 8,0), 20 µl 0,5 M EDTA, 680 µl distiliuoto vandens.
II tirpalas: 0,2 N NaOH, 1 proc. SDS.
Po plazmidžių išskyrimo šarminės denatūracijos būdu, DNR sukarpoma naudojant HindIII ir EcoRI restriktazes: 4 µl plazmidinės DNR, 1 µl Fast buferinio tirpalo (dešimtkartinis), 0,5 µl HindIII ir 0,5 µl EcoRI restriktazių ir 4 µl distiliuoto vandens. DNR analizuojama elektroforezės metodu agarozės gelyje ir fragmentai lyginami su GeneRulerTM DNA Ladder Mix žymenimis (ThermoFisher
Scientific).
2.11 Plazmidinės DNR paruošimas DNR sekoskaitai.
Plazmidinė DNR sekos nustatymui ruošta, naudojant ZR Plasmid MiniprepTM – Classic
(Zymo Research, USA) rinkinį. E. coli bakterijos auginamos 20 ml NB terpėje su ampicilinu (50 g/ml) 30°C temperatūroje aeruojant per naktį. Suspenzija (3 ml) centrifuguojama 10 min 3000 g. Supernantas nupilamas, ląstelės užpilamos 200 µl P1 buferiniu tirpalu ir pilnai suspenduojamas, naudojant automatinę mikropipetę. Pridedama 200 µl P2 buferinio tirpalo ir sumaišoma, 2–4 kartus pavartant mėgintuvėlį. Palaukiama 1–2 minutes. Kai ląstelės yra galutinai lizuotos, tada tirpalas tampa skaidrus, violetinis ir klampus. Pridedama 400 µl P3 buferinio tirpalo ir švelniai sumaišoma. Mišinys tampa geltonas, kai įvyksta pilna neutralizacija. Reakcija vyko 1–2 minutes. Po neutralizacijos mėginiai nuskaidrinami centrifuguojant 2 min (10000 g). Zymo-SpinTM IIN kolonėlę
25
įdedama į surinkimo mėgintuvėlį ir po centrifugavimo gautas supernantas perkeliamas į kolonėlę. Centrifuguojama 30 s (10000 g). Į kolonėlę įpilama 2000 µl plovimo buferinio tirpalo (Endo-Wash Buffer) ir centrifuguojama 1 minutę (10000 g). Įpilama 400 µl plovimo buferinio tirpalo (Plasmid Wash Buffer). Centrifuguota 1 min (10000 g). Po plovimo kolonėlė perkeliama į naują 1,5 ml mėgintuvėlį ir pridedama 30 µl eliucijos buferinio tirpalo (DNR Elution Buffer). Centrifuguota 3 min (10000 g). Išgryninti DNR pavyzdžiai iki tolimesnės analizės laikomi šaldiklyje (temperatūra ne mažesnė nei –18 °C).
Sekos buvo nustatytos Macrogen (Olandija) kompanijoje. Po sekoskaitos gautos DNR sekos sutvarkytos, naudojant Vector NTI® Express (Thermo Fisher Scientific) programą. Sekų analizei, identifikavimui ir palyginimui naudotas standartinis vienetinio lygiavimo paieškos įrankis „The Standart Nucleotide BLAST“ (NCBI duomenų bazė) įrankis (76). Bakterijų giminingumo medžiai sudaryti naudojantis MEGA programos 7.0.20 versija bei NCBI duomenų bazės duomenimis (77).
2.12 Tikro laiko PGR ir aukštos skiriamosios gebos lydymasis (HRM)
Į reakcijos mišinį dedama 0,3 µl (10 µM) FIMAM11 ir FIMAM12 pradmenų mišinio, 7,5 µl SensiMixTM II Probe (Bioline) dukartinio mišinio, 0,4 µl Syto 9 (ThermoFisher Scientific) žaliai floresuojančio dažo ir 5,8 µl distiliuoto vandens. Į gautą mišinį įdedama po 1 µl atitinkamo mėginio DNR ir pradedama polimerazės grandininės reakcijos programa.1. Pradinė denatūracija: 95°C 10 min.
2. DNR grandinių atskyrimas: 95°C 20s – 30 ciklų. 3. Pradmenų prijungimas: 60°C 1 min – 30 ciklų. 4. Grandinės ilginimas: 72°C 15s – 30 ciklų.
