1
Organizzazione della cromatina in cromosomi
Nucleo cromosoma
telomero centromero
telomero Cellula
Coppie di basi nucleosoma Doppia elica
di DNA
EUCARIOTI
Gli eucarioti contengono un numero variabile di cromosomi.
Ciascun cromosoma eucariotico contiene una sola
molecola di DNA lineare a doppio filamento
3
L ’ impacchettamento del DNA nel nucleo eucariotico è dinamico, cioè cambia durante il ciclo cellulare restando
sotto forma di cromatina durante tutta l ’ interfase per condensarsi ulteriormente durante la divisione cellulare
(mitotica o meiotica) a formare i cromosomi H. sapiens possiede un genoma di 3,4 x 10 9 bp
il nucleo eucariotico è di circa 2 µm
elevato livello di compattamento
Dimensioni dei cromosomi
30µM
Triturus cristatus
Homosapiens
Drosophila melanogaster
5
Muntiacus reevesi
Muntiacus muntjak
Dimensioni dei cromosomi: il Muntjac
♂ ,46,XY
♂ n=7
Fig 1. Metaphase spread displaying the diploid chromosomes (2n = 7) of Indian male muntjac (Muntiacus muntjak) deer.
Murali et al., Karyological studies on chromosomes of Barking Deer (Muntiacus muntjak). Zoos' Print Journal · May 2013
Fig 2. Karyotype of G-banded chromosomes of Indian male
muntjac (Muntiacus muntjak) deer.
♂ n=7
7
Lunghezza del cromosoma
sezione della cromatina 5 avvolgimenti della doppia elica
fibra di 30nm con i nucleosomi
strettamente impacchettati
parte di una sezione di cromosoma
sezione condensata di un cromosoma metafasico
cromosoma metafasico
2nm
11nm
30nm
300nm
700nm
1400nm
Gradi di impacchettamento della cromatina
Teoria Classica
9
fattore di impacchettamento = 6
Livello 1
11 A. Structure of nucleosomal histones.
B. Amino-terminal tails of core histones. The numbers indicate amino acid position.
The post-translational modifications are indicated
(red ac = acetylation sites ; blue p = phosphorylation sites ; green m = methylation sites ; purple rib = ADP ribosylation).
S: Serina; K: Lisina; E: Acido Glutammico
The core histones
UUU UUC F fenilal UCU UCC S serina UAU UAC Y tirosina UGU UGC C cisteina
UUA UUG L leucina UCA UCG S serina UAA UAG STOP UGA UGG STOP W triptof
CUU CUC L leucina CCU CCC P prolina CAU CAC H istidina CGU CGC R arginin
CUA CUG L leucina CCA CCG P prolina CAA CAG Q glutam CGA CGG R arginin
AUU AUC I isoleuc ACU ACC T treonina AAU AAC N
asparag
AGU AGC S serina
AUA AUG I isoleuc
M metion ACA ACG T treonina AAA AAG K lisina AGA AGG R arginin
GUU GUC V valina GCU GCC A alanina GAU GAC D Ac.
aspar
GGU GGC G glicina
GUA GUG V valina GCA GCG A alanina GAA GAG E Ac.
glutamm.
GGA GGG G glicina
U C A G U
C
A G
U C A G U C A G U C
E G
U C
A G
13
Il DNA cromosomico che si avvolge intorno agli istoni si può dividere in due regioni:
ü DNA core di lunghezza invariabile di 146 bp, relativamente resistente alla digestione da parte di nucleasi
ü DNA linker la cui lunghezza può variare da 8 bp a 114 bp in
maniera specie-specifica, tessuto-specifica o anche genoma-
specifica
Più del 90% del DNA è stato trovato in associazione
15
Istoni
Gli istoni subiscono modificazioni durante il ciclo cellulare, che sono:
➟ transienti,
➟ associate a cambiamenti strutturali della cromatina durante la replicazione e la trascrizione,
➟ associate anche al grado di condensazione della cromatina.
