3. MATERIALI E METODI
3.1 Soggetti sperimentali
Sono stati utilizzati ratti maschi albini, del ceppo Wistar, dell’età di circa 80 giorni e di peso corporeo medio di 340 grammi. Gli animali sono stati stabulati singolarmente in gabbie di acciaio inossidabile poste in una stanza nella quale l’illuminazione seguiva il normale ciclo luce-buio diurno e la cui temperatura era mantenuta costante a 20 ± 1 °C. I ratti avevano sempre libero accesso al cibo e all’acqua. Gli animali sono stati divisi in due gruppi:
un gruppo sperimentale, costituito da animali sottoposti a contextual fear conditioning;
un gruppo di controllo (naϊve), costituito da animali mai entrati nell’apparato di condizionamento.
3.2 Apparato di condizionamento
L’apparato sperimentale di condizionamento utilizzato è stato un modello base di Skinner box (Modular Operant Cage, Coulbourn Instruments Inc). Le dimensioni di questo apparecchio erano 29 x 31 x 26 cm. Il soffitto e due lati paralleli erano di pannelli di alluminio. Gli altri due lati, di cui uno apribile, per consentire l’ingresso dell’animale, erano di plastica trasparente. Il pavimento era composto di barrette di acciaio inossidabile, connesse con un dispositivo atto a produrre scosse elettriche (Grid Floor Shocker, Coulbourn Instruments Inc., Model E13-08). L’apparato era connesso ad un sistema per programmare durata e numero degli stimoli (Scatola di comando Arco 2340 – Ugo Basile). L’apparato era posto in una cabina acusticamente isolata (3.5 x 1.8 x 2.1 m), mantenuta a una temperatura costante di 20 ± 1° C. Nella stanza l’intensità dell’illuminazione era di 60 lux.
Fig.8: Rappresentazione dell’apparato di condizionamento.
3.3 Protocollo di condizionamento alla paura
Ciascun ratto del gruppo sperimentale è stato sottoposto al test del CFC tra le ore 10.00 e le ore 13.00 per ridurre le influenze circadiane. L’animale è stato estratto manualmente dalla gabbia di stabulazione, posto in un contenitore di plastica a pareti opache e trasportato dalla
stanza di stabulazione all’appropriata stanza acusticamente insonorizzata.
Dopo l’introduzione dell’animale nella Skinner box inizia la seduta di addestramento che dura in totale 8 minuti. Il soggetto è stato introdotto nell’apparato di condizionamento (CS), dove veniva lasciato indisturbato per 3 minuti (fig.9 A). Terminato il periodo di esplorazione libera, al soggetto veniva somministrato uno stimolo US consistente in una serie di 7 scosse elettriche (durata di 1 s, intensità di 1mA) intervallate 30 s l’una dall’altra
del protocollo di condizionamento è stato possibile osservare le risposte di freezing mediante una telecamera a circuito chiuso situata nella stanza.
Fig.9: Schema del protocollo di condizionamento utilizzato.
3.4 Isolamento e conservazione dei tessuti
Trascorse 48 ore dal condizionamento, sia gli animali condizionati che i naϊve sono stati sacrificati tramite decapitazione, dopo essere stati anestetizzati con etere. Durante la rimozione dalla scatola cranica, il cervello degli animali è stato raffreddato con soluzione fisiologica mantenuta a bassa temperatura, che oltre che rallentare i processi ossidativi, rende il tessuto nervoso più consistente.
Dopo essere stato rimosso dalla scatola cranica, il cervello di ciascun animale è stato posto, in condizioni sterili, su una superficie piana e sono state effettuate due dissezioni utilizzando una lametta ben affilata e sgrassata con alcool etilico al 95%. Sono state ottenute tre sezioni: una frontale, una comprendente le strutture medio-temporali e una posteriore comprendente il cervelletto e le strutture sottostanti (fig.10). Tutte le sezioni di tessuto cerebrale sono state poste in criovials, istantaneamente congelate in azoto liquido e conservate a -80° C. Per i successivi esperimenti di biologia molecolare abbiamo utilizzato solo le sezioni medio-temporali, poiché comprendono le strutture dell’ippocampo, dell’amigdala e le aree corticali coinvolte nei fenomeni di apprendimento e memoria in seguito a CFC.
Fig.10: Sezioni operate sul cervello dei ratti, frontale (I), medio-temporale (II) e cerebello- bulbare (III).
