ETH Library. Doctoral Thesis. Author(s): Alvino, Claudio. Publication date: Permanent link:

ETH Library

Sulla conversione della vitamina K-1 (fillochinone) negli embrioni di pollo e della vitamina K-3

(menadione) nel Lumbricus terrestris in vitamina K-2(20)

Doctoral Thesis Author(s):

Alvino, Claudio Publication date:

1965

Permanent link:

https://doi.org/10.3929/ethz-a-000091248 Rights / license:

In Copyright - Non-Commercial Use Permitted

This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection.

For more information, please consult the Terms of use.

PARTE I

Sulla conversione della vitamina K: (fillochinone) negli embrioni di pollo

^e

della vitamina K3 (menadione)

nel Lumbricus terrestris in vitamina K2(2o)

PARTE II

Azione di alcune sideromicine

e

sideramine sul metabolismo di alcuni batteri

e

sulla sintesi

in vitro dell'emina

DISSERTAZIONE

presentata alla Scuola Politecnica Federale di Zurigo

per

il conseguimento ^{del titolo di}

Dottore in Scienze

Tecniche

dal

Signor

CLAUDIO ALVINO

Dott. inScienze

Biologiche

all'Università di

Napoli

Cittadino italiano

Relatore: Prof.Dr. C. Martius Correlatore: Prof.Dr. L.

Ettlinger

Juris

^Druck+

Verlag Zurigo

1965

Leer

^-

Vide

^-

Empty

Leer Vide Empty

Herrn Prof. Dr. C. Martius

bin ich fiir sein Interesse an dieser Arbeit und fiir seine

grossziigige

Hilfe sowie fiir das mlr

entgegengebrachte

Wohlwollen zu grossem Dank verpflichtet.

Al mio

Maestro,

Prof. Dr. C. Martius

sento di essere profondamente riconoscente per il prezioso criticismo con il quale ^ha seguito questo lavoro. Lo ringrazio inoltre per la benevolenza con la quale ^{mi ha} sempre guidato.

Leer Vide Empty

INDICE

PARTE I

Sulla

cor di

pollo

Sulla

conversione del fillochinone in vitamina

K<vgn\ ^negli

^embrioni

Introduzione 11

Parte teorica 13

A)

Considerazioni

generali

sul metabolismo della vitamina K 13 1. Conversione del fillochinone nelle uova fecondate di

gallina 14

2. Conversione del fillochinone somministrato per os

alle

galline

19

Sulla conversione del menadione in vitamina Kq/<.m ^{nel L. terrestris}

^2(20)^•

B)

Considerazioni generali sul metabolismo della vitamina K

negli

^anellidi 24

1. Conversione del metilnaftochinone nel L. terrestris 24

Parte

sperimentale

27

A)

Sintesi dei composti radioattivi 27

B)

^Derivati 29

C)

^{Materiale da} esperimento 29

D) Applicazione

^dei composti ^marcati 30

E)

Metodi analitici 31

1. Estrazione e separazione controcorrente 31

2.

Cromatografia

^su strato sottile 32

3. Misurazione della

radioattività

₃₂

Sommario 33

Azione di alcune sideromicine e sideramine sul metabolismo di alcuni batteri e sulla sintesi in vitro dell'emina

A)

Considerazioni generali ^{su alcuni} rappresentanti ^del

gruppo ^dei siderocromi 37

1. Azione di alcune sideromicine sul B. subtilis e

sull'E. coli 37

a)

^{Materiali e metodi 38}

b)

^{Risultati 40}

B)

Considerazioni

generali

sulla biosintesi delle porfirine ⁴⁶ 1. Azione di alcuni siderocromi sulla sintesi in

vitro dell'emina 47

a)

^{Materiali e metodi 47}

b)

^{Risultati 48}

Sommario 49

Bibliografia

⁵¹

PARTE I

SULLA CONVERSIONE DELLA VITAMINA

B^ (FILLOCHINONE)

^IN VITAMINA

K2(20)

NEGLI EMBRIONI DI POLLO

Leer Vide Empty

Introduzione

E' ben noto che un considerevole numero di composti ^esibisce

proprietà antiemorragiche

nei tests

biologici.

Uno di questi è il metilnaftochinone

(noto

anche come menadione o vitamina

K„).

Altri composti ^{affini che} possono essere facilmente trasformati in metilnaftochinone

nell'organismo

^{animale - l'aminome-} tilnaftolo o vitamina _{K, per} esempio ^- rappresentano ulteriori casi. Ih

aggiunta

a questi

composti

relativamente

idrofili,

esiste anche un gruppo ben definito di

composti lipofili

quale la vitamina K.

(o fillochinone)

^{e tutta una serie di vita¬}

mine

K,

isolate dai batteri

(Ko/ocy Kof45ì ecc*)- <-)ra>

prescindendo ^{dalla loro}

attività

che risulta essere ^- su base molecolare ^- praticamente la stessa e dal loro comportamento per quanto concerne solubilità e altre

proprietà

fisico-chimi¬

che,

^{è utile citare} quanto segue. ^Per

lungo

tempo la vitamina K è stata conside¬

rata come direttamente partecipe ^{- nel}

fegato

^{- alla} sintesi dei fattori che rego¬

lano la

coagulazione

^del sangue ^{e in}

particolare

della protrombina ^{e del fattore} VEL Nel corso delle ricerche effettuate da Martius &

Nitz-Litzow'

^{'* '}

sulla catena respiratoria fosforilativa è emerso che tutte le sostanze che in vivo agiscono ^{come anti-K}

(tra

queste quel

tipico disaccoppiante

che è il ben noto

dicumarolo),

agiscono ^{anche come} antagoniste ^molto

potenti

dell'ossidazione fosfori¬

lativa » Taleantagonismo

è però

^annullatomediante aggiuntadi vitamina K^a tali

anticoagulanti.

^Ciò

porterebbe

^{adattribuire al}fillochinone un'azione catalitica nella fosforilazione ossidativa. Tali risultati sarebbero del resto confermati dal

fatto che l'alterato rapporto

P/O

^{che si riscontra nei} mitocondri del fegato di polli ^{tenuti a dieta} priva ^{di vitamina}

K, può

^essere normalizzato mediante aggiunta di vitamina K. o K„* ^•

Inoltre,

poiché ^il

menadione^

^' è in

grado

^di rinormalizzare in vivo tutti i sintomi causati da una carenza di vitamina

K,

^ma

non l'alterato rapporto

P/O

in

vitro,

dobbiamo dedurre che il nucleo

chinonico,

per ^essere

fisiologicamente attivo,

^ha bisogno ^{della sua} catena laterale

lipofila.

