un gruppo di controllo (na ve), costituito da animali mai entrati nell’apparato di condizionamento.

3. MATERIALI E METODI

3.1 Soggetti sperimentali

Sono stati utilizzati ratti maschi albini, del ceppo Wistar, dell’età di circa 80 giorni, di peso corporeo medio di 340 grammi e non appartenenti alla stessa nidiata per aumentare la variabilità genetica del campione. Gli animali sono stati stabulati singolarmente in gabbie di acciaio inossidabile poste in una stanza nella quale l’illuminazione seguiva il normale ciclo luce-buio diurno, e la cui temperatura era mantenuta costante a 20 ± 1 °C. I ratti avevano sempre libero accesso al cibo e all’acqua. Gli animali sono stati divisi in due gruppi:

un gruppo sperimentale, costituito da animali sottoposti a contextual fear conditioning;

un gruppo di controllo (na ve), costituito da animali mai entrati nell’apparato di condizionamento.

3.2 Apparato di condizionamento

L’apparato sperimentale di condizionamento utilizzato è stato un

modello base di Skinner box (Modular Operant Cage, Coulbourn

Instruments Inc). Le dimensioni di questo apparecchio erano 29 x 31 x

26 cm. Il soffitto e due lati paralleli erano di pannelli di alluminio. Gli

altri due lati, di cui uno apribile, per consentire l’ingresso dell’animale,

erano di plastica trasparente. Il pavimento era composto di barrette di

acciaio inossidabile, connesse con un dispositivo atto a produrre scosse

elettriche (Grid Floor Shocker, Coulbourn Instruments Inc., Model E13- 08). L’apparato era connesso ad un sistema per programmare durata e numero degli stimoli (Scatola di comando Arco 2340 – Ugo Basile).

L’apparato era posto in una cabina acusticamente isolata (3.5 x 1.8 x 2.1 m), mantenuta a una temperatura costante di 20 ± 1° C. Nella stanza l’intensità dell’illuminazione era di 60 lux.

Fig.7: Rappresentazione dell’apparato di condizionamento.

3.3 Protocollo di condizionamento alla paura

Ciascun ratto del gruppo sperimentale è stato sottoposto al test del CFC tra le ore 10.00 e le ore 13.00 per ridurre le influenze circadiane.

L’animale è stato estratto manualmente dalla gabbia di stabulazione,

posto in un contenitore di plastica a pareti opache e trasportato dalla

stanza di stabulazione all’appropriata stanza acusticamente isolata.

Il soggetto è stato introdotto nell’apparato di condizionamento (CS), dove veniva lasciato indisturbato per 3 minuti (Fig.8(A)). Dopo l’introduzione dell’animale nella Skinner box inizia la seduta di addestramento che dura in totale 8 minuti. Terminato il periodo di esplorazione libera, al soggetto veniva somministrato uno stimolo US consistente in una serie di 7 scosse elettriche (durata di 1 s, intensità di 1mA) intervallate 30 s l’una dall’altra (Fig.8(B)). Dopo 2 minuti dal termine della stimolazione, gli animali veniva riportato nella propria gabbia di stabulazione (Fig.8(C)). Durante l’applicazione del protocollo di condizionamento è stato possibile osservare le risposte di freezing mediante una telecamera a circuito chiuso situata nella stanza.

Fig.8: Schema del protocollo di condizionamento utilizzato.

3.4 Isolamento e conservazione dei tessuti

Trascorse 48 ore dal condizionamento, gli animali condizionati e i na ve

sono stati sacrificati tramite decapitazione, dopo lieve anestesia con

l’etere. Il cervello di questi animali è stato rimosso dalla scatola cranica,

mentre, contemporaneamente a questa operazione, veniva versata sul

cervello soluzione fisiologica molto fredda. La bassa temperatura, oltre a rallentare i processi ossidativi, rende il tessuto nervoso più consistente.