3.5 Estrazione dell’RNA totale
L’RNA totale è stato isolato dalle sezioni medio-temporali dei cervelli di animali condizionati e dei controlli, ottimizzando la metodologia descritta da Chirgwin (Chirgwin et al., 1979), come descritto da Traina et al., 2004. Per minimizzare la contaminazione da RNAsi, sono state utilizzate soluzioni trattate con dietilpirocarbonato (DEPC). I campioni sono stati omogeneizzati con un omogenizzatore Ultra-Turrax, immediatamente dopo essere stati immersi nel tampone GITC. L’omogenato è stato caricato su un gradiente di CsCl 5,7 M e centrifugato in ultracentrifuga Beckman L8-70M con rotore Kontron TY65 a 40.000 rpm a 20 °C per 24 ore. Il pellet di RNA totale ottenuto è stato solubilizzato in H20DEPC e precipitato con 0,1 volumi di Sodio
eliminare i sali residui. L’RNA è stato quindi solubilizzato in un opportuno volume di H20DEPC. Dopo essere stati quantizzati tramite lettura spettroflorimetrica ed elettroforesi in condizioni denaturanti, l’RNA totale estratto da ciascun gruppo di animali è stato anche quantizzato tramite RT- PCR utilizzando utilizzando 3 set di primers specifici per l’rRNA di ratto (5,8 S; 18 S e 28 S), le cui sequenze sono state trovate in banca dati e i primers del gene costitutivo 3-gliceraldeide-trifosfato-deidrogenasi (G3PDH).
I campioni sono stati conservati a -80°C per le analisi successive.
SOLUZIONI UTILIZZATE PERL’ESTRAZIONE DELL’RNA TOTALE Tampone GITC:
• guanidina tiocianato 4 M
• sodio citrato 25 mM, pH 7,0
• β-mercaptoetanolo 0,1 M
• N- lauril sarcosinato 0,5% (p/v)
Cloruro di Cesio 5,7M
• cloruro di cesio 5,7 M
• sodio acetato 25 mM, pH 6,4
3.6 Isolamento dell’mRNA poliA
+L’mRNA maturo e pronto per la traduzione è caratterizzato dalla poliadenilazione ossia l'aggiunta di una una sequenza poliadenilica di circa 200 nucleotidi poliA+), in modo covalente all'estremità 3'-OH. Il poliA+ svolge una funzione molecolare importante: consente infatti l'identificazione dell'mRNA differenziandolo dall' rRNA e dal tRNA, molto più numerosi a livello cellulare.
Per l'isolamento dell’mRNA poliA+ è stato usato il PolyATtract® mRNA Isolation Systems (Promega). Il sistema utilizza un primer oligo(dT) biotinilato che ha la capacità di ibridare ad alta efficienza con la regione poliA+ presente nella maggior parte dei mRNA maturi eucariotici. Gli ibridi possono poi essere recuperati usando particelle paramagnetiche (PMP) associate a streptavidina (che ha la capacità di legarsi alla biotina) ed a un supporto magnetico. 1 mg di RNA totale in un volume di 500 μl di H20DEPC è stato denaturato per 10 minuti a 65°C; sono stati aggiunti 3 μl di Biotinylated Oligo(dT) Probe e 13 μl di SSC 20x (NaCl 3 M; Na-citrato 0,3 M); il tutto è stato incubato a temperatura ambiente fino a raffreddamento per permettere la reazione di appaiamento. Contemporaneamente le particelle PMP sono state lavate e sospese in SSC 0,5X ed aggiunte poi alla reazione di appaiamento lasciando incubare a temperatura ambiente per circa 10 minuti per permettere il legame tra la biotina e la streptavidina. Catturate le particelle PMP e lavate con SSC 0,1X, sono stati in seguito eluiti gli mRNA risospendendo le particelle PMP in H20DEPC e catturandole con il magnete. La fase acquosa, contenente l’mRNA, è stata recuperata e trasferita in una nuova provetta RNAsi-free. L’mRNA è stato poi precipitato, solubilizzato in 10 μl di H20DEPC, quantizzato e conservato a -80°C per le successive analisi.
3.7 Controllo della qualità dell’mRNA poliA
+Per la costruzione delle librerie sottrattive di cDNA tramite l’SSH sono stati utilizzati gli mRNA poliA+ isolati sia dai campioni sperimentali che di controllo. Per valutare, ulteriormente, che le quantità dei campioni in esame fossero paragonabili è stata effettuata RT-PCR utilizzando come stampo sia gli mRNA poliA+ isolati da entrambi i campioni e come primers quelli del gene costituitivo G3PDH e i set di primers specifici per l’rRNA di ratto (5,8 S; 18 S e 28 S).
