37 CAPITOLO 6
DESCRIZIONE DEI PROTOCOLLI SPERIMENTALI IN VIVO E IN VITRO.
6.1 SPERIMENTAZIONE IN VIVO
Specie animale
Lo sperimentazione in vivo descritta nella sessione I e III è stata condotta su ratti maschi wistar di 2-3 mesi di età (peso corporeo iniziale 250±20gr), nutriti con dieta standard e libero accesso all’acqua di fonte, mantenuti a temperatura ed umidità costante.
Ischemia e riperfusione
Tutti i ratti sono stati sottoposti a nefrectomia destra sotto anestesia con Clorario Idrato (Clorario idrato 8.5%, 350µl/100gr intraperitoneale) [Goodman and Gilman, 1997] suddivisi in ordine random in diversi gruppi sperimentali.
Dopo 7 giorni, i ratti sono preparati per il protocollo sperimentale e sottoposti ad intervento chirurgico per l’induzione di ischemia renale sinistra; un gruppo di animali è stato utilizzato come controllo a sharm-operated. In tutti i ratti resi ischemici, l’induzione dell’IRI era identica.
In breve, dopo anestesia con Clorario Idrato 8.5%, 350µl/100gr i.p., la parete muscolare anteriore dell’addome è stata incisa e, dopo attento isolamento del peduncolo vascolare, l’arteria renale clampata per 40 minuti. Al termine del periodo di ischemia, la clamp veniva rimossa e si accertava macroscopicamente la riperfusione della superficie renale prima della chiusura della parte addominale. Nei ratti sottoposti a sharm-operation, l’arteria renale era isolata in modo analogo ma non clampata. Alla fine dell’intervento chirurgico i ratti venivano suturati, alloggiati in gabbie da metabolismo e sacrificati il giorno successivo (dopo 24h).
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Prima del sacrificio veniva operato il prelievo ematico e al momento del sacrificio gli animali venivano perfusi con una soluzione di PBS ed EDTA 0.2M (1:100).
Al momento dell’espianto, il rene è stato diviso in due metà: una parte posta in Paraformaldeide al 4% per i preparati istologici, l’altra metà per l’analisi con il Western Blot.
6.1.1 SESSIONE I
Studio Acuto
Per la fase acuta dell’esperimento i ratti venivano suddivisi in ordine random in 4 gruppi sperimentali:
Gruppo I/R: ratti sottoposti ad ischemia-riperfusione non trattati con resveratrolo (n=24), suddivisi ulteriormente a seconda del tempo di riperfusione dopo la fase ischemica in:
0’ riperfusione (I/R) (n=6); 5’ riperfusione (I/R 5’) (n=6); 90’ riperfusione (I/R 90’) (n=6); 24h riperfusione (I/R 24h) (n=6).
Gruppo RSV: ratti (n=30) trattati con resveratrolo sono stati suddivisi in base al tempo intercorso tra l’iniezione del RSV e il sacrificio in:
RSV 30’(sacrificati dopo 30’ dalla somministrazione) (n=6); RSV 60’ (sacrificati dopo 60’ dalla somministrazione) (n=6); RSV TI (sacrificati dopo 60’+40’ dalla somministraione) (n=6);
RSV TI + 90’ (sacrificati dopo 60’+40’+90’ dalla somministraione) (n=6); RSV TI + 24h (sacrificati dopo 60’+40’+24h dalla somministrazione) (n=6).
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Gruppo RSV + I/R: ratti pre-trattati con RSV 1h prima dell’induzione dell’IRI (n=24) e suddivisi ulteriormente a seconda del tempo di riperfusione nei seguenti gruppi:
RSV + I/R (sacrificati al termine della fase ischemica) (n = 6); RSV + I/R 5’ (sacrificati dopo 5’ di riperfusione) (n = 6); RSV + I/R 90’ (sacrificati dopo 90’ di riperfusione) (n = 6); RSV + I/R 24h (sacrificati dopo 24h di riperfusione) (n = 6).
Gruppo Cont: ratti ugualmente nefrectomizzati, sottoposti a sharm-operation senza IRI ed utilizzati come gruppo controllo (n=6).