Dopo essere stato rimosso dalla scatola cranica, il cervello di ciascun animale è stato posto, in condizioni sterili, su una superficie piana e sono state effettuate due dissezioni utilizzando una lametta ben affilata e sgrassata con alcool etilico al 95%. Sono state ottenute tre sezioni: una frontale, una comprendente le strutture medio-temporali e una posteriore comprendente il cervelletto e le strutture sottostanti (Fig.9). Tutte le sezioni di tessuto cerebrale sono state poste in criovials, istantaneamente congelate in azoto liquido, trasferite e stoccate a -80° C. Per i successivi esperimenti di biologia molecolare abbiamo utilizzato solo le sezioni medio-temporali, poiché comprendono le strutture dell’ippocampo, dell’amigdala e le aree corticali coinvolte nei fenomeni di apprendimento e memoria in seguito a CFC.

Fig.9: Sezioni operate sul cervello dei ratti, frontale (I), medio-temporale (II) e cerebello- bulbare (III).

3.5 Estrazione dell’RNA totale

L’RNA totale è stato isolato dalle sezioni medio-temporali dei cervelli di animali condizionati e dei controlli, ottimizzando la metodologia descritta da Chirgwin (Chirgwin, Przybyla, MacDonald and Rutter, 1979), come descritto da Traina (Traina, Valleggi, Bernardi, Rizzo, Calvani, Nicolai, Mosconi, Durante and Brunelli, 2004). Per minimizzare la contaminazione da RNAsi, sono state utilizzate soluzioni trattate con dietilpirocarbonato (DEPC). I campioni sono stati omogeneizzati con un omogenizzatore Ultra-Turrax, immediatamente dopo essere stati immersi nel tampone GITC. L’omogenato è stato caricato su un gradiente di CsCl 5,7 M. Il gradiente è stato centrifugato in ultracentrifuga Beckman L8-70M con rotore Kontron TY65 a 40.000 rpm a 20 °C per 24 ore. Il pellet di RNA totale ottenuto è stato solubilizzato in H

0

e precipitato con 0,1 volumi di Sodio Acetato 3 M pH 6,4 e 2,2 volumi di Etanolo Assoluto per una notte a –20 °C. In seguito il campione è stato centrifugato a 13.000 rpm in centrifuga con rotore Kontron A8.24 per 30 minuti e il pellet lavato con Etanolo al 70%

per eliminare i sali residui. L’RNA è stato quindi solubilizzato in un opportuno volume di H

0

. Dopo essere stati quantizzati, i campioni sono stati conservati a -80°C per le analisi successive.

S

• guanidina tiocianato 4 M

• sodio citrato 25 mM, pH 7,0

• β-mercaptoetanolo 0,1 M

• N- lauril sarcosinato 0,5% (p/v)

Cloruro di Cesio 5,7M

• cloruro di cesio 5,7 M

• sodio acetato 25 mM, pH 6,4

3.6 Isolamento dell’mRNA poliA

L’mRNA maturo e pronto per la traduzione è caratterizzato dalla poliadenilazione cioè l'aggiunta di una poliA

ovvero una sequenza poliadenilica di circa 200 nucleotidi, in modo covalente all'estremità 3'- OH. Il poliA

svolge una funzione molecolare importante:

consente infatti l'isolamento dell'mRNA separandolo dall' rRNA e dal tRNA, molto più numerosi.

Per l'isolamento dell’mRNA poliA

è stato usato il PolyATtract

mRNA Isolation Systems (Promega). Il sistema utilizza un primer oligo(dT) biotinilato che ha la capacità di ibridare ad alta efficienza con la regione poliA

presente nella maggior parte dei mRNA maturi eucariotici. Gli ibridi possono poi essere recuperati usando particelle paramagnetiche (PMP) associate a streptavidina (che ha la capacità di legarsi alla biotina) ed a un supporto magnetico. Un mg di RNA totale in un volume di 500 µl di H