3.8 Costruzione delle librerie soppressive sottrattive
Per ottenere sequenze di cDNA differenzialmente espresse è stato utilizzato il metodo della ibridazione soppressiva sottrattiva (suppression subtractive hybridization, SSH), il cui impiego è stata reso possibile dall’utilizzo del PCR- Select™ cDNA Subtraction Kit (BD Biosciences). Questa metodologia permette di comparare due campioni di mRNA e ottenere librerie di cDNA arricchite di trascritti presenti soltanto in uno dei due campioni in esame (Diatchenko et al., 1996) e presenta la peculiarità di riuscire ad isolare anche sequenze poco espresse (Gurskaya et al., 1996). La tecnica della SSH comprende due ibridazioni sottrattive, seguite da due reazioni di PCR. Nella fig. 11 è rappresentato in modo schematico il processo della SSH: ci riferiamo con il termine tester al cDNA ottenuto dall’mRNA isolato dal cervello di ratto condizionato e con il termine driver all’cDNA ottenuto dall’mRNA del controllo. Il cDNA è stato sintetizzato a partire da 2 μg di mRNA di entrambi i campioni ed è stato digerito con l’enzima di restrizione Rsa I, per ottenere frammenti blunt-end. Il cDNA del tester è stato suddiviso in due aliquote ed a ciascuna è stato legato un diverso adattatore: 1 e 2R. Gli adattatori, mancando del gruppo fosfato al 5’, si legano solo all’estremità 5’ del cDNA e non possono associarsi tra loro. Il legame degli adattori rappresenta un passaggio critico per la successiva sottrazione e soppressione delle librerie. Pertanto,
risulta fondamentale verificare che tale legame sia avvenuto tramite una PCR in cui ciascun aliquota di cDNA sottoposta a legame con gli adattori viene amplificata con i primers della G3PDH e un primer interno alla sequenza degli adattori 1 e 2R (per ulteriori dettagli vedere sessione V parte C pag. 30 del
"BD PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit User Manual Cat. No. 637401 PT1117-1 (PR4Z697) published 12/20/2004). Seguono due ibridazioni sottrattive successive. La prima è stata effettuata aggiungendo a ciascun tester denaturato, driver denaturato in eccesso. Durante questa fase la maggior parte dei trascritti del tester non differenziali, si lega al driver e la rimanente frazione del tester, a singolo filamento risulta arricchita di sequenze differenzialmente espresse. Inoltre in questo passaggio la concentrazione delle sequenze poco e molto espresse viene normalizzata, perché, essendo la cinetica di ibridazione di secondo ordine, la riassociazione delle molecole più concentrate è più veloce. La seconda ibridazione è stata effettuata unendo, senza denaturare, i prodotti della prima ibridazione e aggiungendo driver denaturato in eccesso. Durante questo passaggio, oltre ad arricchirsi di sequenze differenzialmente espresse, la frazione a singolo filamento del tester 1 ibriderà con la stessa frazione nel tester 2R, formando una popolazione di sequenze differenzialmente espresse a doppio filamento caratterizzate dal fatto di essere asimmetricamente fiancheggiate dai due adattatori. Questo, insieme all’effetto soppressivo, rende possibile la loro amplificazione selettiva tramite due PCR successive utilizzando come primers sequenze complementari ai due adattatori (le cui sequenze sono riportate in fondo al paragrafo).
Fig.11: Rappresentazione schematica della tecnica della SSH.
Questa tecnica permette la costruzione di due librerie sottrattive:
la libreria forward contenente i prodotti dei geni che sono attivati o modulati positivamente in seguito a CFC, ottenuta utilizzando come tester il cDNA ottenuto dai ratti sottoposti a CFC e come driver il cDNA ottenuto dai ratti naïve;
la libreria reverse contente i prodotti dei geni inibiti o modulati negativamente in seguito a CFC, ottenuta utilizzando come tester il cDNA naïve e come driver il cDNA ottenuto dai ratti sottoposti a CFC.