Tale catena che

l'organismo

^{animale è in} grado di sintetizzare è

costituita,

^nel

caso della vitamina

Kn/Qny

^{da 4} unità isopreniche

(geranilgeraniolo)

^{con 4}

doppi

legami

(uno

per ogni

unità isoprenica).

^Premesso

ciò

e accertato che l'organismo animale è in

grado

^di

convertire,

^{con il concorso} della flora batterica intestinale

Wl'/W^

^jj fillochinone

(ma

anche altre vitamine

appartenenti

^{alla serie delle}

K„)

in vitamina

Ko/ony

^{c* siamo chiesti: Pu°} quest'ultima vitamina formarsi anche in assenza della suddetta flora batterica?

La prima parte ^di queste ricerche svolte utilizzando fillochinone radioattivo

3 1J

(H

nel gruppo metilico del nucleo chinonico ^e C nella catena

laterale),

^{ha cer¬}

cato di dare un'esauriente risposta ^a tale quesito.

PARTE TEORICA

A)

Considerazioni

generali

^sul metabolismo della vitamina K

E' opportuno ^{ricordare che} gli ^{uccelli e i mammiferi} provvedono ^{in ma¬}

niera diversa al loro

fabbisogno

di vitamina K. I

primi,

^{in virtù della} partico¬

lare conformazione anatomica dell'intestino crasso, ^sono prevalentemente assog¬

gettati all'apporto

^loro proveniente attraverso il nutrimento

(nel

^{caso di nutri¬}

mento

vegetale,

^al

fillochinone).

^I

mammiferi,

invece, ^sono ampiamente agevo¬

lati in questo compito potendo disporre delle vitamine prodotte dalla ricca flora batterica intestinale. Sulla base dei risultati ottenuti da Billeter, Bolliger

& Martius,(9) appare altamente

probabile

^{che la} produzione

endogena

di vita¬

mine K daparte dei batteri

intestinali,

^non avvenga al solo fine di rendere

più

o meno

indipendente l'organismo

^nel quale essi operano, ^ma anche nel loro stes¬

so interesse. Infatti il

menadione, originatosi

^dalla demolizione

(operata

^{dai bat¬}

teri)

^{della catena} laterale di

qualsivoglia

^{derivato del}

2-metilnaftochinone,

^serve

anche per sintetizzare ^{le loro} vitamine K. Tali vitamine ^- sempre ^del tipo ^delle K ^- sarebbero per ^essi cellularmente specifiche. E' altamente probabile ^che questa eliminazione della catena laterale

(nei

^{colombi essa è} rintracciabile sotto forma di un estere dell'acido

fitanico),

possa ^essere effettuata da tutta una serie di batteri e non soltanto da quelli K-eterotrofi. Tra questi ultimi è opportuno menzionare il Fusiformis nigrescens, perché rappresenta ^ilprimo microorgani¬

smonoto che necessita vitamina K quale fattore di crescita. Anche _per gli orga¬

nismi

superiori,

^il metilnaftochinone rappresenterebbe ^una

"provitamina"

^essen¬

ziale. Se esso sia poi ^{contenuto nel nutrimento sotto forma di}

fillochinone,

non ha importanza ^{alcuna. Saranno infatti i batteri} intestinali che provvede¬

ranno ad eliminare la catena laterale in posizione

3,

trasformandolo di nuovo in vitamina K„. Tuttavia ciò non esculde che l'eliminazione della catena laterale possa ^avvenire ad opera ^di batteri diversi da quelli ^che presiedono ^{alla sua sin¬}

tesi. Comunque ^abbia luogo la formazione in

metilnaftochinone,

^{solo come tale}

esso

sarà

"accettato"

dall'organismo

^{animale che lo}

trasporterà poi,

^mediante

il torrente

circolatorio,

^verso

particolari

^strutture cellulari. A livello di queste ultime avverrà poi la trasformazione in vitamina

Ko/20ì* *->ra>

^{essendo stato}

confermato

più

^{volte* ' che il} metilnaftochinone viene convertito

nell'organismo

animale essenzialmente in vitamina

Kn/ony

^* lecito supporre che quest'ultima vitamina

rappresenti

per ^{esso il} derivato

più

^{idoneo a} soddisfare le sue

esigenze fisiologiche.

^Molto

più

^{difficile si}

presenta

il tentativo di far luce sul

destino,

nonché sulla funzione esercitata dalle vitamine K. e K„ che non subiscono l'eli¬

minazione della catena laterale.

Appare però probabile

^{che esse} vengano ^rias¬

sorbite come tali e poi

convogliate

^nel

fegato.

^Se poi ⁱⁿ

quest'organo

^{di accumu¬}

lo della vitamina _{K possa} aver

luogo,

ⁱⁿ

particolari circostanze,

anche l'elimina¬

zione della loro catena

laterale, ciò

^resta da stabilirsi. Un tentativo a tal riguar¬

do consisterebbe nell1effettuare una serie di ricerche suorganismi assolutamente incontaminati da batteri. Tali

ricerche,

pur richiedendo un'attrezzatura che non era a nostra

disposizione,

^sonostate ciononostante effettuate ricorrendo all'uso di uova fecondate di

gallina perché,

^{tra i materiali presi in}

considerazione,

^{ci of¬}

frivanomaggiore sicurezza di

sterilità.

Facendo uso dei dovuti

accorgimenti

^atti ad evitare

qualsiasi apporto

^{esterno di} fattori contaminanti che potessero compro¬

metterne la

sterilità,

abbiamo iniettato a queste ^{uova una} piccola

quantità

^{di fil¬}

lochinone altamente marcato e analizzato poi ^{i suoi}

prodotti

di trasfor¬

mazione negli embrioni in via di sviluppo ^{. Alla luce} dei risultati ottenuti pos¬

siamo affermare che il fillochinone si

trasforma,

ⁱⁿ

questi organismi

^inconta¬

minati da

batteri,

^{in vitamina}

K2(20).

^Tale

^risultato,

^{per quanto}

sorprendente,

^ci

lascerebbe supporre ^{che anche} negli organismi

adulti,

tale processo

potrebbe

essere cellularmente possibile.

Tuttavia, bisogna

anche tenere nel debito conto le

diversità

esistenti tra embrioni e organismi ^adulti.

1. Conversione del fillochinone doppiamente marcato nelle uova fecondate di

gallina

L'effettuazione ^di

queste

ricerche non ha comportato particolari

difficoltà.