0

è stato denaturato per 10 minuti a 65°C;

sono stati aggiunti 3 µl di Biotinylated Oligo(dT) Probe e 13 µl di SSC

20x (NaCl 3 M; Na-citrato 0,3 M); il tutto è stato incubato a temperatura

ambiente fino a raffreddamento per permettere la reazione di

appaiamento. Contemporaneamente le particelle PMP sono state lavate e

sospese in SSC 0,5X ed aggiunte poi alla reazione di appaiamento

lasciando incubare a temperatura ambiente per circa 10 minuti per

permettere il legame tra la biotina e la streptavidina. Catturate le

particelle PMP e lavate con SSC 0,1X, sono stati in seguito eluiti gli

mRNA risospendendo le particelle PMP in H

0

e catturandole con il magnete. La fase acquosa, contenente l’mRNA, è stata recuperata e trasferita in una nuova provetta RNAsi-free. L’mRNA è stato poi precipitato, sospeso in 10 µl di H

0

, quantizzato e conservato a - 80°C per le successive analisi.

3.7 Controllo della qualità dell’mRNA poliA

Per la costruzione delle librerie sottrattive di cDNA tramite l’SSH

(ibridazione sottrattiva soppressiva) sono stati utilizzati gli mRNA

poliA

isolati sia dai campioni sperimentali che di controllo. Per

valutare, ulteriormente, che le quantità dei campioni in esame fossero

paragonabili è stata effettuata una retrotrascrizione a catena della

polimerasi (RT-PCR) su una piccola quantità di ciascun mRNA poliA

utilizzando come primers quelli del gene costituitivo gliceraldeide-3-

fosfato deidrogenasi (G3PDH). Per valutare l’eventuale presenza del

RNA ribosomale è stata effettuata una RT-PCR utilizzando 3 set di

primers specifici per l’rRNA di ratto (5,8 S; 18 S e 28 S), le cui sequenze

sono state trovate in banca dati. La RT-PCR è una tecnica di biologia

molecolare che consente di amplificare un DNA partendo da un pool di

RNA, di quantificare l’mRNA e di studiare l'espressione genica. La

retrotrascrizione prevede 2 step: la retrotrascrizione dell'RNA in cDNA e

la successiva amplificazione tramite PCR del cDNA ottenuto.