• Acetilazione
(Lys)• Metilazione
(Lys, Arg, His)• Fosforilazione
(Ser, Thr le più comuni, His e Asp le meno stabili)Livello 1
fattore di impacchettamento = 6
17
Livello 2
I nucleosomi si associano a formare una struttura più compatta del diametro di 30 nm visibile al microscopio
elettronico
(fattore di impacchettamento = 40)
Organizzazione del cromosoma
spiralizzati
parzialmente non spiralizzati
non spiralizzati nucleosoma
istoni
H4 H3
H2A H2B
DNA istone
H1
19
Organizzazione del cromosoma
Segmento di cromatina nucleosoma
proteine DNA-binding sequenza specifiche
30 nm
Livello 1
fattore di impacchettamento = 6 Livello 2
fattore di impacchettamento = 40
21
Livello 3
Il livello successivo di avvolgimento ➛ formazione di domini di DNA ad ansa simili a quelli osservati nei
cromosomi dei procarioti fattore di impacchettamento
eucromatina = 1000-2000
eterocromatina e cromatina interfasica = 10000
Livello 1
fattore di impacchettamento = 6
Livello 2
fattore di impacchettamento = 40
Livello 3
fattore di impacchettamento
eucromatina = 1000-2000
eterocromatina = 10000
23
Livello 4
Livello 1
fattore di impacchettamento = 6
Livello 2
fattore di impacchettamento = 40 Livello 3
fattore di impacchettamento eucromatina = 1000-2000 eterocromatina = 10000
Livello 4
Maeshima et al., Chromatin as dynamic 10-nm fibers. Chromosoma, 123(3):225-237, 2015. 10.1007/s00412-014-0460-2
Abstract
DNA is wrapped around core histones, forming a nucleosome fiber (10-nm fiber).
What is the structure of chromatin?
This fiber has long been assumed to fold into a 30-nm chromatin fiber and subsequently into helically folded larger fibers or radial loops.
➛ However, several recent studies, including our cryo-EM (microscopia elettronica a freddo) and X-ray scattering (diffrazione a raggi X) analyses, demonstrated that chromatin is composed of irregularly folded 10-nm fibers, without 30-nm chromatin fibers, in interphase chromatin and mitotic chromosomes.
➛ This irregular folding implies a chromatin state that is physically less constrained, which could be more dynamic compared with classical regular helical folding structures.
Consistent with this, recently, we uncovered by single nucleosome imaging large nucleosome fluctuations in living mammalian cells (∼50 nm/30 ms). Subsequent computational modeling suggested that nucleosome fluctuation increases chromatin accessibility, which is advantageous for many “target searching” biological processes such as transcriptional regulation.
This review provides a novel view on chromatin structure in which chromatin consists of dynamic and disordered 10-nm fibers.
cryo-EM: Microscopia elettronica a freddo X-ray scattering: diffrazione a raggi X
Maeshima et al., Chromatin as dynamic 10-nm fibers. Chromosoma, 123(3):225-237, 2015. 10.1007/s00412-014-0460-2
Fig. 1 Old and novel views of chromatin structure.
A long DNA molecule with a diameter of ∼2 nm is wrapped around a core histone octamer and forms a nucleosome with a diameter of 11 nm
(Alberts et al. 2007).
Si è a lungo supposto che il nucleosoma sia avvolto in fibre di cromatina di 30-nm (sinistra) e in una successiva organizzazione superiore nei nuclei interfasici o nei cromosomi mitotici.
The right panel shows the novel hypothesis of irregularly folded nucleosome fibers
Maeshima et al., Chromatin as dynamic 10-nm fibers. Chromosoma, 123(3):225-237, 2015. 10.1007/s00412-014-0460-2
Fig. 2 Two classical models of 30-nm chromatin fibers and higher order chromatin structures
a
One-start helix (solenoid),b
two-start helix (zigzag).(Top) A scheme of the two different topologies of chromatin fibers is shown (Robinson and Rhodes 2006).