Fluoresencija matuojama po paskutinio kiekvieno ciklo žingsnio.
Lydimosi kreivės analizė atlikta po fragmentų amplifikacijos. Lydimosi kreivė gaunama, lydant DNR nuo 80°C iki 88°C temperatūros 0,05°C/s greičiu, nuolat matuojant produktų fluorescenciją.
Tikro laiko polimerazės grandininės reakcija ir aukštos skiriamosios gebos lydymasis atliekami naudojant Roto-GeneTM 6000 (Qiagen) amplifikatorių. Gautos lydymosi kreivės normalizuotos ir duomenys analizuoti naudojant programos Rotor-Gene 1.7.87 versiją.
26
3. TYRIMO REZULTATAI
Norint įvertinti, kokios Porphyromonas gentie bakterijos ir kokie Porphyromonas spp. fimA genų variantai yra paplitę Lietuvos šunų dantų apnašose buvo ištirti 36 šunų dantų apnašų mėginiai surinkti 2014 liepos mėn. – 2016 sausio mėn. Iš viso ištirta 20 patelių (55,56 proc.) ir 16 patinų (44,44 proc.). Tirti šunys buvo nuo 2 iki 15 metų amžiaus. Daugiausia dantų apnašų pavyzdžių buvo paimta iš mišrūnų (41,67 proc.) ir Jorkšyro terjerų (16,67 proc.). Maženę grupę sudarė Rusų toiterjerai (8,33 proc.) ir Prancūzų buldogai (5,56 proc.). Maždaug ketvirtadalį tirtų šunų sudarė kitos šunų veislės, bet jų tirta tik po vieną atvejį (2 lent.).
2 lentelė. Duomenys apie tirtus gyvūnus (n=36).
Veislė Skaičius (patelės:patinai) Amžius (vidurkis), metais
Mišrūnas 15 (6:9) 3–15 (9.3) Jorkšyro terjeras 6 (1:5) 2–6 (4.7) Rusų toiterjeras 3 (2:1) 4–8 (5.7) Prancūzų buldogas 2 (2:0) 5–11 (8) Kitos* 10 (5:5) 2–12 (5.9) Iš viso 36 (16:20) 2–15 (7.1)
*Škotų terjeras, Vokiečių špicas, Džeko Ruselo terjeras, Maltos bišonas, Rusų spanielis, Pudelis, Haskis, Anglų kokerspanielis, Čihuahua, Kinų koduotasis.
Iš paimtų šunų dantų apnašų mėginių buvo išskirta suminė genominė DNR ir, jos kokybei įvertinti, buvo atlikta polimerazės grandininė reakcija, naudojant bakterijų 16S RNR genui specifinius Woo1 ir Woo2 pradmenis. Visais atvejais atlikus analizę elektroforezės gelyje nustatyti 1,5 kb dydžio DNR fragmentai, tai rodė, kad išskirta DNR buvo tinkama tolimesnėms analizėms.
Norint įvertinti, ar dantų apnašų mėginiuose buvo Porphyromonas genties bakterijų, išskirta suminė DNR tirta, naudojant specifiniusPorphyromonas spp. fimbrilino baltymą koduojančio geno
(fimA) pradmenis (FIMAM11 ir FIMAM12) (62). Buvo parenkamos optimalios sąlygos šio geno padauginimui, keičiant polimerazes ir amplifikavimo programas. Geriausi rezultatai, t.y. didžiausias skaičius 1.4 kb fragmentų, naudojant dantų apnašų DNR pavyzdžius, buvo padaugintas naudojant Hot Start Green polimerazę (ThermoFisher Scientific) ir pirmą PGR programą. Remiantis gautais rezultatais ir žinant, kad visos Porphyromonas genties bakterijos turi fimA geną, buvo padaryta išvada, kad beveik pusė tirtų šunų burnos ertmėje nešiojo šį patogeną (3 pav.).
27
3 pav. Porphyromonas genties bakterijų atžvilgiu teigiami ir neigiami mėginiai (n=36). Tarp Porphyromonas genties atžvilgiu teigiamų šunų (n=15) buvo 6 patelės (40 proc.) ir 9 patinai (60 proc.). Tirtų bakterijų atžvilgiu tiegiamų šunų amžius svyravo nuo 3 iki 15 metų amžiaus. Veislės atžvilgiu vyravo mišrūnai (53,33 proc.), Jorkšyro terjerai (13,33 proc.), Rusų toiterjerai (13,33 proc.) bei kitos veislės (20 proc.), kurių buvo po vieną atvejį (3 lent.). Dauguma šunų, kuriems buvo nustatytos Porphyromonas genties bakterijos, buvo priskirti 3-čiai (60 proc.) ir 4-tai (26,67 proc.) grupei, atsižvelgiant į jų dantų būklę (1 lent.).