La sospensione ^{di una}

piccola quantità

^di fillochinone altamente marcato

(C

nella catena

laterale,

^H3^{nel nucleo}

chinonico),

^{è stata iniettata} nell'albume di

uova fecondate di

gallina (particolari

^a pag.

33).

^Le uova, lasciate a tempera¬

tura ambiente per 24 ore, ^sono state normalmente incubate ^e i

pulcini,

^a

svilup¬

po

ultimato,

^uccisi prima ^che sgusciassero per conservare ulteriormente le ^con¬

dizioni di

sterilità.

I tessuti da analizzare

(sangue, muscoli, fegato,

^{cuore e}

intestino)

^{sono stati} rapidamente congelati ^{in azoto} liquido ^e quindi liofilizzati

sotto

ghiaccio

^{secco. Allo} scopo di ottenere ^unaprima informazione sulla natura dei

prodotti

di trasformazione presenti nei

singoli organi,

questi ultimi sono sta¬

ti

sottoposti

ad un'estrazione con etere etilico esente da

perossidi;

^{l'etere eva¬}

porato gli

^estratti

lipidici

^{ottenuti sono stati} sottoposti ^{a una} separazione controcorrente usando un

apparecchio

^di

Craig

^{a 35 elementi}

(Soc. Biihler, Tiibingen)

^e

quale

sistema solvente:

eptano-metilglicole.

La

fig.

¹

raccoglie

ⁱ risultati ottenuti dal

fegato

^{di un} tale pulcino.

flO.

Fig. ^{1 Curva di} ripartizione ^{di un estratto}

lipidico

del

fegato

^{di un} pulcino sgusciato ^{da un uovo nel}

quale,

prima dell'incubazione, era stato inietta¬

to fillochinone

doppiamente

^marcato

(H^nel _nucleo,

C" nella catena la¬

terale).

^{A destra:}

attività

del C"

*—«—«[corrispondente

a

0,3

ug di vitamina

Kj/g

^di organo ^secco

];

^{•—•—•}

^attività

^{del tritio}

L corrispon¬

dente alla somma di vitamina Ki

(spalla

ⁱⁿ corrispondenza della frazione

24)

^e di vitamina

K2(20) (= ^°»58 Pg/s

<& organo

secco)]

^{. A sinistra:}

curve di ripartizione del tritio*—«—«e del

C*4 o—o—odopo

acetilazìone riduttiva delle frazioni 16-22 della prima

ripartizione.

curva di

ripartizione

dell'autentico diacetato della diidrovitamina K,

2(20)*

Dall'andamento delle curve

rappresentative

^della radioattività del tritio e del C14_, appare evidente che ^{solo una}

piccola

quantità ^di fillochinone non tras¬

formato è presente ^nel

fegato (massimo

^e

rispettivamente spalla

ⁱⁿ corrisponden¬

za delle frazioni

23-24).

La restante

parte,

dopo

perdita

^della catena latera¬

le e successivo passaggio ^a

metilnaftochinone,

^{ha dato}

luogo

alla formazione di

tmp/n^>m

a

\Km

1200

A

eoo

/ \

iOO

1 / \

.--i- 1

\""

1 1 1, ZL..

S 10 15 20 25 30 3i

lmp/y eoo

r

\Hw»

i00

200

£-~r'

i i

"~7

I

""T-h

5 10 15 20 2S 30 3i 10 15 20 25 30 3i

Fig. ^{2 a - d Curve di} ripartizione

degli

estratti

lipidici

ottenuti da _organi di¬

versi di un pulcino

sgusciato

^{da un uovo} che ha ricevuto fillochi¬

none

doppiamente

^marcato

(cfr. fig. 1) a) intestino; b)

^muscoli

pettorali; e)

cuore;

d)

sangue;

attività

del

tritio;

attività

del

Cl4.

vitamina

K2/2Q\ ^(massimo

ⁱⁿ corrispondenza ^delle frazioni

19/20).

Cosa sia av¬

venutodel materialeche costituiva la catenalaterale

è

difficile dadire. Infat¬

ti essa non si distacca nell'identico modo riscontrato nel caso dei colombiua)^' ',

Nella

fig. 2a-d,

^sono raccolti i risultati ottenuti dall'analisi

degli

estratti lipidi¬

ci di altri organi. Appare ^evidente che sia il muscolo cardiaco che i muscoli

pettorali,

^sono praticamente privi di vitamina IC. Un quadro quasi

analogo

^ci è offerto dall'intestino. Del tutto diverso appare invece ^il rapporto

K./K„,?0>

^nel

sangue, dove^{esso e} fortemente spostato ⁱⁿfavore del fillochinone. A talpunto è opportuno ^tenere presente ^{che anche nel}

fegato (cfr. fig. 1)

^{è stato} riscontra¬

ta la presenza di fillochinone non trasformato in vitamina

Ko/ony

^Come

^interpre¬

tare quindi tale particolare

comportamento

del

fegato,

quando sappiamo che i suoi omogenati ^sono perfettamente in grado di trasformare in vitro il metilnafto¬

chinone in vitamina

Kg,,,,,*

^{? In} primo luogo potremmo supporre che ^il fillochi¬

none affluito al

fegato

venga

eliminato,

ⁱⁿ

parte,

direttamente attraverso la bile mentre la restante parte che non ha subito trasformazione

alcuna,

^verrebbe accumulata in attesa di essere nuovamente immessa nel torrente circolatorio.

Ciò potrebbe giustificare

l'alto tenore di fillochinone riscontrato nel sangue. Di¬

versamente potremmo assumere che nel

fegato

qualche altro

composto,

^{la cui} composizione si avvicini molto a quella della vitamina

K2/2f)\,

^{Quale ad esempio}

lo stesso

fillochinone,

agisca direttamente e con

gli

^stessi effetti della vitamina

K„/?nv,

purché presente ⁱⁿ una concentrazione sufficientemente elevata. In tale ultima alternativa

quindi,

^{ci sarebbe nel}

fegato

un' azione diretta del fillochinone

(o

composti

affini)

prima ^{ancora che si sia} verificata la sua

trasformazione in vitamina

Ko/90V ^Purtroppo,

^{una verifica} sperimentale di ques¬

ta ultima ipotesi ^non è facile in quanto ^la trasformazione del fillochinone in

quest'organo,

^{anche se non}

paragonabile

^a quella riscontrata negli ^altri

organi,

ha luogo assai rapidamente. ^In ogni ^caso

ciò

_potrebbe anche rispondere ^aunapro¬

prietà fisiologica

poiché

negli

^{stessi estratti} lipidici dell'intestino e del sangue

(v. fig. 3a-b),

^{allorché è} stato iniettato metilnaftochinone in sostituzione del

fillochinone, gli

^{embrioni sono stati} perfettamente in

grado

di trasformarlo total¬

mente in vitamina

K9(20V

^{O"68** risultati ci} confermerebbero ancora una volta come il metilnaftochinone