Gli animali dei gruppi RSV e RSV+I/R sono stati trattati con RSV 10µM (100µl/100gr peso corporeo) somministrato per via endovenosa con un’unica iniezione a livello della vena femorale.
6.1.2 SESSIONE III
Studio Pilota
Per lo studio pilota, condotto per decidere quale via di somministrazione utilizzare per il trattamento di RSV sub-acuto di 15 giorni su animali, è stato utilizzato un numero di animali ridotto (n=9) e così suddiviso. Per la scelta delle dosi di RSV da somministrare sono stati considerati i dati degli studi di farmacocinetica su ratto.
Gruppo Cont: animali non trattati con RSV (n=3).
Gruppo RSV P.OS.: animali trattati per 15 giorni con RSV (1ml di RSV 323µM, in acqua per soluzioni iniettabili e EtOH 0,2%) somministrato per via orale una volta al giorno (n=3).
Gruppo RSV I.P. : ratti trattati una volta al giorno con RSV (300µl di RSV 10µM, in acqua per soluzioni iniettabili e EtOH 0,2%) somministrato per via intraperitoneale per 15 giorni (n=3).
40 Studio Sub-Acuto
Per la fase sub-acuta dell’esperimento i ratti venivano suddivisi in ordine random in 4 gruppi sperimentali:
Gruppo I/R: ratti sottoposti ad ischemia-riperfusione non trattati con resveratrolo (n = 6);
Gruppo RSV I.P: ratti trattati con RSV (300µl di RSV 10µM al giorno, in acqua per soluzioni iniettabili e EtOH 0,2%, somministrato per via intraperitoneale) per 15 giorni (n = 6)
Gruppo RSV I.P + I/R: ratti pre-trattati con RSV (300µl di RSV 10µM al giorno, in acqua per soluzioni iniettabili e EtOH 0,2%, somministrato per via intraperitoneale) per 15 giorni prima dell’induzione dell’IRI (n = 6);
Gruppo Cont.: ratti ugualmente nefrectomizzati, sottoposti a sharm-operation senza IRI ed utilizzati come gruppo controllo (n=6).
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6.2 PROTOCOLLO SPERIMENTAZIONE IN VITRO
6.2.1 SESSIONE II
La sperimentazione in vitro si è concentrata sulla valutazione dell’espressione di SIRT-1 e del fattore di trascrizione HIF2α, oltre allo studio della modulazione di alcuni segnali molecolari rapidi (ERK 1/2, AKT, AMPK). Questi parametri molecolari sono infatti coinvolti nella protezione dal danno ossidativo e radicalico successivo all’insulto ischemico. Inoltre è stata osservata la risposta allo stimolo di tipo ossidativo indotto dal perossido di idrogeno dopo incubazione con il fenolo analizzato (Resveratrolo) .
Infine sono stati utilizzati specifici inibitori per i due principali segnali da noi investigati, ERK 1/2 e AMPK, al fine di fare luce sul loro reale coinvolgimento nella modulazione dell’espressione di SIRT1.
La sperimentazione in vitro è stata condotta su una linea di cellule immortalizzate di tubulo prossimale renale umano (HK-2), gentilmente donate dal Prof. G. Camussi, mantenute in RPMI 1640 con soluzione di Streptomicina-Penicellina (1:100) e FBS 10% in condizioni standard (37°C con CO2 al 5% e umidità al 95%).
Gli esperimenti sono stati condotti nella fase di crescita log e le cellule sono state piastrate in piastre multi pozzetto 24h prima di qualsiasi trattamento e tenute in mezzo di coltura con FCS 3% qualche ora prima di procedere con il protocollo sperimentale.
42 6.2.1.1 FASE SPERIMENTALE I
Nella prima fase sperimentale, le cellule sono state incubate 24h con Resveratrolo (RSV) alla concentrazione finale di 200nM. Al termine dell’incubazione le cellule sono state lisate e l’espressione di SIRT1 e HIF2α effettuata tramite Western Blot.