Per ciascuna libreria è stata valutata l’efficienza di sottrazione per mezzo di una PCR utilizzando primers della G3PDH, gene costitutivo, come suggerito dal protocollo del PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit (BD Biosciences). Gli amplificati ottenuti dalla seconda amplificazione sono stati inseriti nel vettore di clonaggio PCR® II-TOPO vector (TOPO TA Cloning® kit, Invitrogen). I cloni ottenuti sono stati recuperati in microtetraplates da 96 pozzetti contenenti 65 μl di LB A+, messi a crescere una notte in agitazione orizzontale a 37°C e, dopo l’aggiunta di 50 μl glicerolo, sono stati conservati a –20°C.
Sequenze dei primers utilizzati per l’amplificazione delle librerie costruite con la tecnica dell’SSH
PCR primer 1 5’ –CTAATACGACTCACTATAGGGC- 3’
NESTED primer 1 5’ –TCGAGCGGCCGCCCGGCAGGT- 3’ NESTED primer 2R 5’ –AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT- 3’
3.9 Screening primario
3.9.1 Colony PCR
Per ciascun clone conservato, 1 μl di colonia è stato messo a crescere per 2 ore in 50 μl di LB A+ liquido a 37°C su agitatore orizzontale. La coltura è stata amplificata mediante PCR utilizzando le seguenti condizioni: 1 μl della coltura è stato utilizzato come stampo, poi sono stati aggiunti 2,5 μl di tampone 10x PCR EuroClone; 0,25 μl di dNTP Mix 10 mM; 0,25 μl di Primer M13F 10 μM; 0,25μl di Primer M13R 10 μM; 2,5 μl di soluzione 25 mM di MgCl2; 0,25 μl di EuroTaq DNA Polymerase, 5U/μl; i μl di H2O sterile necessari per raggiungere un volume finale di 25 μl. La reazione è stata posta nel termociclizzatore (Applied Biosciences GeneAmp PCR System 2700) ed è stata iniziata l’amplificazione con la denaturazione dello stampo a 94°C per 10 minuti seguita da 30 cicli così composti: 94°C per 30 sec, 55°C per 30 sec, 72°C per 90 sec; al termine dei cicli è stata fatta seguire una estensione finale a 72°C per 10 minuti. I prodotti di PCR sono stati analizzati su gel di agarosio al 2%.
3.9.2 Dot Blot dei prodotti della Colony PCR
Lo screening primario, mediante la tecnica degli Spot Blot, ha permesso di eliminare i cloni falsi positivi, interpretando i risultati secondo il protocollo descritto nel PCR Select Differential Screening kit User Manual (BD Biosciences). Per ciascun clone, il prodotto di PCR è stato denaturato (ad una temperatura di 95oC per 1 minuto) e, di questo, 2 µl sono stati trasferiti su membrane Hybond N+ (Amersham Biosciences) nel seguente modo: 1 µl sulla membrana che ibriderà con la sonda forward e l’altro µl sulla membrana che ibriderà con la sonda reverse. Le membrane così ottenute sono state fissate mediante Hoefer™ UVC 500 cross-linker (Amersham Biosciences) e fatte ibridare con le sonde della libreria forward e reverse. Dopo aver individuato i
cloni candidati ad essere differenzialmente espressi, è stato eseguito l’isolamento del DNA plasmidico e quindi al sequenziamento, effettuato con sequenziatore automatico.
3.9.3 Marcatura delle sonde
Le membrane sono state ibridate utilizzando come sonde i cDNA che costituiscono le librerie forward e reverse marcate con marcatura non radioattiva utilizzando DIG DNA Labelling Kit (Roche). Per la marcatura del cDNA 1μg del prodotto della seconda PCR è stato digerito con RsaI per eliminare gli adattatori 1 e 2R da ogni sequenza di cDNA. Successivamente il cDNA digerito è stato denaturato in 15 μl di H2O (ad una temperatura di 100°C per 10 minuti) e dopo averlo raffreddato in ghiaccio sono stati aggiunti:
2 μl di esanucleotidi, 2 μl di dNTP (con UTP marcato), 1 μl dell’enzima Klenow. Dopo incubazione over-night a 37°C, la reazione polimerasica è stata interrotta aggiungendo 2 μl di Na2EDTA 0,2 M (pH 8,0). Il cDNA è stato precipitato con 2,5 μl di LiCl 4 M e 75 μl di etanolo assoluto freddo; il tutto è stato lasciato per 1 ora a -80°C. Successivamente il cDNA è stato centrifugato a 12.000 g per 40 minuti a 4°C ed il pellet ottenuto è stato lavato 2 volte con etanolo al 70%. Dopo i lavaggi è stato asciugato all'aria ed infine solubilizzato in 50 μl di H2O sterile.
