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Capitolo 5: Materiali e metodi
5.1 Metodi cromatografici
5.1.1 Cromatografia su strato sottile
Le cromatografie su strato sottile sono state eseguite su lastre di gel di silice Kieselgel 60 F254 (Merck) di 0.25 mm di spessore su un supporto di vetro o di
alluminio. Come fasi mobili (eluenti) sono state scelte molte miscele di solventi a seconda del campione in esame. Se ne riportano di seguito alcuni esempi:
EC (n-esano-CHCl3, in miscela 9:1, 8:2, 7:3, 1:1)
CM (CHCl3-MeOH, in miscela 99:1, 98:2, 97:3, 95:5, 9:1)
CMW (CHCl3-MeOH-H2O, in miscela 70:30:3 e 80:18:2)
BAW (n-BuOH-CH3COOH-H2O, 60:15:25)
La rivelazione delle macchie è stata effettuata sia con luce UV a 254 e 366 nm, sia con il seguente reattivo spray:
soluzione satura di solfato di cerio in acido solforico al 65%, seguita da riscaldamento a 120° C per 15 minuti, per consentire lo sviluppo della colorazione tipica delle macchie, indice della natura dei composti analizzati (Fig 5.1).
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5.1.2 Cromatografia su colonna
5.1.2.1 Cromatografia ad esclusione molecolare
La cromatografia ad esclusione molecolare è stata impiegata per cromatografare l’estratto cloroformio-metanolico (RC-M) delle parti aeree di Euphorbia laurifolia
Juss.ex Lam. (2.7 g) e per l’estratto n-butanolico (2.854 g) ottenuto dalla ripartizione n-BuOH/H2O dell’estratto metanolico.
Come fase stazionaria è stato utilizzato gel di Sephadex LH-20 (25-100 µm, Pharmacia Fine Chemicals), impaccato in una colonna di 100 x 2.5 cm (Fig. 5.2). Come fase mobile è stato utilizzato MeOH.
Infine è stata impiegata una pompa peristaltica Pharmacia Fine Chemicals P1 con un flusso costante di 1 ml/min.
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5.1.2.2 Cromatografia flash con strumentazione Biotage
®Isolera™
Spektra
La cromatografia flash è stata impiegata per cromatografare l’estratto cloroformico (RC) delle parti aeree di Euphorbia laurifolia Juss. ex Lam. (5.0 g) e per l’estratto
esanico (5.0 g).
Come fase stazionaria è stato utilizzato il gel di silice 60 (230-410 µm, Merck) impaccato su una colonna (SNAP cartridge) le cui dimensioni variano in base alla quantità di estratto da caricare su Samplet cartridge. Per quanto riguarda la fase mobile, l’eluizione è stata condotta a gradiente di polarità crescente calcolato ed ottimizzato automaticamente dallo strumento, utilizzando miscele di CHCl3-MeOH,
oppure in sequenza n-esano-CHCl3-MeOH. Per lo studio degli estratti cloroformico ed
esanico apolare sono stati usati gli SNAP cartridge da 340 g, ed il flusso della fase mobile è stato impostato a 100 ml/min, per lo studio dell’estratto esanico polare è stato usato lo SNAP cartridge da 25 g, ed il flusso della fase mobile è stato impostato a 30 ml/min. Il sistema di purificazione cromatografico con strumentazione Biotage® Isolera™ Spektra consente di rilevare lo spettro PDA con
scansione in tempo reale, impostando la modalità di raccolta di tutti i composti UV- assorbenti a lunghezza d’onda λ=254 nm e λ=320 nm (Fig 5.3). Le dimensioni delle colonne, relative alla quantità di campione caricato, sono riportate in Tab 5.1.
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Tab 5.1 - Parametri Biotage® Isolera™ Spektra
5.1.3 HPCPC (High Performance Centrifugal Partition Chromatography)
L’HPCPC è una tecnica cromatografica che non necessita di colonna su fase solida ma che si basa sulla ripartizione dei soluti tra due fasi liquide fra loro immiscibili. La corretta scelta del sistema solvente è cruciale per il successo della cromatografia. La fase stazionaria, viene introdotta nelle celle di ripartizione disposte nel rotore, mentre la fase mobile, passandovi attraverso, forma delle goccioline, in modo che i composti sono separati in base al loro coefficiente di ripartizione. I metodi di eluizione si dividono in due diverse modalità: ascendente e discendente. Nella modalità ascendente, la fase mobile è introdotta dal basso del rotore e fluisce verso l’alto, la fase mobile deve essere quella con la densità minore. Nella modalità discendente, la fase mobile è introdotta dall’alto del rotore e fluisce verso il basso, in questo caso la fase mobile sarà quella a maggior densità. La cromatografia HPCPC è stata effettuata con uno strumento EverSeiko CPC 240 equipaggiato con 3136 celle (15 mm, 240 mL di volume totale) (Fig 5.4).