3.8 Costruzione delle librerie soppressive sottrattive

Per individuare sequenze di mRNA differenzialmente espresse in seguito

a CFC è stato utilizzata la tecnica SSH la cui attuazione è stata resa

possibile dall’impiego del PCR-Select cDNA Subtraction Kit (BD

Biosciences). Questa metodologia permette di ottenere librerie di cDNA

arricchite di trascritti presenti soltanto in uno dei due campioni

comparati (Diatchenko, Lau, Campbell, Chenchik, Moqadam, Huang,

Lukyanov, Lukyanov, Gurskaya, Sverdlov and Siebert; 1996) e presenta

la peculiarità di riuscire ad isolare anche sequenze poco espresse

(Gurskaya, Diatchenko, Chenchik, Siebert, Khasperov, Lukyanov,

Vagner, Ermolaeva and Lukyanov Sverdlov, 1996). I vantaggi dell’SSH

rispetto alle altre tecniche di analisi di espressione genica sono: piccole

quantità di mRNA iniziali (1-2 g) e un protocollo semplice e veloce. Il

protocollo dell’SSH comprende due ibridazioni sottrattive, seguite da

due reazioni di PCR. Nella Fig.10 è rappresentato in modo schematico il

protocollo di costruzione della libreria forward in cui ci riferiamo con il

termine tester al cDNA ottenuto dall’mRNA isolato dai cervelli di ratti

condizionati e con il termine driver all’cDNA ottenuto dall’mRNA

isolato dai cervelli di animali naïve. Il cDNA è stato sintetizzato a partire

da 2 g di mRNA di entrambi i campioni ed è stato digerito con l’enzima

di restrizione RsaI, per produrre frammenti blunt-end. Il cDNA del tester

è stato suddiviso in due aliquote ed a ciascuna è stato legato un diverso

adattatore: 1 e 2R. Gli adattatori, privi del gruppo fosfato al 5’, si legano

solo all’estremità 5’ del cDNA. Sono seguite due ibridazioni sottrattive

successive. La prima è stata effettuata aggiungendo a ciascun tester

denaturato, driver denaturato in eccesso. Durante questa fase la maggior

parte dei trascritti del tester non differenziali si lega al driver e la rimanente frazione del tester, che rimane a singolo filamento, risulta arricchita di sequenze differenzialmente espresse. La seconda ibridazione è stata effettuata unendo, senza denaturare, i prodotti della prima ibridazione e aggiungendo driver denaturato in eccesso.

Durante questo passaggio, oltre ad arricchirsi di sequenze differenzialmente espresse, la frazione a singolo filamento del tester 1 ibriderà con la stessa frazione nel tester 2R, formando una popolazione di sequenze differenzialmente espresse a doppio filamento caratterizzate dal fatto di essere asimmetricamente fiancheggiate dai due adattatori.

Questo, insieme all’effetto soppressivo, rende possibile la loro

amplificazione selettiva tramite due PCR successive utilizzando come

primers il NESTED primer1 e il NESTED primer2, le cui sequenze

sono complementari a quelle degli adattatori 1 e 2R (Tabella 1, pag.61).

Fig.10: Schema del protocollo della SSH per la costruzione della libreria forward.

Tramite la tecnica della SSH si ottengono due librerie:

la libreria forward contenente i prodotti dei geni che sono attivati o modulati positivamente in seguito a CFC, ottenuta utilizzando come tester il cDNA ottenuto dai ratti sottoposti a CFC e come driver il cDNA ottenuto dai ratti naïve;

la libreria reverse contente i prodotti dei geni inibiti o modulati negativamente in seguito a CFC, ottenuta utilizzando come tester il cDNA naïve e come driver il cDNA ottenuto dai ratti sottoposti a CFC.

Per ciascuna libreria è stata valutata l’efficienza di sottrazione per mezzo di una PCR utilizzando primers della G3PDH, gene costitutivo, come suggerito dal protocollo del PCR-Select cDNA Subtraction Kit (BD Biosciences). Gli amplificati ottenuti dalla seconda amplificazione sono stati inseriti nel vettore di clonaggio PCR® II-TOPO vector (TOPO TA Cloning® kit, Invitrogen). I cloni sono stati recuperati in microtetraplates da 96 pozzetti contenenti 65 l di LB A

, sono stati messi a crescere una notte in agitazione orizzontale a 37°C e, dopo l’aggiunta di 50 l glicerolo, sono stati conservati a –20°C.

3.9 Screening primario delle librerie 3.9.1 PCR da colonia

Per ciascun clone isolato, 1 l di colonia è stato messo a crescere per 2

ore in 50 µl di LB A

liquido a 37°C su agitatore orizzontale. La coltura

è stata amplificata mediante PCR utilizzando le seguenti condizioni: 1 l

della coltura è stato utilizzato come stampo, poi sono stati aggiunti 2,5 µl

di tampone 10x PCR EuroClone; 0,25 µl di dNTP Mix 10 mM; 0,25 µl di Primer M13F 10 µM; 0,25µl di Primer M13R 10 µM (per le sequenze vedere Tabella 1, pag.61); 2,5 µl di soluzione 25 mM di MgCl

; 0,25 µl di EuroTaq DNA Polymerase, 5U/µl; i µl di H

O sterile necessari per raggiungere un volume finale di 25 µl. La reazione è stata posta nel termociclizzatore (Applied Biosciences GeneAmp PCR System 2700) ed è stata iniziata l’amplificazione con la denaturazione dello stampo a 94°C per 10 minuti seguita da 30 cicli così composti: 94°C per 30 sec, 55°C per 30 sec, 72°C per 90 sec; al termine dei cicli è stata fatta seguire una estensione finale a 72°C per 10 minuti. I prodotti di PCR sono stati analizzati su gel di agarosio al 2%.