3.9.4 Ibridazione su filtro
Come soluzione di preibridazione è stata utilizzata la Dig Easy Hyb (Roche) in cui sono stati aggiunti i “competitori”, ovvero oligonucleotidi con sequenza complementare a quella degli adattatori utilizzati per la costruzione delle librerie sottrattive ad una concentrazione finale pari a 0,1 μM. Questo è stato
(20 ml di soluzione di preibridazione per circa 100 cm2 di membrana) alla temperatura di 68°C. Durante la fase di preibridazione le sonde marcate sono state denaturate in H2O a 100°C per 10 minuti e poi poste immediatamente in ghiaccio. Successivamente è stata preparata la soluzione di ibridazione aggiungendo la sonda marcata (25 ng/ml) ad una quantità opportuna di altra soluzione di preibridazione mantenuta a 68°C e si è proceduto quindi con l’ibridazione over-night sempre alla stessa temperatura. La sonda è stata recuperata e le membrane sono state sottoposte ad una serie di lavaggi a diversa stringenza, in dipendenza dell'omologia della sonda e della sua composizione (% in G+C). La membrana è stata lavata due volte in SSC 2X/SDS 0,1% per 20 minuti a temperatura ambiente, in agitatore orizzontale.
Poi, aumentando la stringenza, è stata lavata due volte in SSC 0,1X/SDS 0,1%
per 20 minuti a 68°C, in agitatore orizzontale. Quindi è stata equilibrata per 5 minuti con il tampone 1 e incubata per 1 ora in lenta agitazione con il tampone 2. Successivamente è stata posta per 30 minuti in lenta agitazione in una soluzione contenente l'anticorpo anti-digossigenina, diluito 1:10.000 nel tampone 2. In seguito sono stati effettuati 3 lavaggi di 15 minuti nel tampone 1 a cui è stato aggiunto Tween20 ad una concentrazione finale pari allo 0,3%;
quindi la membrana è stata equilibrata per 5 minuti con il tampone 3.
Utilizzando il metodo della visualizzazione chemioluminescente si è proceduto in camera oscura cospargendo la membrana, adagiata in una pellicola trasparente, con Lumigen CPD* (Roche) diluito 1:100 nel tampone 3 (circa 1 ml per membrane di 100 cm2). Il tutto è stato lasciato al buio per 5 minuti a temperatura ambiente, dopo di che è stata tolta la soluzione in eccesso. Sulla membrana è stata posta una lastra radiografica Hyperfilm β-max (Amersham Biosciences). Questa è stata lasciata in esposizione per circa 30 minuti. Successivamente la lastra radiografica è stata sviluppata e fissata con le soluzioni Kodak (seguendo le istruzioni fornite dalla ditta).
SOLUZIONI UTILIZZATENELLO SCREENING PRIMARIO Tampone 1
• NaCl 0,15 M
• Acido maleico 0,1 M
Portare a pH 7,5 con NaOH e autoclavare Blocking stock solution
• Sciogliere il Blocking reagent della ditta nel tampone 1 Conservare a –20°C
Soluzione di preibridazione
• Dig Easy Hyb (Roche) Tampone 2
• Blocking Stock Solution, diluita 1:10 nel tampone 1 Tampone 3
• Tris-HCl 100 mM, pH=9,5
• NaCl 100 mM
SSC 20x
• NaCl 3 M
• Na-Citrato 0,3 M
Portare a pH 7,0 con acido citrico e autoclavare SDS 10%
• SDS 10% (p/v)
3.10 Preparazione del DNA plasmidico su piccola scala
Il DNA plasmidico è stato estratto e purificato utilizzando Wizard PLUS SV Minipreps DNA Purification System (Promega) seguendo le istruzioni fornite dalla ditta. I cloni sono stati inoculati in grainer contenenti 10 ml di LB A+ e fatti crescere a 37°C su agitatore rotante per una notte. Per ogni clone, 5 ml di coltura sono stati centrifugati a 10000 rpm per 5 minuti in centrifuga da tavolo ALC 4226 in un rotore ALC 5531 (questo tipo di centrifuga viene utilizzato per tutta la preparazione). Successivamente le cellule sono state risospese delicatamente in 250 μl di Cell Suspension Solution. Sono stati poi aggiunti 250 μl di Cell Lising Solution; il campione è stato delicatamente mescolato per inversione, e lasciato a temperatura ambiente per 5 minuti. Sono stati aggiunti 10 μl di Alcaline Protease Solution e il campione è stato delicatamente mescolato per inversione e lasciato a temperatura ambiente per 5 minuti. La Alcaline Protease inattiva le endonucleasi e altre proteine rilasciate durante la lisi delle cellule batteriche che potrebbero danneggiare la qualità del DNA isolato. Al campione sono poi stati aggiunti 350 μl di Wizard Plus SV Neutralization solution ed immediatamente il campione è stato mescolato delicatamente per inversione. Il tutto è stato centrifugato a 14.000 g per 1 minuto. Il surnatante così ottenuto è stato posto delicatamente sulle colonnine fornite nel kit e centrifugato a 14.000 g per 1 minuto. Sono stati aggiunti 750 μl di Column Wash solution, e il campione è stato centrifugato a 14.000 g per 1 minuto. La procedura di lavaggio è stata ripetuta utilizzando 250 μl di Column Wash solution e centrifugando le colonnine a 14.000 g per 2 minuti.