(ma

^anche

gli

^altri composti

appartenenti

alla serie delle

K„),

rappresenti il precursore per eccellenza della vitamina

K2/2oy ^Ciò

non esclude tuttavia che

l'organismo animale,

^{come del resto}

già

^{abbiamo riferi¬}

to

accetti,

ⁱⁿ

particolari circostanze,

^{anche altri} composti ^{che si avvicinino}

Impt

7600

tiin

\

a

5700 -

3800 i-

1900 5

i

IO ,- i

SÌ5

i

20

i

'r- ^{-¥. *}

Imp/r 1000

nin

i

è

7S0

500 250 -

1 ^{i i i} , i i '

IO 20 25 30 3i

Fig. ^{3a-b Curve di}

ripartizione degli

^estratti

lipidici

dell'intestino e del sangue ^diun pulcino sgusciato ^{daun uovo nel} quale ^{era stato} iniettato diidromenadione diacetato marcato

(H^

^nel gruppo ^metili¬

co),

a)

intestino; b) sangue; attività del tritio.

strutturalmente alla

Kg/ony

^{Nella figura 4 sono riportate le curve di}

^riparti¬

zione di un estratto muscolare di

pulcino, (cfr. fig. 2b)

^ottenute prima ^e

dopo

avere effettuata la caratterizzazione del

prodotto

di conversione del fillochinone.

Come risulta in figura

4,

^{nei muscoli} pettorali ^non si rscontra

l'attività

del C14 orginariamente presente nella catena laterale del fillochinone. La curva di

ripartizione corrispondente all'attività

^del tritio ottenuta

dopo

acetilazione

riduttiva,

^coincideesattamente conquelladell'autentico diacetato della diidrovi- tamina

IC^n)

^misurata

otticamente; ciò

sta ad indicarci che anche nel muscolo la catena laterale fitilica

è

stata sostituita da quella ^del

geranilgeraniolo.

D.O.

1

.

Imp/fnm _/\,

1.0. -1250

/\ 1

^K

/ ^A

²⁽²⁰⁾

.8 .JOOD

/ A

//

II

\

\ ^\

l ^\\

a.

\

^\

£ ti

\ ^\

1

230

^_7S0

¹ _{V /}

it -e

il \

^{^}

/

.4 ^-_S00

II

I

1 / / i

V\

\\

.2 _

ho \

/

/

1 i

\

1 J _ 1

IO 15 20 25 30 Si-

Fig. ^{4 Curve di} ripartizione dell'estratto

lipidico

della muscolatura di un

pul¬

cino sgusciato ^{da un uovo}

dopo

applicazione ^{di vitamina}

Ki

^marcata

(nel

nucleo e nella catena

laterale).

^{A destra:}

•—•—•attività

del tritio incor¬

porata ^{nella vitamina}

K2(20)

^{in cui è} stato totalmente trasformato il fil¬

lochinone. ^A sinistra: curve di ripartizione ^{della vitamina}

K2(20) ^dopo

acetilazione riduttiva e dell'autentico diacetato della diidrovitamina

K2(20)

misurata otticamente .

2. Conversione del fillochinone doppiamente marcato somministrato per ^os alle galline

Fermo restando

che,

^{come del resto dimostrato} dai tests

batteriologici,

^il

contenuto intestinale dei pulcini appena sgusciati è ^risultato perfettamente

sterile,

i risultati

inaspettatamente ottenuti,

^ma

peraltro

confermati attraverso numerosi

esperimenti,

^{ci hanno} indotto ad effetuare ulteriori

indagini

^allo scopo di chiarire quale ruolo possa ^esercitare questo ^insolito meccanismo di conversione del fillo¬

chinone riscontrato

negli

embrioni di

pulcino.

^Nel tentativo di risolvere questo

quesito,

^abbiamo somministrato per ^{os a}

galline

in

periodo

^di

attività ovariale,

fillochinone

doppiamente

^marcato

(H

3 ^nel gruppo metilico del nucleo

chinonico,

C nella catena laterale

fitilica),

^{e ricercato} quindi l'ammontare di eventuali

prodotti

^di trasformazione di detta vitamina sia nel tessuto ovariale che nelle uova in differenti stadi di sviluppo.

Dopo

^un periodo ^{di 10}

giorni,

^{durante il} quale ^le galline ^avevano ricevuto in totale mg

2,25

di fillochinone

marcato,

^è

stata effettuata l'analisi dei

prodotti

radioattivi

presenti negli

^estratti

lipidici

ottenuti nel modo

già

precedentemente ^descritto. Tale analisi ci ha offerto il

DA.

1.0.

-frp/m/'ii

5000

8 ...iOOO

.6._3000

<n

_|_200C

.1000

/

m.-*B-V-<

Fig. ^{5 Curve di} ripartizione dell'estratto lipidico del tessuto ovariale di una

gallina ^alla quale ^era stato somministrato per ^os fillochinone doppiamen¬

te marcato. A destra:

prodotto

di conversione del fillochinone

(=

vit.

K2(20) ^)•

^{A sinistra: curve di}

ripartizione

^dellavit.

K2(20) ^dopo

^acetila-

zione riduttiva *—*—k e dell'autentico diacetato della diidrovitamina

K2(20V

^>

^attica

residua della catena laterale

(C14)

seguente quadro: nel tessuto ovariale

(fig. 5),

^è stata riscontrata la presenza della sola vitamina

Kg,^ ^(non

^è

^più presente l'attività

del C

)

; nell'insieme delle

più piccole

^{uova analizzate}

(ca.

^{7 mm}

0 ),

^{sono stati} rinvenuti circa

0,40

ug di

K2,20>

^{assieme a}

^0,28

ug di vitamina

K,

^{; in un uovo di 14 mm}

⁰

^circa

2,16

ug di

~K-2(20)

^{assieme a}

^0,

^{42 ug di}

K^

^{; in un altro di 19 mm}

^{0 0,64}

^{ug di}

K2(20)

^e

^2'02

^{?& di}

^Kl (cfr* fig> 6)-

Imp/m'm

7500

5000 _

2500 _

0 5 10 15 20 25 30 3i 0 5 10 15 20 25 X 34

Imp/min

10500.