3.9.2 Dot Blot del prodotto di PCR

Per ciascun clone, il prodotto di PCR è stato denaturato (ad una temperatura di 95

C per 1 minuto) e, di questo, 2 µl sono stati trasferiti su membrane Hybond N

(Amersham Biosciences) nel seguente modo: 1.

µl sulla membrana che ibriderà con la sonda forward e l’altro µl sulla

membrana che ibriderà con la sonda reverse. Le membrane così ottenute

sono state fissate mediante Hoefer™ UVC 500 cross-linker (Amersham

Biosciences). Lo screening primario, mediante la tecnica degli Spot Blot,

ha permesso di eliminare i cloni falsi positivi, interpretando i risultati

secondo il protocollo descritto nel PCR Select Differential Screening kit

User Manual (BD Biosciences). Dopo aver individuato i cloni candidati

ad essere differenzialmente espressi, si è passati all’isolamento del DNA

plasmidico e quindi al sequenziamento, effettuato con sequenziatore

automatico.

3.9.3 Marcatura delle sonde

Le membrane sono state ibridate utilizzando come sonde i cDNA che costituiscono le librerie forward e reverse marcate con marcatura non radioattiva utilizzando DIG DNA Labelling Kit (Roche). Per la marcatura del cDNA 1 g del prodotto della seconda PCR (paragrafo 3.8) è stato digerito con RsaI per eliminare gli adattatori 1 e 2R da ogni sequenza di cDNA. Successivamente il cDNA digerito è stato denaturato in 15 µl di H

O (ad una temperatura di 100°C per 10 minuti) e dopo averlo raffreddato in ghiaccio sono stati aggiunti: 2 µl di esanucleotidi, 2 µl di dNTP (con UTP marcato), 1 µl dell’enzima Klenow. Dopo incubazione over-night a 37°C, la reazione polimerasica è stata interrotta aggiungendo 2 µl di Na

EDTA 0,2 M (pH 8,0). Il cDNA è stato precipitato con 2,5 µl di LiCl 4 M e 75 µl di etanolo assoluto freddo; il tutto è stato lasciato per 1 ora a -80°C. Successivamente il cDNA è stato centrifugato a 12.000 g per 40 minuti a 4°C ed il pellet ottenuto è stato lavato 2 volte con etanolo al 70%. Dopo i lavaggi è stato asciugato all'aria ed infine solubilizzato in 50 µl di H

O sterile.

3.9.4 Ibridazione su filtro

Come soluzione di preibridazione è stata utilizzata la Dig Easy Hyb

(Roche) in cui sono stati aggiunti i “competitori”, ovvero oligonucleotidi

con sequenza complementare a quella degli adattatori utilizzati per la

costruzione delle librerie sottrattive ad una concentrazione finale pari a

0,1 M. Questo è stato necessario al fine di evitare ibridazioni tra

eventuali adattatori rimasti nelle sonde forward e reverse ed il cDNA in

esame. Le membrane sono state ibridate con la soluzione di preibridazione per 2 ore nell'apposito termostato (20 ml di soluzione di preibridazione per circa 100 cm

di membrana) alla temperatura di 68°C.

Durante la fase di preibridazione le sonde marcate sono state denaturate in H

O a 100°C per 10 minuti e poi poste immediatamente in ghiaccio.