Per quanto riguarda i segnali molecolari rapidi (ERK 1/2, AKT, AMPK), le cellule sono state invece incubate con il RSV e lisate dopo 30’(min.), 90’ e 120’.
43 6.2.1.2 FASE SPERIMENTALE II
Per riprodurre gli effetti sulle cellule tubulari della fase di riperfusione, caratterizzata da un danno di tipo ossidativo, le cellule sono state trattate con H2O2.
E’ stato necessario determinare quali concentrazione e tempo di incubazione fossero in grado di indurre un danno tale da valutare la possibile protezione da parte del RSV: le cellule, sono state pertanto incubate con differenti concentrazioni di H2O2 e a diversi tempi di incubazione. In particolare è stato utilizzato H2O2 alle concentrazioni 0,1mM, 0,3mM e 0,5mM e 2h, 5h, 18h come tempi di incubazione.
Il danno è stato valutato mediante il test di vitalità del Trypan Blue dopo 24h dall’aggiunta dello stimolo.
Una volta scelta la concentrazione e il tempo di incubazione del H2O2 da utilizzare (300M di H2O2 per 2h), è stata valutata la protezione da parte del RSV nei confronti di tale danno, allestendo un nuovo protocollo sperimentale.
Le cellule sono state suddivise nei seguenti gruppi sperimentali:
- Cont Cellule lasciate nel mezzo di coltura senza aggiunta di alcuno stimolo.
- RSV Cellule a cui è stato aggiunto nel mezzo RSV alla concentrazione finale di 200 nM ed incubate per 24h.
- H2O2 Cellule a cui è stato aggiunto H2O2 0,3 mM per 2h.
- RSV+H2O2 Cellule incubate con RSV 200 nM per 24h e poi sottoposte a stimolo ossidativo per 2h con H2O2 0,3 mM
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La protezione dal danno è stata valutata mediante i seguenti Test:
- Test di citotossicità del Trypan Blue dopo 24h dall’aggiunta dello stimolo ossidante ed espressa come % di cellule morte.
- Test di citotossicità CitoTox Fluor (Promega) dopo 22h dalla fine dello stimolo ossidante ed espressa come % di cellule morte.
45 6.2.1.3 FASE SPERIMENTALE III
Per valutare il reale coinvolgimento di ERK 1/2 e AMPK nella modulazione dell’espressione di SIRT1, le cellule sono state incubate con l’inbitore di ERK ½ (PD98059, Enzo life Sciences) alla concentrazione di 100 µM per 60’ o con l’inibitore dell’AMPK (Coumpound C Enzo life Sciences) alla concentrazione di 10 µM per 30’ prima dell’aggiunta del RSV.
Il RSV è stato diluito fino alla concentrazione finale di 200 nM nel pozzetto e le cellule incubate per 24h.
Le cellule sono state suddivise nei seguenti gruppi sperimentali:
- Cont Cellule mantenute nel mezzo di coltura senza alcun trattamento. - RSV Cellule incubate con RSV 200 nM per 24h.
- ERKi Cellule incubate con PD98059 100 µM.
- ERKi+RSV Cellule a cui è stato aggiunto nel mezzo PD98059 alla concentrazione finale
di 100 µM 60’ prima dell’aggiunta del RSV 200 nM.
- AMPKi Cellule incubate con Coumpound C 10 µM.
- AMPKi+RSV Cellule a cui è stato aggiunto nel mezzo Coumpound C 10 µM 30’ prima dell’aggiunta del RSV 200 nM.
46 6.2.1.4 FASE SPERIMENTALE IV
Per avere conferma che il modello sperimentale in vitro scelto potesse essere paragonabile alla fase di riperfusione in vivo è stato anche valutato l’andamento dei segnali molecolari rapidi indagati precedentemente nella prima fase sperimentale in vivo, allestendo così un’ultima fase sperimentale. Le cellule sono state messe ad incubare con H2O2 0,3 mM e lisate a tempistiche diverse a seconda del gruppo sperimentale:
- Cont Cellule non trattate;
- H2O2 5’ cellule trattate con H2O2 per 5’;
- H2O2 30’ cellule lisate dopo 30’ dall’aggiunta di H2O2;
- H2O2 90’ cellule lisate dopo 90’ di incubazione con H2O2;
- H2O2 2h+2h cellule incubate con H2O2 per 2h e lisate dopo 2h di incubazione con solo terreno.