7000

3500 _

Fig. ⁶

X 34-

Curve di ripartizione degli estratti lipidici ^{di uova di}

gallina

ⁱⁿ differenti stadi di

sviluppo

^alla quale è stato somministrato per ^os fillochinone

dop¬

piamente marcato durante un periodo ^{di 10} giorni,

a)

^{uovo di 7 mm}

0

_;

b)

^{uovo di 10 mm}

0; e)

^{uovo di 14 mm}

0; d)

^{uovo di 19 mm}

0

; attività del

tritio; attività

del

C*4.

Le precedenti ^ricerche di Billeter & Martius(5)_, hanno messo in evi¬

denza come la vitamina

Kg,,

^{che si riscontra}

nell'organismo

^animale

adulto,

si

origina

^unicamente

(o

^almeno

prevalentemente)

^'dal metilnaftochinone liberatosi

1)

^{I metodi di} indagine

usati,

^{non consentono ancora di}

sciogliere

la riserva

legata

all'aspetto quantitativo ^dellatrasformazione.

a opera dei batteri intestinali. Premesso

ciò,

^è lecito supporre ^che la vitamina

K2(20ì

riscontrata nel tessuto

ovariale,

^e quasi sicuramente anche quella ^riscon¬

trata nelle uova ancora in fase di

sviluppo,

provenga dalla fonte

poc'anzi

^citata.

In

realtà

nondobbiamorestare sorpresi ^{da una tale}

duplice modalità

^di conversio¬

ne della vitamina K- da

parte dell'organismo degli

^{uccelli. Essa ci} appare ^senza altro conforme sia alle loro caratteristiche

anatomiche,

^{sia alla}

povertà

^della

loro flora batterica intestinale. Per

contro,

l'embrione ha tutto il tempo per effet¬

tuare,

poco ^apoco, ⁱ

più disparati

processi di demolizione e di trasformazione servendosi della sua riserva "artificiale" di vitamina K.. La

domanda,

^{se anche}

nell'organismo

^{dei mammiferi una tale} demolizione del fillochinone

(ma

^anche

degli

altri

composti

appartenenti ^{alla serie delle}

K2)

^{possa aver}

^luogo,

^rimane

da essere chiarita. L'insieme delle ricerche fin qui

effettuate,

^{non esclude che}

un tale processo

potrebbe

essere, ^anche nell'organismo ^dei

mammiferi,

^cellular¬

mente possibile.

SULLACONVERSIONE DEL MENADIONEINVITAMINA

Kg,^

^{NEL L. TERRESTRIS}

B)

Considerazioni generali ^sul metabolismo della vitamina K

negli

^anellidi

Le

precedenti

indagini hanno dimostrato che negli embrioni di pollo ^{ha luo¬}

go, anche senza il concorso della flora batterica

intestinale,

la conversione di alcune vitamine K in vitamina

K„,of),.

^Tale

^risultato,

^{del tutto}

sorprendente,

^ci ha spinti ^{ad effettuare una serie di} ricerche su

invertebrati,

^{le cui} esigenze

fisiologiche

^si discostano nettamente da quelle dei vertebrati fin qui studiati.

E' noto infatti da lungo tempo che il sangue dei vertebrati superiori presenta caratteristiche differenze fisiologiche rispetto ^a quello

degli

invertebrati inferiori.

Infatti,

^{mentre nei} primi è stata accertata la presenza di fattori che

regolano

la coagulazione ^del sangue, ^{nei secondi non} è stato ancora

possibile

rintracciarli.

Attraverso i lavori di Martius &

Esser1

^' condotti su animali vertebrati è

emerso che la sintesi di questi

fattori,

richiede la partecipazione di vitamine del gruppo K.

Ora,

^{l'assenza di tali fattori} riscontrata nel sangue

degli

^inverte¬

brati

dovrebbe,

^di conseguenza, ^{far escludere non solo la}

possibilità

di rinvenire queste vitamine in tali

organismi,

^{ma anche} quella ^{di una}

probabile

^trasforma¬

zione da parte ^{loro del} metilnaftochinone

(o

^del

fillochinone),

^{in un} prodotto ^ana¬

logo alla vitamina

K0/?n>

^{o a qualcuna} delle altre vitamine appartenenti ^{alla serie} delle K„. A tale scopo, ^abbiamo scelto quale punto ^di applicazione ^{il sacco celo-}

3 matico dell'anellide L. Terrestris e iniettato metilnaftochinone marcato

(H

^nel gruppo metilico del nucleo

chinonico).

Successivamente abbiamo ricercatogli eventuali

prodotti

di trasformazione sia nella

muscolatura,

^sianell'intestino.

1. Conversione del metilnaftochinone marcato nel Lumbricus terrestris

L'effettuazione di queste ^{ricerche ha} comportato qualche

difficoltà

_{sia per¬}

ché la cavità

celomatica,

^{a causa} delle contrazioni

dell'anellide,

^non sempre è stata facilmente

raggiunta,

^sia

perché,

^{a causa} delle stesse

contrazioni,

^{solo una}

piccola

parte ^della vitamina iniettata

poteva

^essere riassorbita.

Ciononostante,

^è

stato

ugualmente

possibile ^{studiare l'effetto delle} piccole

quantità

^{di menadione}

assorbito grazie ^{alla sua elevata} attività

specifica. Dopo applicazione

della vita¬

mina

attiva, gli

^{anellidi sono} stati tenuti per tre giorni ^{in un} recipiente ^colmo di terra

(prima

^{di tale} periodo ^non si riscontra alcuna conversione

apprezzabile).

Allo scadere dei tre

giorni,

gli ^{anellidi sono} stati sezionati al fine di _separare

L.2000 ^I

kafloj

0 5 W ¹⁵ 20 2S 30 X

Fig. ^{7 Curve di}

ripartizione degli

^estratti

lipidici

della muscolatura e, rispetti¬

vamente,

dell'intestino di un anellide nel cui sacco celomatico è stato iniettato menadione marcato

(H^

nel gruppo

metilico).

^{A destra: curva}

di

ripartizione

^del solo intestino ; ^{al centro: curva di} ripartizio¬

ne della sola muscolatura .

la muscolatura dall'intestino. H materiale

cosi-

ottenuto

è stato,

^{secondo la} procedura

già descritta,

^subito

congelato, liofilizzato,

^{estratto con etere e sotto¬}

posto ad analisi mediante separazione controcorrente

degli

^estratti

lipidici

nel solito apparecchio ^di

Craig.