Successivamente è stata preparata la soluzione di ibridazione

aggiungendo la sonda marcata (25 ng/ml) ad una quantità opportuna di

altra soluzione di preibridazione mantenuta a 68°C e si è proceduto

quindi con l’ibridazione over-night sempre alla stessa temperatura. La

sonda è stata recuperata e le membrane sono state sottoposte ad una serie

di lavaggi a diversa stringenza, in dipendenza dell'omologia della sonda

e della sua composizione (% in G+C). La membrana è stata lavata due

volte in SSC 2X/SDS 0,1% per 20 minuti a temperatura ambiente, in

agitatore orizzontale. Poi, aumentando la stringenza, è stata lavata due

volte in SSC 0,1X/SDS 0,1% per 20 minuti a 68°C, in agitatore

orizzontale. Quindi è stata equilibrata per 5 minuti con il tampone 1 e

incubata per 1 ora in lenta agitazione con il tampone 2. Successivamente

è stata posta per 30 minuti in lenta agitazione in una soluzione

contenente l'anticorpo anti-digossigenina, diluito 1:10.000 nel tampone

2. In seguito sono stati effettuati, 3 lavaggi di 15 minuti nel tampone 1 a

cui è stato aggiunto Tween20 ad una concentrazione finale pari allo

0,3%; quindi la membrana è stata equilibrata per 5 minuti con il tampone

3. Utilizzando il metodo della visualizzazione chemioluminescente si è

proceduto in camera oscura cospargendo la membrana, adagiata in una

pellicola trasparente, con Lumigen CPD* (Roche) diluito 1:100 nel

tampone 3 (circa 1 ml per membrane di 100 cm

). Il tutto è stato lasciato

al buio per 5 minuti a temperatura ambiente, dopo di che è stata tolta la

soluzione in eccesso. Sulla membrana è stata posta una lastra

radiografica Hyperfilm β -max (Amersham Biosciences). Questa è stata lasciata in esposizione per circa 30 minuti. Successivamente la lastra radiografica è stata sviluppata e fissata con le soluzioni Kodak (seguendo le istruzioni fornite dalla ditta).

SOLUZIONI UTILIZZATE

:

Tampone 1

• NaCl 0,15 M

• Acido maleico 0,1 M

Portare a pH 7,5 con NaOH e autoclavare Blocking stock solution

• Sciogliere il Blocking reagent della ditta nel tampone 1 Conservare a –20°C

Soluzione di preibridazione

• Dig Easy Hyb (Roche) Tampone 2

• Blocking Stock Solution, diluita 1:10 nel tampone 1 Tampone 3

• Tris-HCl 100 mM, pH=9,5

• NaCl 100 mM

SSC 20x

• NaCl 3 M

• Na-Citrato 0,3 M

Portare a pH 7,0 con acido citrico e autoclavare SDS 10%

• SDS 10% (p/v)

3.10 Preparazione del DNA plasmidico su piccola scala

Il DNA plasmidico è stato estratto e purificato utilizzando Wizard PLUS SV Minipreps DNA Purification System (Promega) seguendo le istruzioni fornite dalla ditta.