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Fig 5.4 - Strumentazione HPCPC
5.1.4 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Le separazioni in fase inversa con HPLC (20-100 bar) sono state effettuate con un apparecchio Shimadzu (Fig 5.5), costituito da:
Pompa Shimadzu LC-8A
Rivelatore Shimadzu RID-10A
Colonna Waters C-18 µ-Bondapak (30 cm x 7.8 mm)
Le separazioni sono state condotte utilizzando come fase mobile miscele eluenti di MeOH-H2O, ad una velocità di flusso di 2 ml/min, attenuazione 7x, con un numero
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Fig 5.5 - Strumentazione HPLC
5.2 Metodi chimico-fisici
5.2.1 Potere ottico rotatorio
Le misure sono state effettuate con un polarimetro Perkin-Elmer modello 241, fornito di una lampada al sodio (589 nm), alla temperatura di 22 °C, in celle da 1 decimetro di lunghezza ed 1 ml di volume, utilizzando MeOH come solvente (Fig 5.6).
Fig 5.6 - Polarimetro
5.2.2 Spettri UV
Gli spettri ultravioletti sono stati ottenuti e registrati in MeOH con uno spettrofotometro Perkin-Elmer Lambda 11 (Fig 5.7).
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Fig 5.7 - Spettrofotometro
5.2.3 Spettri di massa
Gli spettri di massa ESI-MS (modalità positiva e negativa) sono stati registrati con uno spettrometro Thermo Finningan LC-Q Advantage a trappola ionica, equipaggiato con un software Xcalibur. I campioni sono stati sciolti in 10-20 µg/ml con MeOH ed iniettati nella fonte ESI utilizzando una pompa a siringa. La velocità del flusso è stata di 5 µl/min (Fig 5.8).
Fig 5.8 - Spettrometro di massa
Spettri HRESIMS
Gli spettri di massa ad alta risoluzione HRESIMS sono stati registrati in modalità positiva su uno spettrometro Q-TOF-Premier provvisto di sorgente nano-elettrospray (Waters-Milford, USA).
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5.2.4 Spettri di risonanza magnetica nucleare
Per gli spettri NMR è stato utilizzato uno spettrometro Bruker DRX-600 (software UXNMR) operante a 599.19 MHz per 1H e 150.86 MHz per 13C e uno strumento
Bruker AC-250 (software Topspin) operante a 250 MHz per 1H e 62.5 MHz per 13C
(Fig 5.9)
Fig 5.9 - Strumentazione NMR
Gli spettri mono e bidimensionali sono stati misurati in CD3OD. Negli spettri 1H-NMR,
per la misurazione in CD3OD, è stato usato come standard il segnale relativo del
solvente (CD3OD a 3.31 ppm). I chemical shifts sono riportati in δ (ppm). Negli
spettri 13C-NMR è stato usato come riferimento il segnale del solvente a δ 49.0 per il
CD3OD. L'esperimento di correlazione diretta omonucleare (DQF-COSY, Double
Quantum Filtered COSY) è stato eseguito usando la convenzionale sequenza di impulsi. L'esperimento di correlazione diretta eteronucleare 1H-13C (HSQC) è stato
realizzato su una matrice 512 × 1024, usando una costante di accoppiamento C-H di 135 Hz ed un relaxation delay di 1.5 sec (Kay et al., 1992; Palmer et al., 1991). L'esperimento di correlazione eteronucleare long range (HMBC) è stato ottenuto utilizzando la sequenza di Bax (Bax e Subramanian, 1986; Lerner e Bax, 1986) ad una costante long range media di 6-8 Hz e una matrice 512 × 1024. Gli esperimenti DEPT-135° sono stati eseguiti utilizzando trasferimenti di polarizzazione per mezzo liquido di impulsi a 90° per ottenere solo i gruppi CH e di 135° per ottenere segnali positivi per i gruppi CH e CH3 e negativi per i gruppi CH2. Il ritardo nel trasferimento
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esperimenti 1D-TOCSY sono stati ottenuti usando un software UX-NMR e sono stati eseguiti utilizzando un generatore di impulsi gaussiani usando, durante il mixing time, la sequenza di impulsi di tipo MLEV-17 (mixing time 80-100 ms), secondo quanto riportato in letteratura (Davis e Bax, 1985).