Le colonnine sono state poste in provette sterili dove il DNA plasmidico è stato fluito con 75 μl di H2O sterile. L’operazione è stata ripetuta una seconda volta. Tutte le soluzioni utilizzate per la preparazione del DNA plasmidico su piccola scala sono state fornite dal kit. Il DNA plasmidico ottenuto per ciascun clone è stato quantizzato allo spettrofotometro e su gel di agarosio.
SOLUZIONI UTILIZZATEPERLA CRESCITA DEI CLONI Ampicillina
• soluzione stock 10mg/ml solubilizzata in Etanolo 70%
LB (Luria-Bertani) liquido
• Triptone 1% (p/v)
• Yeast extract 0,5% (p/v)
• NaCl 1% (p/v)
a pH 7,0 con NaOH
3.11 Analisi bioinformatica delle sequenze
Le sequenze nucleotidiche dei cloni selezionati, ottenute con sequenziamento automatico, sono state analizzate mediante comparazione in banca dati (GenBank) con i seguenti programmi disponibili in rete:
FASTA:
(http://www.ebi.ac.uk/fasta33/)
BLAST:
(http://www.ch.embnet.org/software/aBLAST.html)
La traduzione delle eventuali sequenze codificanti è stata effettuata con :
ExPASy Translate Tool: (http://www.expasy.org)
3.12 Analisi di espressione genica tramite RT-PCR relativa
La retrotrascrizione con la successiva PCR (RT-PCR) permette
consente di comparare la quantità di un trascritto tra più campioni mediante la coamplificazione della sequenza di interesse e di un controllo interno al fine di normalizzare le differenze tra i vari campioni dovute alla qualità dell’ RNA totale, alla variabilità dell’efficienza dell’RT o ad una quantizzazione non accurata (Gause and Adamovicz, 1995). Per questo tipo di PCR semi- quantitativa è necessario che i primers per l’amplificato del gene di interesse (target) e quelli per il controllo interno siano compatibili e che i pesi molecolari del target e del controllo interno siano simili ma tali da permettere la distinzione degli amplificati su gel d’agarosio. Per questo tipo di analisi è necessario che la reazione di PCR venga analizzata durante la fase lineare dell’amplificazione prima che entrambi i prodotti di amplificazione raggiungano la fase di plateau ossia di saturazione (Prediger, 2001)
La retrotrascrizione è stata eseguita con il kit SuperScript™ II RNase H- Reverse Transcriptase (Invitrogen) e con l’ Oligo(dT)12-18 Primer (Invitrogen) seguendo le istruzioni fornite dalla ditta, partendo da RNA totale (2μg) isolato dal cervello di ratto condizionato e dal controllo. Al fine di evitare errori di quantificazione dovuti ad una diversa concentrazione di RT o errori di pipettamento, è stato opportuno utilizzare un controllo interno, che viene coamplificato con il gene in esame. Come controllo interno è stata utilizzata la G3PDH che, essendo un gene costitutivo, presenta un’uguale espressione nel condizionato e nel controllo. Per amplificare le sequenze dei cloni in esame sono stati utilizzati primers gene-specifici costruiti con il programma disponibile in rete Primer3 (le cui sequenze sono riportate nella tab. 1). Per ogni reazione di amplificazione da 25 μl sono stati utilizzati 1 μl di retrotrascritto come stampo; 2,5 μl del tampone di reazione 10x; 0,625 μl di soluzione di MgCl2 50mM; 0,5 μl di dNTP Mix 10mM; 1,25 μl di ogni primer 10μM; 0,25 μl Euro Taq (EuroClone) 5U/μl;
H2O sterile a volume. La reazione così composta è stata posta nel termociclizzatore ed è stata iniziata l’amplificazione con la denaturazione dello stampo a 94°C per 4 min seguito da cicli così composti: 94°C per 30 sec,
60°C per 30 sec, 72°C per 30 sec per un campione di cDNA trattato e un campione di cDNA controllo; al termine dei cicli è stata fatta seguire una estensione a 72°C per 7 min a tutti i campioni.