Positions from the first (N1) to the eighth (N8) nucleosome are labeled.
c
Two classical higher order chromatin structure models:➛ the hierarchical helical folding model
(modello gerarchico di piegatura elicoidale) (Sedat and Manuelidis 1978) and
➛ the radial loop model (Laemmli et al. 1978).
modello ad ansa radiale
In the radial loop model, many loop structures of the 30-nm fiber (red) wrap around the scaffold structure (gray) (Laemmli et al. 1978), which consists of condensin and topoisomerase IIα (Maeshima and Laemmli 2003)
Maeshima et al., Chromatin as dynamic 10-nm fibers. Chromosoma, 123(3):225-237, 2015. 10.1007/s00412-014-0460-2
a Experimental design.
The chromosome pellet in a quartz capillary tube was exposed to synchrotron X-ray beams (fasci), and the scattering patterns were
recorded using the imaging plate.
b When non-crystal materials were irradiated with X-rays, scattering at small angles
generally reflected periodic structures.
(Images a and b were reproduced from Joti et al. 2012, with some modifications).
c (Upper left) Typical SAXS patterns of
purified mitotic HeLa chromosome fractions.
Three peaks at ∼6, ∼11 (weak), and ∼30 nm were detected (arrows).
(Upper right) After the removal of ribosome aggregates, the 30-nm peak disappeared, whereas the other peaks remained.
(Bottom) A model whereby the 30-nm peak in SAXS results from regularly spaced
Fig. 3 Small angle X-ray scattering (SAXS) analysis of chromatin structure.
(Analisi di diffrazione a raggi X a piccola angolazione della struttura della cromatina.)
Maeshima et al., Chromatin as dynamic 10-nm fibers. Chromosoma, 123(3):225-237, 2015. 10.1007/s00412-014-0460-2
a
in condizioni di bassa salinità, le fibre del nucleosoma potrebbero formare fibre cromatiniche di 30-nm via associazioni intra-fiber dei nucleosomi.Un aumento nella concentrazione salina [cation (+)]
“risulta” in contatti nucleosomici inter-fiber che interferiscono con le associazioni nucleosomiche intra-fiber, portando ad uno “scenario di fusione del polimero”.
Note that in these illustrations, we show a highly simplified two-dimensional nucleosome model.
Le frecce e le linee tratteggiate mostrano, rispettivamente, le forze di repulsione e di interazione.
b
Durante il processo di fusione (melting), le fibre di cromatina a 30-nm diventano fibre di cromatina irregolarmente avvolte.Fig. 4 Polymer melt model.
low-salt
Maeshima et al., Chromatin as dynamic 10-nm fibers. Chromosoma, 123(3):225-237, 2015. 10.1007/s00412-014-0460-2
a
Condensed chromatin domains.Le regioni di cromatina attiva sono trascritte sulla superficie di domini cromatinici con complessi trascrizionali (sfere viola) e RNA polymerase II (sfere verdi).
NPC: Nuclear Pore Complex, NE: Nuclear Envelope.
b (Left)
Condensed chromatin is more resistant to radiation damage or chemical attack.(Right)
Reactive radicals arising from the radiolysis of water molecules by irradiation can damage decondensed chromatin;decondensed chromatin is also more accessible to chemicals (labeled “Ch”)
Fig. 5 Higher order structure of interphase chromatin.
Maeshima et al., Chromatin as dynamic 10-nm fibers. Chromosoma, 123(3):225-237, 2015. 10.1007/s00412-014-0460-2
Conclusions
The traditional view of chromatin sta cambiando da una statica struttura regolare che include le fibre di cromatina a 30-nm ad una struttura dinamica irregolarmente avvolta.
Sebbene il termine “irregolare” o “disordinato” possano dare l’impressione che l’organizzazione sia funzionalmente irrilevante, l’avvolgimento (folding) irregolare resulta in un minore vincolo (constraint) fisico ad un aumentato dinamismo, aumentando l’accessibilità del DNA.