^La fig. ⁷

raccoglie

ⁱ risultati ottenuti da tali analisi.

Essi rispecchiano ^il

comportamento

del menadione in ciascuno dei suddetti tessu¬

ti. La

muscolatura,

^{come indica la curva} rappresentativa

dell'attività

del

tritio,

contiene praticamente solo vitamine

K2/2Q. ^(massimo

ⁱⁿ

corrispondenza

^della frazione

19),

^{e tracce di un}

prodotto

^di trasformazione

più

lipofilo

(spalla

ⁱⁿ

corrispondenza

^delle frazioni

29/30).

Viceversa,

^l'estratto

lipidico

dell'intestino contiene solo il

prodotto più lipo¬

filo il cui massimo è ancora localizzato in

corrispondenza

^delle frazioni

29/30.

Per caratterizzare il

prodotto

di trasformazione che nella muscolatura

presenta

il suo massimo in

corrispondenza

della frazione

19,

^{sono state raccolte le fra¬}

zioni ottenute dalla distribuzione controcorrente dell' estratto

lipidico

da 14 a

r

Imp/mh

1,04- 1250

o.8

4-

^loooi

a

e~ ^o.s-

3 .750

0A-SO0

0J--X0

1 u

ù 5 10 IS 20 25 30 3i. 5 IO 1S 20 25 30 X

Fig. ^{8 Curve di} ripartizione dell'estratto

lipidico

della sola muscolatura diun anellide

(cfr. fig. 7).

^{A destra:} prima dell'effettuazione dell'acetilazione

riduttiva;

^{a sinistra:}

attività

del tritio dopo acetilazione riduttiva in parallelo ^conlacurvadi ripartizionedell'autentico diacetato della diidrovitamina

K^T?n,

^{n—x—x .}

22 e, dopo effettuata l'acetilazione

riduttiva,

^{di nuovo} sottoposte ^{a tale} tipo ^di

separazione.

^La fig. ⁸

raccoglie

^{le curve ottenute} prima ^e dopo ^{aver effettuata} l'acetilazione. Purtroppo dal suddetto diacetato non è stato ottenuto il solo mas¬

simo

corrispondente

alla vitamina K

2(20)

^e localizzato in corrispondenza ^della frazione

10,

^{ma ancora un altro in} corrispondenza della frazione 23. E'

proba¬

bile che il secondo massimo corrisponda ^{ad un} artefatto. Per

contro,

^{il massi¬}

mo

corrispondente

alla frazione 10

indica,

^{con alta}

probabilità,

^la presenza ^di vitamina

K„,2Qv.

^Sembra

^pertanto

^{acquisito che almeno in questi}

invertebrati,

abbia luogo la conversione del menadione in vitamina

K2,20>.

^Resta

^tuttavia,

^per

il

momento,

^ancora da chiarire quale ^ruolo

fisiologico

^{debba essere attribuito a}

tale inattesa attitudine da parte

degli

^anellidi.

PARTE SPERIMENTALE

A)

^{Sintesi dei} composti radioattivi

14 3

1. Vitamina K.. con C nella catena laterale fitilica e H nel gruppo metilico del nucleo naftochinonico

La sintesi del fillochinone marcato con tritio nel gruppo metilico del nu¬

cleo chinonico

(attività: _1,10-

¹⁰

Imp/min/pg)

^{e con C in posizione}

^1',

^2'

della catena laterale fitilica

(attività: 1,81

^{• 10}

Imp/min/ug),

^{è stata effettuata}

(1) secondo il metodo precedentemente ^descritto da Billeterx '.

2. Menadione marcato con H3 nel gruppo metilico del nucleo chinonico

Il menadione marcato con tritio nel gruppo metilico del nucleo chinonico

rità:

3•10Imp/min/ug)

è tesi del fillochinone

(v.

fig.

17) (attività:

3•10Imp/min/ug)

è stato isolato quale prodotto intermedio della sin-

CH3

1.

Zn, AC2O,

^Piridina

2. Br-succinimide

OAc

^ OAc

1 3

1.

H2

⁺

H2, ^Pd,

trietilamina 2.

LiAlH4

|

^3.

_Ag20

-, H

C-H'

Il

^'

H

H2'Pd

O

( H-Menadione)

^1.

BF3-Eterato

2.

Ag20

Li, NHg

^liq.

14 14 HC =CX*H

H2,

^Pd-Pb-Cat.

Chinolina

(Fillochinone)

Fig. ⁹ Rappresentazione schematica della sintesi del menadione e,

rispettiva¬

mente,

^del fillochinone radioattivi.

B)

^Derivati

1. Diacetati

I diacetati delle vitamine K ridotte sono stati ottenuti mediante breve riscal¬

damento della sostanza in anidride acetica con zinco in

polvere.

Successivamen¬

te la sostanza in esame è stata trattata con poca

piridina

^{e di nuovo} riscaldata per 15' circa su bagnomaria bollente. Dopo raffreddamento è stata ripresa con cicloesano e lavata quindi ^con acqua finché il pH

è

risultatoneutro. Aicomposti

radioattivi,

^{di solito}

presenti

ⁱⁿ

quantità _{minime, è}

stata aggiunta ^{della vitamina} inattiva

(1

mg

ca.).

^{Per la} determinazione quantitativa ^{dei diacetati si}

è

ricorso allo

spettro

^di assorbimento

(massimo

^{a 230}

mu).

^{D. derivato del fil¬}

lochinone rimane oleoso a temperatura ^ambiente

mentre,

^{da quello della}

vitamina

Kn/Zr,\

^{e stato}

possibile ottenere,

^{sebbene con}

difficoltà,

^{un diacetato}

cristallino

(da metanolo)

^{che fonde a 33 C.}

2. Riduzione con LiAIH,

I

prodotti

ottenuti dopo acetilazione riduttiva sono stati trattati con una solu¬

zione eterea di LiAlH. e una volta riossidati a chinoni mediante aggiunta ^di

Ag.O, sottoposti

^{ancora una volta a una}

separazione

controcorrente

nell'apparecchio

^di Craig allo scopo di riottenere le

originarie

^{curve di} distribuzione.

C)

Materiale da

esperimento

1. Uova fecondate di

gallina

Galline bianche di razza

Leghorn

^{e relative uova}

fecondate,

^{ci sono state} fornite dalla

pollicultura

Duttlinger

(Neftenbach/Zurigo).

2. Anatre

Sono state utilizzate anatre di circa un anno.