Per conoscere il punto di saturazione, ovvero il punto in cui l’aumento del prodotto di amplificazione non è più proporzionale alla quantità di stampo iniziale, è stata effettuata una PCR dalla quale sono state sottratte aliquote di campione al termine di cicli successivi; le aliquote sono state immediatamente trasferite in un termociclizzatore adiacente dove hanno subito la fase di estensione finale di 7 min a 72°C. In questo modo è stato possibile stabilire il numero di cicli appropriato per una valutazione quantitativa relativa mediante questa tecnica. Per ogni gene in analisi sono state fatte prove multiple di RT- PCR relativa utilizzando come stampo cDNA ottenuti sia da retrotrascrizioni diverse sia da estrazioni diverse (in particolare per i cloni 1VA6 e 1VA11 sono state eseguite 4 prove; per il clone 1VB9 sono state eseguire 6 prove; per i cloni 1VB12 e 1VC1 sono state eseguite 5 prove; per il clone 1VH5 sono state eseguite 7 prove). I prodotti di PCR sono stati analizzati su gel di agarosio al 3% colorato con etidio bromuro. Gli amplificati sono stati quantizzati mediante scansione diretta del gel mediante il programma di acquisizione per immagini Quantity One-4.4.1 (basic) BioRad.
CLONE PRIMER FORWARD PRIMER REVERSE Pb
prodotto
1VA6 5'-ATGGGGAAGAAGCCCTAGAA-3’ 5'-CCTCTTTCATTACCCCCACA-3’ 251 1VA11 5’-CGAAGCCCACATAATCCAAT-3’ 5’-CACAAAGTCCCTTTGGGAAG-3’ 315 1VB9 5'-CAGGCAGGACTAGGGAGACTT-3’ 5'-AAACATTGCATTTACATTTGAGC-3’ 275 1VB12 5’-CTCGCCCATCAGTTCACTTT-3’ 5’-TCTCCGGAAAGGGTTTTCTT-3’ 298
1VC10 5’-AAACTGTTGGGTTATCATTGGAA-3’ 5’-GGCTCCAGAGAGAAGGGAAT-3’ 348 1VH5 5'-AAGGGACTCCAAGTGTGTCG-3’ 5'-5’-GAAATGAGCAGTGGGTGCTT-3’ 263
G3PDH 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ 5’- ACCACAGTCCCATGCCATCAC-3’ 452
3.12.1 Analisi statistiche dei risultati ottenuti tramite RT-PCR relativa
Per normalizzare i campioni relativamente alla quantità di RNA totale utilizzato e alla efficienza della sintesi di cDNA, è stato fatto il rapporto tra le intensità della banda del prodotto di amplificazione del clone e l’intensità della banda del prodotto di amplificazione del gene costitutivo. Questo rapporto è stato calcolato per un tutti gli esperimenti riguardanti ogni singolo clone. E’
stata effettuata poi l’analisi statistica con il Mann-Whitney test ( per i cloni 1VA6 e 1VA11) e t-test (per i cloni 1VB9, 1VB12, 1VC10 e 1VH5).
3.13 Analisi di espressione genica tramite RT-PCR REAL- TIME
La PCR real-time, denominata anche PCR quantitativa o PCR quantitativa in tempo reale (rtq-PCR), è un metodo di amplificazione e quantificazione simultanee del DNA. I metodi comuni di quantificazione includono l'uso delle colorazioni fluorescenti che intercalano con il DNA a doppio-filamento e gli oligonucleotidi modificati del DNA (sonde) che sono flourescenti una volta ibridati con DNA. La PCR real-time sostituisce la RT-PCR relativa per quantificare i livelli di espressione di specifici RNA. Nei nostri laboratori è stato messo a punto un protocollo di PCR real-time basato sul sistema di rilevazione SYBR-Green. L’ottimizzazione di questo protocollo ha permesso di rilevare modificazioni dell’espressione genica di trascritti individuati in seguito allo screening delle librerie costruite tramite la tecnica dell’SSH.