Le cellule dei vari gruppi sperimentali vengono lisate e il pool cellulare utilizzato per l’indagine molecolare.
47 CAPITOLO 7
METODICHE UTILIZZATE
7.1 VALUTAZIONE ISTOPATOLOGICA DEL TESSUTO RENALE
Sezioni istologiche di reni sono state allestite e colorate con colorazione Ematossilina-Eosina per valutare l’aspetto morfologico renale e quindi un possibile danno.
7.1.1 COLORAZIONE EMATOSSILINA-EOSINA
Il campione di parenchima renale ottenuto alla fine dell’esperimento era immediatamente fissato in parafolmaldeide al 4% per 24h, e processato per l’inclusione in paraffina.
Il protocollo di inclusione ha previsto l’immersione dei campioni in soluzioni di alcool etilico a concentrazioni progressivamente crescenti al fine di permettere la disidratazione del tessuto. Infine è stato effettuato un passaggio in xilolo per favorire la successiva penetrazione della paraffina. Sezioni di 3μm erano de-paraffinati in xilene, reidratati in alcool e colorate con Ematossilina-Eosina per valutare l’aspetto morfologico della porzione cortico-midollare e midollare del rene in seguito all’insulto ischemico e la successiva riperfusione, nonché l’effetto del Resveratrolo nella protezione da tale danno. Questo tipo di colorazione utilizza due coloranti specifici, uno per il compartimento nucleare (Ematossilina, che colora i nuclei in porpora cupo) e l’altro per il compartimento citoplasmatico (Eosina, che colora il citoplasma in rosa).
Le sezioni di tessuto sono state colorate seguendo i tempi riportati nel seguente protocollo:
1. XILOLO 25 min
48 3. ALCOOL 95° ( passare )
I passaggi in alcool servono per disidratare le fette. 4. H2O ( lavare )
5. EMATOSSILINA 15 min 6. H2O ( lavare )
7. ACQUA DI FONTE 20 min 8. H2O ( lavare )
9. EOSINA ORANGE ( 40-60 sec. ) 10. H2O ( lavare )
11. ALCOOL 95° ( passare )
12. ALCOOL ASSOLUTO ( passare ) 13. XILOLO
I vetrini una volta chiusi con ENTELLAN ( collante per fissare il vetrino coprioggetto ), sono stati poi osservati ad un microscopio ottico collegato ad una fotocamera per acquisizione delle immagini.
49 7.2 IMMUNOISTOCHIMICA
I campioni di parenchima renale fissati in paraffina e tagliati in sezioni di 3 μm, sono stati de-paraffinati in xilene e reidratati in alcool, quindi immersi in una soluzione di H2O2 al 3% in Metanolo per 15 min (1 parte di H2O2 al 30% e 9 di Metanolo) per permettere il blocco della perossidasi endogena. Successivamente sono stati immersi in una soluzione contenente citrato di sodio 0,01M e sottoposti a irradiazione con microonde per consentire la digestione delle nucleasi e rendere gli acidi nucleici accessibili ai nucleotidi marcati. Dopo irradiazione, le fettine sono state accuratamente lavate in PBS (Ph 7.4) per 10 minuti, quindi è stata aggiunta una soluzione contenente albumina sierica di bovino (fase di bloccaggio legami aspecifici), ed infine è stata fatta la permeabilizzazione con Triton-X 0,1% in PBS (5 min a 4°C), data la localizzazione anche citoplasmatica della proteina di nostro interesse. È stato infine aggiunto l’anticorpo SIRT-1 diluito 1:100 (LifeSpan, USA) e lasciato ad incubare per tutta la notte a 4°C in camera umida.