3 lentelė. Duomenys apie tirtus šunis, kuriems nustatytos Porphyromonas genties bakterijos Nr. Mėginio pavadinimas Veislė Amžius, metais Lytis Dantų būklė
1. S2 Mišrūnas 3 Patelė 3
2. Ca4 Toy terjeras 8 Patelė 3
3. Ca8 Škotų terjeras 9 Patinas 4
4. Ca10 Mišrūnas 5 Patinas 2
5. Ca13 Mišrūnas 10 Patinas 3
6. Ca23 Prancūzų buldogas 11 Patelė 3
7. Ca26 Jorkšyro terjeras 5 Patinas 3
8. Ca27 Mišrūnas 10 Patelė 4
9. Ca28 Mišrūnas 15 Patelė 4
10. Ca33 Anglų kokerspanielis 8 Patelė 2
11. Ca34 Mišrūnas 12 Patinas 4
12. Ca35 Mišrūnas 12 Patinas 3
13. Ca38 Mišrūnas 6 Patinas 3
14. FRE Toiterjeras 5 Patinas 3
15. ROK Jorkšyro terjeras 6 Patinas 3
Tolimesniems tyrimams pasirinkti DNR pavyzdžiai išskirti iš Porphyromonas genties bakterijų nešiotojų dantų apnašų. Norint tiksliau identifikuoti fimA geno tipus, padauginti DNR fragmentai, naudojant pradmenis FIMAM11 ir FIMAM12 ir individualius DNR pavyzdžius. Gauti
28
~1,4 kb DNR fragmentai buvo išgryninti ir kiekvienas liguotas su pTZ57R/T DNR vektoriumi. Ligavimo mišiniais buvo transformuotos elektroimliosios E. coli DH5α ląstelės. Išsėjus bakterijas ant agarizuotos terpės, E. coli kolonijos su įsistačiusiais fimA genais atrinktos, naudojant fenotipę lacZ atranką (baltos kolonijos – DNR fragmentas įsistatęs į vektorių, mėlynos – vektorius tuščias). E. coli bakterijų kolonijos, turinčios tikslinį DNR fragmentą, padaugintos ir iš jų šarminės denatūracijos būdu išskirta plazmidinė DNR. Norint įsitikinti, kad plazmidinėje DNR yra 1,4 kb fimA geno fragmentas, išgryninta DNR buvo sukarpoma naudojant HindIII ir EcoRI restriktazes ir analizuojama agarozės gelyje kartu su DNR ilgio žymenimis. Tipinio eksperimento duomenys pateikti 4 paveiksle.
4 pav. Klonuoto DNR fragmento analizė elektroforezės agarozės gelyje metodu. Pateikta
klono p4CaF analizė. Autorė Erna Marija Meškytė
Patvirtinus, kad 1,4 kb dydžio fragmentas įsistatęs, buvo skiriamos plazmidės, jos ruošiamos DNR sekoskaitai ir nustatoma nukleotidų seka. Panaudojus kiekvieną dantų apnašų DNR pavyzdį buvo klonuota nuo 1 iki 6 individualių 1,4 kb dydžio fragmentų. Tokiu būdu iš viso tyrimo metu nustatytos 47 genų sekos.
5 pav. Porphyromonas spp. bakterijų rūšių pasiskirstymas tirtuose mėginiuose (n=15). Iš analizavus nuskaitytas sekas ir palyginus jas su genų banko duomenimis, nustatyta, kad tirtuose mėginiuose rasta Porphyromonas gulae bakterijų fimA geno A ir B genotipai (4 lent.) bei
29
4 lentelė. P. gulae genotipai ir genų banko referentinės sekos, naudotos genotipams identifikuoti.
Skaičius prie dantų apanašų mėginio – tai tirto klono numeris.