Questo stato dinamico può essere essenziale per varie funzioni genomiche, che includono la trascrizione, replicazione e il
riparo/ricombinazione del DNA.
Gibcus et al., A pathway for mitotic chromosome formation. Science, 359(6376):eaao6135, February 9, 2018. DOI: 10.1126/science.aao6135
Tracking mitotic chromosome formation
How cells pack DNA into fully compact, rod-shaped (a forma di
bastoncello) chromosomes during mitosis has fascinated cell biologists for more than a century.
Gibcus et al.(2018) delineated the conformational transition trajectory from interphase chromatin to mitotic chromosomes minute by minute during the cell cycle.
Il cromosoma mitotico è organizzato in un’architettura di scala a spirale in cui le anse di cromatina escono radialmente da un’impalatura centralmente localizzata. In questo lavoro vengono integrati approcci genetici, genomici e computazionali per caratterizzare gli step chiave nella formazione del cromosoma mitotico dal nucleo in G2 alla metafase, e sono stati
identificati i ruoli di specifiche “macchine” molecolari, condensina I and II, in queste principali transizioni conformazionali.
The molecular machines condensin I and II play distinct roles in these
Gibcus et al., A pathway for mitotic chromosome formation. Science, 359(6376):eaao6135, February 9, 2018. DOI: 10.1126/science.aao6135
CONCLUSION
Si descrive un pathway of mitotic chromosome folding that unifies many previous observations.
In prophase, condensins mediate the loss of interphase organization and the formation of arrays of consecutive loops.
In prometaphase, i cromosomi adottano una struttura a forma di scala a spirale con un’impalcatura assiale disposta elicoidalmente con la
condensina II alla base dell’ansa cromatinica.
Le anse di condensina II sono ulteriormente compattate dalla condensina I in cluster di anse più piccole “nested” che sono ulteriormente “collassate” da attrazioni cromatina-cromatina.
La combinazione di anse “nested” distribuite attorno ad un asse girato ad elica “impacca” più densamente la cromatina che arriva ad una
compattazione di 10.000 volte la cromatina che viene organizzata in
cromosomi lineari, richiesti per un’accurata segregazione quando la
cellula si divide.
A pathway for mitotic chromosome formation.
Gibcus et al., A pathway for mitotic chromosome formation. Science, 359(6376):eaao6135, February 9, 2018. DOI: 10.1126/science.aao6135
In profase, la condensina media la perdita della conformazione del
cromosoma interfasico, e si formano gli array loop (serie di anse).
In prometafase, l’azione combinata della condensina I (sfere blu nel diagramma in basso) e condensina II (sfere rosse) ha come risultato una serie di pluri- anse disposte in modo elicoidale.
CTCF: fattore di trascrizione coinvolto nella regolazione della trascrizione,
Thattikota et al., Cdc48/VCP Promotes Chromosome Morphogenesis by Releasing Condensin from Self-Entrapment in Chromatin. Molecular Cell 69, 664–676, February 15, 2018. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.01.030.
Highlights
• The condensin complex is the main effector of chromosome condensation in mitosis
• Chromatin accessibility is
reduced when chromosomes are compacted by condensin
• The Cdc48/VCP segregase stimulates condensin release from compacted chromatin
• Condensin must maintain high mobility on mitotic chromatin to promote condensation
In Brief
Durante la mitosi, la cromatina si riorganizza in una più compatta e meno accessibile configurazione.
Gli autori mostrano che l'effettore principale del processo di compattazione, la condensina, richiede una "attività segregasica" speciale per transitare in modo efficace nella cromatina mitotica.
General steps in chromatin assembly
➛ Assembly begins with the incorporation of the H3/H4 tetramer (1),
➛ followed by the addition of two H2A-H2B dimers (2) to form a core particle. The newly synthesized histones utilized are specifically modified; typically, histone H4 is acetylated at Lys5 and Lys12 (H3-H4*).
➛ Maturation requires ATP to establish a regular spacing, and histones are de-acetylated (3).