Dopo l’incubazione, le sezioni sono state:
- lavate in PBS per 15 min,
- aggiunto il polimero (Histofine Simple Stain MaxPo) e lasciato incubare per 30 min,
- lavate in PBS per 15 min,
- aggiunto il cromogeno DAB per 4 min,
Con l’aggiunta del cromogeno si ha la formazione di un precipitato di colore marrone a livello del sito di reazione, che mette in mostra la localizzazione dell’antigene.
Le sezioni, lavate in acqua distillata, sono state controcolorate con l’aggiunta di 100 µl di ematossilina (2 min), lavate poi ancora con acqua corrente e con PBS fino a che non si assiste al viraggio al blu (circa 30 sec.). Successivamente venivano lavate nuovamente in acqua, effettuati i
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passaggi di disidratazione (Alcol 85°- 90°- 95°- Assoluto- Xilolo) e i vetrini chiusi con il coprioggetti mediante l’aggiunta di una goccia del montante ENTELLAN.
I vetrini sono stati poi osservati ad un microscopio ottico collegato ad una fotocamera per acquisizione delle immagini.
51 7.3 METODI ANALITICI
Le concentrazioni della creatinina nel plasma e nei campioni urinari erano determinati mediante dei Kit commerciali (DetectX: Urinary Creatinine e Plasma Creatinine, Arbor Assay); la concentrazione delle proteine urinarie era valutata mediante un kit commerciale (Breadford Reagent, Sigma). Il volume urinario veniva misurato usando un cilindro graduato.
7.3.1 Stima della della concentrazione proteica (Dosaggio Proteinuria)
Sono stati utilizzati campioni di urine per poter calcolare la concentrazione delle proteine. Per stimare la concentrazione delle proteine in soluzione si adopera il saggio di Bradford, che prevede l’utilizzo del colorante Coomassie Brillant Blue, in grado di legarsi ai residui basici delle proteine; tuttavia, poiché il contenuto di aminoacidi basici varia a seconda della proteina, questo metodo fornisce solo una misura relativa della concentrazione proteica. Il reattivo di Bradford è un composto acquoso di Blue di Coomassie allo 0.01%, etanolo al 4.7% e acido fosforico all’8.5%, diluito 1:5. Per calcolare la concentrazione proteica è necessario costruire una retta di taratura che esprima l’assorbanza a 595nm in funzione della concentrazione di una proteina nota, l’albumina di siero bovino (BSA) [Protein standard (BSA) solution (1mg/ml), Sigma]: la curva standard viene costruita con concentrazioni decrescenti (comprese tra 1 e 0 μg/μl) di BSA. Aggiunto il reattivo di Bradford (Bradford reagent, Sigma) e trascorsi 5 minuti a temperatura ambiente (necessari per dare il tempo al colorante di legarsi alla proteina) si registra l’assorbanza e si riporta in grafico. La retta di taratura, così ottenuta, viene utilizzata per interpolare la concentrazione proteica di un pool proteico incognito; quest’ultimo viene sottoposto allo stesso trattamento e diluito in modo che la sua assorbanza cada nell’intervallo della retta di taratura. Nel nostro caso sono stati caricati 5μl di campione (diluito 1:6 per il rene e puro per le urine) nei pozzetti. Dopo l’aggiunta di 250 μl di colorante (volume totale nel pozzetto: 250μl) si attende il viraggio del colorante dal bruno al blue e
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poi si legge la piastra; grazie alla retta di taratura è possibile attribuire ad ogni valore di assorbanza un valore di concentrazione espresso in μg/μl.
7.3.2 Dosaggio della Creatinina Plasmatica
La creatinina si forma per conversione della creatina e fosfocreatina. La quantità di creatinina che si forma giornalmente nell'organismo è proporzionale alla quantità di creatina, che a sua volta è funzione della massa muscolare totale. La creatinina è liberamente filtrata dai glomeruli renali, ma non riassorbita dai tubuli. Una piccola quantità di creatinina è aggiunta alle urine da un processo di secrezione tubulare che aumenta con l'aumentare della concentrazione plasmatica. La stretta relazione tra la velocità di filtrazione glomerulare e la creatinina plasmatica, rendono la creatinina un eccellente indice di funzionalità renale.