I cloni sono stati inoculati in grainer contenenti 10 ml di LB A

e fatti

crescere a 37°C su agitatore rotante per una notte. Per ogni clone, 5 ml di

coltura sono stati centrifugati a 10000 rpm per 5 minuti in centrifuga da

tavolo ALC 4226 in un rotore ALC 5531 (questo tipo di centrifuga viene

utilizzato per tutta la preparazione). Successivamente le cellule sono

state risospese delicatamente in 250 µl di Cell Suspension Solution,

fornita dal kit. Sono stati poi aggiunti 250 µl di Cell Lising Solution,

fornita dal kit; il campione è stato delicatamente mescolato per

inversione, e lasciato a temperatura ambiente per 5 minuti. Sono stati

aggiunti 10 µl di Alcaline Protease Solution (fornita dal kit) e il

campione è stato delicatamente mescolato per inversione e lasciato a

temperatura ambiente per 5 minuti. La Alcaline Protease inattiva le

endonucleasi e altre proteine rilasciate durante la lisi delle cellule

batteriche che potrebbero danneggiare la qualità del DNA isolato. Al

campione sono poi stati aggiunti 350 µl di Wizard Plus SV

Neutralization solution (fornita dal kit) ed immediatamente il campione è

stato mescolato delicatamente per inversione. Il tutto è stato centrifugato

a 14.000 g per 1 minuto. Il surnatante così ottenuto è stato posto

delicatamente sulle colonnine fornite nel kit e centrifugato a 14.000 g per

1 minuto. Sono stati aggiunti 750 µl di Column Wash solution, fornita

dal kit, e il campione è stato centrifugato a 14.000 g per 1 minuto. La

procedura di lavaggio è stata ripetuta utilizzando 250 µl di Column Wash

solution e centrifugando le colonnine a 14.000 g per 2 minuti. Le colonnine sono state poste in provette sterili dove il DNA plasmidico è stato fluito con 75 µl di H

O sterile. L’operazione è stata ripetuta una seconda volta. Il DNA plasmidico ottenuto per ciascun clone è stato quantizzato allo spettrofotometro e su gel di agarosio.

SOLUZIONI UTILIZZATE

:

Ampicillina

• soluzione stock 10mg/ml solubilizzata in Etanolo 70%

LB (Luria-Bertani) liquido

• Triptone 1% (p/v)

• Yeast extract 0,5% (p/v)

• NaCl 1% (p/v)

a pH 7,0 con NaOH

3.11 Analisi delle sequenze

Le sequenze nucleotidiche dei cloni selezionati, ottenute con sequenziamento automatico, sono state analizzate mediante comparazione in banca dati (GenBank) con i seguenti programmi disponibili in rete:

FASTA:

(http://www.ebi.ac.uk/fasta33/) BLAST:

(http://www.ch.embnet.org/software/aBLAST.html)

La traduzione delle eventuali sequenze codificanti è stata effettuata con : ExPASy Translate Tool: (http://www.expasy.org)

3.12 Analisi di espressione genica tramite RT-PCR REAL- TIME

La PCR real-time, denominata anche PCR quantitativa o PCR quantitativa in tempo reale (rtq-PCR), è un metodo di amplificazione e quantificazione simultanee del DNA. I metodi comuni di quantificazione includono l'uso delle colorazioni fluorescenti che intercalano con il DNA a doppio-filamento e gli oligonucleotidi modificati del DNA (sonde) che sono flourescenti una volta ibridati con DNA. La PCR real-time sostituisce la PCR tradizionale nella RT-PCR per quantificare i livelli di espressione di specifici RNA. L’RT-PCR produce del DNA complementare a singolo filamento detto cDNA mantenendo inalterati i rapporti relativi di concentrazione delle diverse specie degli RNA. In questo modo è possibile misurare l'espressione relativa di un gene ad un tempo particolare, o in una cellula o in un tipo particolare di tessuto. Nei nostri laboratori è stato messo a punto un protocollo di PCR real-time basato sul sistema di rilevazione SYBR-Green. L’ottimizzazione di questo protocollo ha permesso di rilevare modificazioni dell’espressione genica di trascritti individuati in seguito allo screening delle librerie costruite tramite la tecnica dell’SSH. Come materiale di partenza è stato utilizzato l’RNA totale isolato dalle sezioni medio-temporali di cervelli di ratti sottoposti a CFC e di ratti na ve come descritto nel paragrafo 3.5.

Per rimuovere eventuali tracce di DNA genomico i campioni di RNA

sono stati trattati con la Deoxyribonuclease I Amplification Grade (Sigma) e successivamente quantificati tramite l’analisi spettrofluorimetrica. Per testarne la qualità, prima di procedere alla successiva analisi tramite PCR real-time, l’RNA totale estratto è stato analizzato su gel denaturante di agarosio. Ogni reazione di sintesi del cDNA è stata eseguita a partire da 1 µg di RNA totale utilizzando l’iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) in un volume finale di 20 µl in accordo con le istruzioni fornite dalla ditta. La PCR real-time è stata eseguita utilizzando il SYBR Green e il termociclizzatore MiniOpticon System (Bio-Rad). La mix finale di reazione conteneva 1 µl di cDNA, 300 nM di ciascun primer, 7,5 µl di iQ SYBER Green Supermix (Bio- Rad) e H