➛ The incorporation of linker histones is accompanied by folding of the nucleofilament. Here the model presents a solenoid structure in which there are six nucleosomes per gyre (4).
➛ Further folding events lead ultimately to a defined domain organization within the nucleus (5).
Eagen et al., Stable Chromosome Condensation Revealed by Chromosome Conformation Capture. Cell, 163(4): 934-946, 2015.
doi:10.1016/j.cell.2015.10.026
Highlights
• Hi-C of polytene chromosomes reveals an equivalence of polytene bands with TADs (Topologically Associating Domains)
• TADs are conserved between polytene and diploid cells
• Fully extended and up to 10-fold
compacted fibers constitute euchromatin
• Up to 30-fold compacted fibers represent heterochromatin of the nuclear periphery
In Brief
L’analisi delle bande politeniche, che corrispondono a domini topologicamente associati nei nuclei interfasici, rivelano due forme stabili di cromatina ripiegata (folded) nelle regioni eucromatiche delle cellule diploidi che sono distinte dalla eterocromatina più altamente
strutturata.
Hi-C, an extension of 3C (Chromosome Conformation Capture) che sonda l’architettura tridimensionale di genomi interi
Eagen et al., Stable Chromosome Condensation Revealed by Chromosome Conformation Capture. Cell, 163(4): 934-946, 2015.
doi:10.1016/j.cell.2015.10.026
SUMMARY
Cross-linking chimico e sequenziamento del DNA hanno rivelato regioni
di interazione intra-cromosomica, Topologically Associating Domains (TADs), intersperse con regioni con poca o nessuna interazione, in nuclei interfasici.
TADs e le regioni tra di loro corrispondono alle bande e interbande dei cromosomi politenici di Drosophila.
Viene stabilita anche la conservazione delle TADs tra politeni e cellule diploidi in Drosophila.
Two states of folding,
➛ fibre completamente estese contengono regioni regolative e promotori,
and
➛ fibre condensate fino a 10-volte contengono regioni codificanti di geni attivi, che costituiscono l’eucromatina del nucleo interno.
✔ le fibre di cromatina condensate fino a 30-volte, contengono regioni
codificanti di geni inattivi, e rappresentano l’eterocromatina alla
Eagen et al., Stable Chromosome Condensation Revealed by Chromosome Conformation Capture. Cell, 163(4): 934-946, 2015.
doi:10.1016/j.cell.2015.10.026
Figure 7. Chromosome Condensation in the Interphase Nucleus
Left: thin section electron micrograph of a nucleus (Cross and Mercer, 1993), with lightly staining euchromatin in the nuclear interior, surrounded by darkly staining heterochromatin, concentrated at the nuclear periphery.
Right: cartoon representation of white, gray, and black chromatin, showing proposed relationships to
heterochromatin, euchromatin, and the nuclear envelope (yellow).
Active TADs in the euchromatin are nearby other active TADs and inactive TADs in the heterochromatin are
nearby other inactive TADs, resulting in gray-gray and black-black TAD-TAD interactions.
The actual pattern of chromatin folding is unknown and indicated only schematically.
Topologically Associating Domains (TADs)
Eagen et al., Stable Chromosome Condensation Revealed by Chromosome Conformation Capture. Cell, 163(4): 934-946, 2015.
doi:10.1016/j.cell.2015.10.026
The organization of the interphase nucleus in Drosophila is relevant to the mouse and to humans, where TADs organize chromosomes into spatial modules connected by short chromatin segments (Dixon et al., 2012).
Furthermore, biochemical fractionation of open chromatin fibers from human cells revealed that the fibers are cytologically
decondensed (Gilbert et al., 2004), and it is now apparent that these fibers are likely in the fully extended state.
The packing ratios, DNA sequences, functional states, and
chromosomal protein patterns of the differentially staining areas of the interphase nucleus are thus determined.
Genome-wide amplification and alignment in the polytene state reveals interphase chromosome structure at the level of light microscopy, likely applicable to the diploid state in all monocentric
41