La creatinina era valutata mediante dei kit commerciali (DetectX, Arbor Assay) che sfruttano la reazione di Jaffè con deproteinizzazione (picrato alcalino). Il picrato di sodio, in ambiente alcalino, reagisce con la creatinina dando luogo alla formazione di un complesso che assume colorazione rosso arancio (reazione di Jaffè).
53 7.4 IMMUNOBLOTTING SUL TESSUTO RENALE
7.4.1 Omogenizzazione del tessuto
Il tessuto renale prelevato e congelato in isopentano al momento del sacrificio, veniva scongelato, lavato ed omogeneizzato in potter con pestello in Teflon (Potter, B.Broun - Germania) con 3ml di un tampone di lisi contenente gli inibitori delle proteasi:
- PEPSTATINA (1 mM) 3 µl - LEUCOPEPTINA (1 mM) 6 µl - APROTININA (1mg/ml) 6 µl
- PMSF (1 mM) 10 µl
e gli inibitori della fosfatasi:
- Sodio Ortovanadato (1mM): 30 µl - Sodio Pirofosfato (10mM): 300 µl - Sodio Fluoruro (20mM): 120 µl
Ogni campione veniva vortexato per 2 min. dopo l’omogenizzazione e 2 min. prima della centrifugazione e messo successivamente in ghiaccio per evitare la denaturazione delle proteine. I campioni di tessuto renale venivano centrifugati a 13000rpm a 4°C per 15 minuti. Successivamente,veniva recuperato il sovranatante e dosato il contenuto delle proteine (Bredford).
Composizione del Buffer di omogeneizzazione: 100 ml del buffer contengono:
100 μl di NP-40
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- 37,2 mg di EDTA - 605,5 mg di TRIS
- 10 ml di GLICEROLO
Si porta a volume con H2O e si tampona a pH 7,5.
7.4.2 Analisi Western Blot
Sottoponendo l’estratto di proteine citoplasmatiche ad una migrazione elettroforetica si può ottenere la separazione delle singole proteine in base alla loro carica o al loro peso molecolare.
Operando su un gel di acrilamide / bis-acrilamide in condizioni denaturanti, le proteine assumeranno tutte una uguale carica negativa e si separeranno esclusivamente in base al loro peso molecolare.
L’acrilamide e la bis-acrilamide in presenza di attivatori e catalizzatori polimerizzano, formando un reticolo tridimensionale in cui correranno le proteine. Generalmente le concentrazioni di acrilamide utilizzate per il gel di separazione sono comprese tra il 5% e il 20%:
proteine 200 kDa - 70 kDa gel al 6-8% proteine 80 kDa - 50 kDa gel al 8-10% proteine 45 kDa - 20 kDa gel al 15-20% E’ stato seguito questo procedimento:
- dopo aver messo i vetrini sul supporto è stato preparato il gel di acrilamide / bis-acrilamide con metodo discontinuo, cioè polimerizzando prima il gel di separazione vero e proprio, il running gel (A), e poi stratificando sopra il gel di allineamento, lo stacking gel (B), su cui viene poi inserito il pettine
55
- quando anche lo stacking gel è polimerizzato, si toglie il pettine e si mette il gel nel tampone di corsa 1
- denaturare le proteine estratte ( trattate con SDS ) + 10l di Laemli buffer (10l) con bollitura per 5 min;
- caricare l’estratto proteico su gel; il volume massimo di riempimento di un pozzetto è 50l - fare partire la migrazione elettroforetica a 200 V costanti per 50-60 min; se la proteina è
alta, far uscire il blu. Soluzioni utilizzate per il gel:
Running gel (A) 10%
acrilamide / bis-acrilamide 30% 3.3 ml Tris HCl 1.5 M pH 8.8 2.5 ml
SDS 10% 100 l
H20 4.0 ml
Ammonio persolfato (APS) 10% 100 l
Temed 4 l Staking gel (B) acrilamide / bis-acrilamide 30% 2.0 ml Tris HCl 0.5 M pH 6.8 2.2 ml SDS 10% 100 l H20 5.1 ml
Ammonio persolfato (APS) 10% 80 l
Temed 10 l
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La corsa elettroforetica è stata effettuata applicando una corrente di 200 V (Voltaggio costante) per 50-60 min.