D) Applicazione

^{ed estrazione dei} composti marcati

1. Preparazione ^e

applicazione

nell'uovo della sospensione ^vitaminica

I composti ^{marcati sono stati}

portati

in soluzione mediante aggiunta ^{di un} tensioattivo

(Cremophor El-BASF),

^{alcool e} acqua distillata sterile. Per la loro

applicazione

^{nell'uovo è stato} praticato ^nel

guscio

^{un foro di 1 mm circa di dia¬}

metro,

previo

lavaggio

^con alcool della zona interessata. Usando quindi ^{una co¬}

mune siringa

(sterilizzatal )

^sono stati aspirati ^ca.

1,5

^{mi di albume} e, ^successi¬

vamente,

^è stata iniettata molto lentamente la sospensione

(sterile)

^{delle vitami¬}

ne attive per ^{mezzo di una} siringa per turbercoline

(v. fig. 17)

nell'albume dello uovo a una

profondità aggirantesi

^{tra i 5 e i 10 mm. Le uova cosi trattate sono}

state

incubate,

previa otturazione dei fori con

cementite,

^{in una}

piccola

^incuba¬

trice che peraltro è ^{in commercio.}

Fig. ^{10 Punto di} applicazione ^dei composti ^marcati

2.

Applicazione

per ^os della sospensione ^vitaminica

Secondo ilprocedimento

precedentemente descritto,

ⁱ composti ^{marcati sono} stati portati ⁱⁿ soluzione

(unica

^eccezione:

metilglicole

^{invece di}

etanolo)

^{e som¬}

ministrati,

goccia ^a

goccia,

per ^{os alle}

galline.

3.

Applicazione

^della sospensione vitaminica nel L. terrestris

I composti ^marcati portati in soluzione sono stati

iniettati,

^{mediante una} siringaper

tubercoline,

^{nel sacco} celomatico di questo ^anellide.

E)

Metodi analitici

1. Estrazione ^e separazione controcorrente

Gli organi ^ottenuti

dagli

^{animali uccisi sono stati trattati} nell'identico modo

già

descritto da Bill eter*'»*'. Gli estratti

lipidici

^ottenuti mediante estrazio¬

ne con

etere,

^{sono stati}

sottoposti

^{a una} separazione controcorrente

nell'apparec¬

chio di Craig

(sistema

^solvente:

eptano/metilglicole).

Le misurazioni della ra- dioattivita del tritio e del C14 nelle

singole frazioni,

^{sono state effettuate median¬}

te un "Packard Liquid

Scintillation-Spectrometer".

Tabella 1

Comportamento

^{di alcuni} composti sottoposti ^{a una}

separazione

^contro¬

corrente

nell'apparecchio

^di Craig. Sistema solvente:

eptano-metilgli-

cole. Massimo spostamento delle frazioni:

Sostanza F max.

Menadione 7

Fillochinone 24 ^- 25

Vitamina

K2(2Q)

Fillochinone diacetato

19 ^- 20

15

Vitamina

K2/20\

^diacetato

Fitolo

10 16

2,5-difeniloxazolo (PPO)

^{6 - 7}

2.

Cromatografia

^{su strato sottile}

La

cromatografia

^su strato sottile secondo

Stahl1

, si è rivelata un otti¬

mo metodo d'analisi per un'ulteriore conferma della natura dei composti previa¬

mente isolati mediante

separazione

controcorrente

(v.

^Tab.

1).

^In partico¬

lare essa si è resautile per ^la

separazione

^{delle vitamine}

K2

aventi catene la¬

terali insature di differente lunghezza. ^Nella maggior

parte

^dei

casi,

per

meglio

evidenziare la fluorescenza dei composti

insaturi,

^al

gel

^{di silicio è} stata aggiun¬

ta della fluoresceina. A causa della

irriproducibilità

^{dei valori del}

Rf,

^{sono state}

aggiunte

sostanze di riferimento _per evidenziare meglio ^la separazione. ^{Per le} misurazioni della

radioattività

incorporata ^nelle

macchie,

^{è stata} seguita ^{la se¬}

guente

procedura:

^la porzione ^di

gel

^{di silicio su cui era} localizzata la

macchia,

è stata cautamente

asportata,

^{versata in}flacconcini per la

conta,

^{eluita quindi}

con una soluzione di PPO in toluolo puro ^e la

radioattività

misurata allo

spettro¬

metro Packard.

3. Misurazione della

radioattività

Tutte le misurazioni della radioattività presente ^nelle sìngole ^{frazioni otte¬}

nute con

l'apparecchio

^di

Craig,

^sono state effettuate mediante l'uso di un Tri- Carb Liquid Scintillation Spectrometer della Packard Instrument Co. La Grange- Illinois, dopo che il residuo dell'evaporazione ^di ogni

singola

frazione contenuta in appositi^{flaconcini era stato} ripreso ^{con 5 mi di una} soluzione al 3

%

^di

2,

^5- difeniloxazolo

(PPO)

ⁱⁿ toluolo puro. Tutte le sostanze che assorbivano nell'am¬

bito delle onde

lunghe

dell'ultravioletto o nell'ambito delle onde corte del

visibile,

provocavano ^una diminuzione degli impulsi registrati ^dallo spettrometro

(in

inglese:

"quenching

effect").

Questa

interferenza,

allorché si è reso

necessario,

^{è stata} eliminata mediante

aggiunta

^{di uno} standard interno. Infatti l'effetto

"quenching"

à uguale

^al

rapporto

^{tra la}

radioattività

ulteriore che si riscontra dopo ^aver

aggiunto

^al campione ^{in esame una} determinata

quantità

^di standard radioattivo e la

quantità

^di standard radioattivo

aggiunta.

SOMMARIO

Nel presente ^lavoro

è

stato studiato il comportamento ^della vitamina K.

(o fillochinone)

ⁱⁿ organismi incontaminati da batteri. Allaluce dei risultati otte¬

nuti,

^{è emerso che il}

fillochinone,

^{allorché iniettato} nell'albume delle uova fecon¬

date di

gallina,

^è

trasformato,

dall'embrione in via di

sviluppo,

in vitamina

K.,„nv.