Mėginys Rūšis Genotipas Referentinė seka Panašumas į referentinę seką, proc.
p4CaF P. gulae A AB663096.1 (5) 96
pCa8F3 P. gulae A AB663093.1 (5) 99
pCa8F4 P. gulae A AB663093.1 (5) 99
pCa8F5 P. gulae A AB663093.1 (5) 99
Ca23_2 P. gulae A AB663096.1 (5) 99
Ca23_3 P. gulae A AB663096.1 (5) 99
Ca23_4 P. gulae A AB663096.1 (5) 100
Ca23_5 P. gulae A AB663098.1 (5) 99
Ca26_1 P. gulae A AB663096.1 (5) 96
Ca26_2 P. gulae A AB663096.1 (5) 96
Ca35_1 P. gulae A AB663095.1 (5) 99
Ca35_2 P. gulae A AB663095.1 (5) 99
Ca38_7 P. gulae A AB663096.1 (5) 99
Ca38_8 P. gulae A AB663096.1 (5) 99
Ca38_9 P. gulae A AB663096.1 (5) 100
FRE2 P. gulae A AB663096.1 (5) 96
ROK1 P. gulae A AB663096.1 (5) 99
ROK2 P. gulae A AB663096.1 (5) 98
ROK3 P. gulae A AB663096.1 (5) 100
ROK4 P. gulae A AB663096.1 (5) 99
2S1 P. gulae B AB663102.1 (5) 99
2S2 P. gulae B AB663102.1 (5) 97
Ca13_4 P. gulae B AB663102.1 (5) 99
Ca33_1 P. gulae B AB663102.1 (5) 99
Ca33_2 P. gulae B AB663102.1 (5) 99
Ca33_3 P. gulae B AB663102.1 (5) 99
Ca33_4 P. gulae B AB663102.1 (5) 99
Ca33_5 P. gulae B AB663102.1 (5) 99
Ca33_6 P. gulae B AB663102.1 (5) 98
Ca34_1 P. gulae B AB663102.1 (5) 99
Ca34_2 P. gulae B AB663102.1 (5) 99
Ca34_3 P. gulae B AB663102.1 (5) 99
Ca34_4 P. gulae B AB663102.1 (5) 99
Ca34_5 P. gulae B AB663102.1 (5) 99
30
5 lentelė. P. gingivalis genotipai ir genų banko referentinės sekos, naudotos genotipams identifikuoti.
Skaičius prie dantų apanašų mėginio – tai tirto klono numeris.
Mėginys Rūšis Genotipas Referentinė seka referentinę seką, proc. Panašumas į
pCa10F1 P. gingivalis II AB795744.1 (78) 100
pCa10F2 P. gingivalis II AB795744.1 (78) 100
pCa10F10 P. gingivalis II AB795744.1 (78) 99
Ca23_1 P. gingivalis II AB195786.1 (79) 96
Ca27_1 P. gingivalis II AB195786.1 (79) 96
Ca27_2 P. gingivalis II AB195786.1 (79) 96
Ca27_3 P. gingivalis II AB195786.1 (79) 96
Ca27_4 P. gingivalis II AB195786.1 (79) 96
Ca28_1 P. gingivalis II AB195786.1 (79) 96
Ca28_2 P. gingivalis II AB195786.1 (79) 96
Ca28_3 P. gingivalis II AB195786.1 (79) 95
Ca28_4 P. gingivalis II AB195786.1 (79) 94
Daugiausiai rasta P. gulae fimA A genotipo bakterijų (46,67 proc.) ir P. gulae fimA B genotipo bakterijų (26,67 proc.). Porphyromonas gingivalis bakterijų fimA buvo rastas tik II genotipas (20,00 proc.). Taip pat viename mėginyje buvo aptikta tiek P. gingivalis fimA II genotipo, tiek P. gulae fimA A genotipo bakterijų (6,67 proc.) (6 pav.).
6 pav. P. gulae ir P. gingivalis fimA genotipų pasiskirstymas tirtuose šunų dantų apnašų mėginiuose.
* - P. gulae A ir P. gingivalis II.
Porphyromonas spp. bakterijų sintetinamų fimbrilino baltymų giminingumo medis sudarytas
naudojant MEGA7 programą, maksimalaus tikėtumo metodą (Maximum Likelihood) (77,80). Analizei panaudotos 67 sekos, iš kurių yra 47 tyrimo metu nustatytos sekos ir 21 referentinė seka, paimta iš NCBI duomenų bazės. Porphyromonas spp. fimbrilino baltymą koduojančios sekos