57 Trasferimento del gel su nitrocellulosa
Dopo la corsa elettroforetica vengono tolti i vetrini, tagliato lo staking gel e viene preparato il flottaggio stratificando su una apposita griglietta il materiale per il trasferimento, imbevuto di tampone, secondo il seguente ordine:
1. spugnetta
2. foglio di carta Wartman 3. gel
4. foglio di nitrocellulosa ( stesse dimensioni del gel ). 5. foglio di carta Wartman
6. spugnetta
Il trasferimento avviene elettricamente per 1h a 100 Volt (Voltaggio costante), 200 – 300 mA, raffreddando l’apparecchio con ghiaccio.
Una volta che il trasferimento è stato completato, si procede con l’immunoblotting.
Questo metodo permette il riconoscimento di una specifica proteina tra il pool di proteine separate mediante una reazione di tipo immunologico, Ag – Ab, con un Ab policlonale o monoclonale contro la proteina in questione. La reazione viene eseguita incubando direttamente il filtro su cui si è trasferita la proteina con l’Ab specifico. La proteina viene poi rivelata mediante una reazione luminescente ox – perox, dove la perox è coniugata a specifici anticorpi secondari.
Inizialmente il filtro viene saturato con 10ml di soluzione di saturazione ( BSA 5% in TBS-T ) per 1h in agitazione a temperatura ambiente.
Si effettua poi l’incubazione del filtro con Ab specifico (primario) diluito alla concentrazione desiderata in 10 ml di soluzione di saturazione, overnight a 4° in agitazione continua.
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- Lavaggio veloce (10ml) + 3 lavaggi (di 10ml ciascuno) da 10 min ciascuno con sol. di
lavaggio (TBS – T) e 2 lavaggi da 5 min.
- Incubazione del filtro per 1h con 10ml di soluzione di saturazione + Ab secondario diluito 1:9000 (Anti Rb) o 1:20000 (Anti Ms).
- Lavaggio veloce (10ml) + 5 lavaggi (di 10ml ciascuno) da 10 min ciascuno con sol. di lavaggio (*TBS-T) + 2 lavaggi da 5min.
- Incubazione per 3 min con 10 ml della sol. di rivelazione della perossidasi (Luminata Forte-western HRP substrate, Millipore)
- L’emissione chemioluminescente è stata rilevata utilizzando Kodak Image Station per
chemioluminescenza.
Le immagini acquisite sono state analizzate con l’apposito software, ed i valori espressi come unità arbitrarie, tenendo conto sia dell’intensità di sviluppo delle bande sia della loro ampiezza.
Soluzioni utilizzate:
Tampone di corsa 10x, Tampone di trasferimento
Tris 30 g/l Tris 3.03 g/l Glicina 144 g/l Glicina 14.4 g/l SDS 10 g/l Metanolo (20%) 200 ml H2O 800 ml TBST: TBS + Tween 20 (0,1%) TBS NaCl 150 mM 8,76 gr in 1l
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Tris HCl (pH 7.6) 20 mM 10 ml di Tris HCl (pH 7.6) 2M in 1l
Tween 20 (Polyoxyethylene sorbitan monolaurate, SIGMA) 1 ml in 1l
Gli anticorpi utilizzati durante la sperimentazione sono:
- p42-44 MAPK diluito 1:1000 (Cell Signaling Technology)
- phospho p42-44 MAPK diluito 1:1000(Cell Signaling Technology) - AKT TOT diluito 1:1000 (Cell Signaling Technology)
- P-AKT diluito 1:1000 (Cell Signaling Technology) - SIRT-1 diluito 1:000 (Cell Signaling Technology) - SIRT-1 diluito 1:500 (Santa Cruz Biotechnology) - HIF2α diluito 1:1000 (Millipore Corporation) - AMPKα1 diluito 1:500 (Millipore Corporation) - P-AMPK diluito 1:500 (Millipore Corporation) - β-Actine diluito 1:6000 (Santa Cruz Biotechnology) - Goat Anti-Mouse diluito 1:20000 (Sigma Aldrich)
60 7.5 PROTOCOLLO DI LISI CELLULARE
In ogni fase sperimentale le cellule sono state lisate utilizzando 190µl di buffer di lisi, tre cicli di congelamento/scongelamento e centrifugate a 13000 rpm x 10min.