O RNAsi-free fino a raggiungere un volume finale di 15 µl. Le sequenze dei primers utilizzati sono mostrati in tabella 2. Tutte le reazioni sono state eseguite in triplicato. Come controlli negativi sono state eseguite reazioni in cui il cDNA stampo è stato sostituito da un ugual volume di acqua sterile. Per ciascuna reazione l’amplificazione è iniziata con la denaturazione dello stampo a 95°C per 3 minuti, seguita da 40 cicli così composti: a 95°C per 10 secondi, a 60°C per 20 secondi.

Al termine di ciascuna reazione è stata eseguita la curva di dissociazione

(o curva di melting) per valutare la qualità dei prodotti ottenuti. Prima di

ogni esperimento l’efficienza di amplificazione è stata valutata per

ciascuna coppia di primers ed è risultata essere del 100% per i primers

dei cloni 5ND3, 5VD6, 5VF8 e 7NB6 e del 99,5% per i primers della

G3PDH.

Primer utilizzati per la costruzione delle librerie

Nome Sequenza

NESTED primer 1 5’–TCGAGCGGCCGCCCGGCAGGT-3’

NESTED primer 2 5’–AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’

Primer utilizzati per la PCR da colonia M13 L 5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

M13 R 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3 Primer utilizzati per la real-time PCR

Nome Sequenza Bp Efficienza

5ND3 F 5’-GACCCACTCACCCATGTCTC -3’

5ND3 R 5’-AAATCAGTGCTTGTCGTCCA -3’

59 100%

5VD6 F 5’-GCTGTCAGTCAGAGCGTAAGG-3’

5VD6 R 5’-CACAAGGTGGGTCCAACTAGC-3’

125 100%

5VF8 F 5’-CTCTCAGACAAGCGGCAGATTG -3’

5VF8 R 5’-TGTTCCCAAAGCAAACCATCACG -3’

120 100%

7NB6 F 5’-GTGCTGTATTGACTGTGGAAGAC-3’

7NB6 R 5’-AGAATTGGGATCGCAAAGTGAAC-3’

98 100%

G3PDH F 5’-CCAGTAGACTCCACGACATAC-3’

G3PDH R 5’-CTACCCACGGCAAGTTCAAC-3’

153 99,5%

Tabella 1: Nome e sequenze dei primer utilizzati per la costruzione delle librerie, per la PCR da colonia e per la real-time PCR.

3.13 Quantizzazione dei livelli di espressione genica: metodo del 2

La valutazione relativa dei cambiamenti nell’espressione genica è stata effettuata tramite il metodo del 2

normalizzando i livelli di espressione dei geni di interesse rispetto al gene della G3PDH, il cui trascritto non varia nelle nostre condizioni sperimentali.

Come descritto da Livak and Schmittgen (2001), questo metodo permette di calcolare il ciclo della PCR in cui i segnali di amplificazione specifici sono separabili da quelli del rumore di fondo del sistema. Il numero dei cicli necessari perché un campione raggiunga il suo C

è inversamente proporzionale al numero di copie del target presente inizialmente in ogni campione. Il vantaggio in termini di precisione e di intervallo di quantificazione rispetto alle PCR tradizionali, è dovuto alla possibilità di quantificare il DNA al ciclo soglia, che è sempre calcolato nella fase esponenziale della reazione PCR, fase in cui i reagenti sono ancora lontani dall’esaurimento e gli elementi di variabilità sono così ridotti al minimo.

3.14 Analisi statistica

L’analisi statistica dei dati ottenuti con il metodo 2

(vedi paragrafo

precedente) è stata eseguita tramite l’unpaired t test. Le differenze sono

state considerate significative con una p< 0.05. Per effettuare l’analisi

statistica è stato usato il software PRISM (versione 4.0, Graph Pad

Software Inc., San Diego, CA).