^{Ne deriva pertanto che la} trasformazione della vitamina K. in vitamina

K„/9f.v

^ha

^luogo,

^{nei suddetti}

^organismi,

^{anche senza il concorso della flora bat¬}

terica intestinale. Se tale tipo ^di trasformazione _possa avere

luogo

^{anche nello} organismo ^dei

mammiferi,

^non

può

^essere per ^ora escluso. Nel corso di ulte¬

riori

indagini,

^{è emerso} che nella stessa vitamina

K2/2Q>

^viene trasformato il menadione allorché iniettato nel sacco celomatico dell'anellide L. terrestris. Su quest'altra ^inattesa trasformazione manca ogni spiegazione che possa chiarire il ruolo fisiologico ^{esercitato dalla vitamina}

Kg/ooì

^{m *a^ organismi- Tali risulta¬}

ti

confermerebbero,

^{ancora una}

volta,

che il ruolo svolto dalle vitamine K e di ben

più complessa

natura che non una semplice ^{e diretta}

partecipazione

^alla

sintesi dei fattori che

regolano

^la

coagulazione

del sangue.

Leer Vide Empty

PARTE II

AZIONE DI ALCUNE SIDEROMICINE E SIDERAMINE SUL METABOLISMO DI

ALCUNI BATTERI E SULLA SINTESI IN VITRO DELL'EMINA

Leer Vide Empty

A)

Considerazioni

generali

^{su alcuni} rappresentanti del gruppo dei siderocromi

Come e stato precedentemente riportato da altri autori(12)_, tutte le sostan¬

ze naturali che contengono ^o che possono

legarsi

^{al ferro e il cui} assorbimento massimo è localizzato tra 420 e 440 mu, ^sono da considerarsi dei siderocromi.

Sotto tale gruppo, ^sebbenecon

proprietà

^{fra loro}

antagoniste,

vengono classificate siale sideramine che le sideromicine. Leprime,

infatti, rappresentano

^deifattoridi

crescita per ^numerosi microorganismi ^{e si} rinvengono, ^{anche se non} sempre ⁱⁿ rilevanti

quantità,

^{in molti} rappresentanti ^della

famiglia

^delle actinomicetaceae.

Di esse se ne conoscono diverse specie ^denominate

A, B, C, D., D„, E,

F e G. Caratteristica comune della loro molecola è la presenza ^{in essa} di un

complesso ^{del ferro con} l'acido trudrossamico. Le

sideromicine,

viceversa, pur contenendo ferro nella loro molecola e quantunque siano state isolate dagli ^actino-

miceti,

^sono da considerarsi come sostanze a carattere antibiotico

(fernmicma A,, A„, ^B;

gnsema,

albomicina).

^{Pertanto esercitano uno} spiccato

antagonismo

» (13)

verso le sideramine. In

più, è

stata notatav ^' in alcuni batteri

(B.

subtilis,

^B.

megatenum,

S. aureus

ecc.),

l'attitudine a trasformare le sideromi¬

cine aggiunte ^ai loro terreni culturali in sideramine ovverosia, ^a trasformare un

antimetabohta in un metabolita.

Nel corso degli esperimenti ^{che saranno} appresso

descritti,

^{abbiamo studia¬}

to l'azione delle seguenti ^{sideramine e} sideromicine su alcuni ceppi ^batterici.

Ferrioxamma B ^e desfernoxamma B dal gruppo delle sideramine

(=

^{fattori di}

crescita);

fernmicma A e albomicma dal gruppo delle sideromicine

(= antibiotici)

e

infine,

dai siderocromi ad azione biologica ^{non ancora}

nota,

^la ferricrisina.

1. Azione di alcune sideromicine sul B. subtilis e suil'E. coli

Come abbiamo

precedentemente riportato,

le sideromicine possono ^essere trasformate da diversi microorganismi ⁱⁿ sideramine. Sulla base delle ricerche effettuate da Bachmann &

Zahner,

sembrerebbe verosimile che la forma¬

zione delle sideramine abbia luogo ^{da una} diretta trasformazione delle sideromi¬

cine

(secondo

gli ^stessi AA. sarebbe da escludersi un'azione mducente da

parte

di

quest'ultime). Inoltre,

^sempre secondo essi, dalla ^natura del terreno culturale

usato,

dipenderebbe la resistenza riscontrata nel B. subtilis verso la fernmicma

A: resistenzanon genotipica che scompare usando terreni culturali di diversa natura. Premesso

ciò,

ci siamo chiesti se l'azione svolta dalle sideromicine si estrinsecasse solo sulla crescita batterica e con quale durata. A tale scopo, abbiamo ricercato l'effetto dell'inibizione prodotta ^mediante

aggiunta

di ferrimi- cina A

(o

di

albomicina)

^sullacrescita nonché sulla sintesi nucleica ^e proteica ^delle culture di B. subtilis e,

rispettivamente,

E. coli.

a)

^{Materiali e metodi}

Le curve che rappresentano l'andamento della

crescita,

^della sintesi nuclei¬

ca e proteica ^delle diverse culture

batteriche,

^sono state ottenute aggiungendo ^ai terreni culturali soluzioni di sideromicine diversamente concentrate.

a)

^{crescitabatterica:} determinazione turbidimetrica

b)

sintesi nucleica: determinazione dell'acido RN

secondo Schneider e dell'acido (17)

DN secondo Ceriotti ^' o lo stesso

cu * (18)

Schneider '.

e)

^sintesi proteica: determinazione secondo Folin-Ciocalteau.

Batteri: Bacillus subtilis

(ceppo

^{E. T. H.}

2016)

^e relativa sospensione ^di spore; Escherichia coli

(ceppo

^E.T.H.

2018);

^Bacillus megaterium

(ceppo

^E.T.H.

2053),

gentilmente fornitici dal Dott. Zahner dell'Istituto di Botanica Speciale dell'E.T.H.

Terreni culturali sintetici: v. tabella 2.

Misurazioni: le determinazioni turbidimetriche sono state effettuate median¬

te l'uso di un colorimetro

Eppendorf

^{a 546 mu azzerando su un} terreno culturale non

inoculato;

^la determinazione degli ^{acidi nucleici} mediante l'uso di uno

spettro¬

fotometro Zeiss a 490 mu per l'acido RN ^{e a} 660 mu e,

rispettivamente,

^{595 mu} per ^il

DNA;

^la determinazione della sintesi proteica mediante l'uso dello stesso

spettrofotometro

^{a 750 mu.}

Antibiotici: i preparati ^{usati nel corso di} queste

ricerche,

^{ci sono stati}

gentilmente

^forniti dall'industria farmaceutica Ciba di Basilea

(ferrimicina A,

ferrioxamìna

B)

^{e dal Dott. Zahner} dell'Istituto di Botanica Speciale ^{del Politec¬}

nico Federale di Zurigo

(desferrioxamina B, albomicina, ferricrisina).