Il Buffer di lisi è così costituito: Ripa Buffer
Inibitori delle proteasi Inibitori delle fosfatasi
Il Ripa Buffer è una soluzione contenente TRIS-HCl 50mM pH 8.0, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Triton 1%, SDS 0.1 %.
Gli inibitori delle proteasi da aggiungere per ogni ml di questo Buffer sono: pepstatina 1 l
leucopeptina 2 l aprotinina 2 l
Gli inibitori delle fosfatasi da aggiungere per ogni ml di questo Buffer sono: sodio ortovanadato (1mM) 10 l
sodio pirofosfato (10 mM) 100 l sodio fluoruro (20 mM) 40 l
61 7.6 TEST DI CITOTOSSICITÀ
7.6.1 Test Di Citotossicità Con Trypan Blue
Il trypan blueu (Sigma) è un colorante che riesce ad entrare nelle cellule quando queste non abbiano integra la membrana citoplasmatica; rende pertanto distingiubili al microscopio ottico le cellule vive, che appaiono chiare e traslucide, da quelle morte, che appaiono opache e colorate in blu. Operativamente, la sospensione cellulare (50 μl) in questo caso è stata diluita 1:2 con trypan bleu ed un’aliquota da 10 μl veniva posta nella cameretta di Burker.
La camera di Burker consiste in un vetrino per microscopio diviso in 2 camere da una scanalatura orizzontale; le due camerette mostrano zigrinature visibili al microscopio che delimitano la superficie del vetrino, dividendola in 25 quadratini di area nota.
Contando le cellule presenti sul vetrino secondo uno schema predeterminato, essendo il volume contenuto in una singola camera fisso e noto, si può risalire alla concentrazione di cellule vive contenute nel campione di partenza.
numero di cellule vive = “x” cellule traslucide ( non colorate di blu ) * 10000 ( fattore di conversione ) * 2 ( fattore di diluizione ) * 0.05 ( volume di sospensione espresso in ml ).
62 7.6.2 Test Di Citotossicità CytoTox-FLUOR™
Il CytoTox-FLUOR™ (Promega, Italy) è un saggio di citotossicità in fluorescenza che misura il numero di cellule morte in una popolazione cellulare mediante l’aggiunta di un singolo reagente. In particolare, il saggio utilizza come substrato un peptide fluorogenico bis-AAF-R110 (bis-alanil-alanil-fenilalanil-rodammina 110) che fornisce una misura dell’attività delle proteasi rilasciate dalle cellule che hanno perso l'integrità della membrana. Infatti, il substrato bis-AAF-R110 non può varcare la membrana intatte delle cellule vive e quindi non rilascia alcun segnale in presenza di cellule vive.
E’ stato utilizzato il protocollo riportato nel data-scheet provvisto dalla ditta. Fig.A
63 7.7 TEST DI VITALITÀ CELLULARE: XTT
Il saggio colorimetrico XTT (2,3-Bis (2- metossi- 4-nitro- sulfofenil) -2H-tetrazol- 5-carbossanilide) si basa sull’attività della respirazione mitocondriale delle cellule; infatti cellule metabolicamente attive (vive) riducono il sale di tetrazonio a formazan; dalla misura allo spettrofotometro di quest’ultimo è quindi possibile ricavare il numero di cellule vive all’interno del nostro campione.
Fig.B Reazione saggio dell’ XTT.
E’ stato utilizzato il protocollo riportato nel data-scheet provvisto dalla ditta.
STATISTICA
L’analisi della varianza ad una via (ANOVA), seguita dal test di Student–Newman-Keuls, è stato utilizzata per confrontare le medie e per trovare differenze significative tra i Gruppi sotto studio. Un valore di p<0.05 è stato considerato statisticamente significativo. I dati sono presentati come medie ± ES.
XTT