Come materiale di partenza è stato utilizzato l’RNA totale isolato dalle sezioni medio-temporali di cervelli di ratti sottoposti a CFC e di ratti naїve. Per testarne la qualità, prima di procedere alla successiva analisi tramite PCR real- time, l’RNA totale estratto è stato analizzato su gel denaturante di agarosio.
Per rimuovere eventuali tracce di DNA genomico i campioni di RNA sono
stati trattati con la Deoxyribonuclease I Amplification Grade (Sigma) e successivamente quantificati tramite l’analisi spettrofluorimetrica. Ogni reazione di sintesi del cDNA è stata eseguita a partire da 1 μg di RNA totale utilizzando l’iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) in un volume finale di 20 μl in accordo con le istruzioni fornite dalla ditta. La PCR real-time è stata eseguita utilizzando il SYBR Green e il termociclizzatore MiniOpticon System (Bio-Rad). La mix finale di reazione conteneva 1 μl di cDNA, 300 nM di ciascun primer, 7,5 μl di iQ SYBER Green Supermix (Bio-Rad) e H2O RNAsi- free fino a raggiungere un volume finale di 15 μl. Le sequenze dei primers utilizzati sono mostrati in tabella 2. Tutte le reazioni sono state eseguite in triplicato. Come controlli negativi sono state eseguite reazioni in cui il cDNA stampo è stato sostituito da un ugual volume di acqua sterile. Per ciascuna reazione l’amplificazione è iniziata con la denaturazione dello stampo a 95°C per 3 minuti, seguita da 40 cicli così composti: a 95°C per 10 secondi, a 60°C per 20 secondi. Al termine di ciascuna reazione è stata eseguita la curva di dissociazione (o curva di melting) per valutare la qualità dei prodotti ottenuti.
Prima di ogni esperimento l’efficienza di amplificazione è stata valutata per ciascuna coppia di primers. Le sequenze, l’efficienza dei primer utilizzati e le paia basi dei prodotti ottenuti sono stati riportatati in tabella 2. Come geni housekeeping sono stati utilizzati la G3PDH e la ribosomal protein L13A (RPL13A) che non risultano modulati dal CFC.
3.13.1 Quantizzazione dei livelli di espressione genica:
metodo del 2
-ΔΔCTLa valutazione relativa dei cambiamenti nell’espressione genica è stata
calcolare il ciclo della PCR in cui i segnali di amplificazione specifici sono separabili da quelli del rumore di fondo del sistema. Il numero dei cicli necessari perché un campione raggiunga il suo CT è inversamente proporzionale al numero di copie del target presente inizialmente in ogni campione. Il vantaggio in termini di precisione e di intervallo di quantificazione rispetto alla PCR tradizionale, è dovuto alla possibilità di quantificare il DNA al ciclo soglia, che è sempre calcolato nella fase esponenziale della reazione PCR, fase in cui i reagenti sono ancora lontani dall’esaurimento e gli elementi di variabilità sono ridotti al minimo.
3.13.2 Analisi statistica dei risultati ottenuti tramite RT-PCR real time
L’analisi statistica è stata eseguita tramite l’unpaired Student t-test. Le differenze tra i campioni naïve e CFC sono risultate statisticamente significative con una p < 0.05. L’analisi statistica è stato eseguita utilizzando il software PRISM (versione 4.0, Graph Pad Software Inc., San Diego, CA).
NOME SEQUENZA FORWARD SEQUENZA REVERSE Pb prodotto
% efficienza
1VG5 5’- GAGCGGATGAATCTGAGGAGGAG-3 5’-TTTGATGTATCGGTACTGCTTGGG-3’ 100 100 2VB10 5’-CATTGTCCTCTCTGGTGGTTCAAC-3’ 5’-CTCAACTTCAGCCTGGCATCTAC-3’ 95 100
4VC4 5’-CAGAGCAGCCACCAGGACTTC-3’ 5’-AGGGCATCCGTAGCATTGAACTC-3’ 200 100 2VC7 5’-CAGTCCCCTCCTCAAGTACAGC-3’ 5’-TCCTCATACTTCTGAACAGCAAGC-3’ 107 100
4VC12 5’-CAACCTGACGCTTGTGGATTTACC-3’ 5’-CAGCAGTGACAGCAAGGATAATGG-
3’ 139 100
4VF8 5’-TACAACAGACTCTTCCACCACCAG-3’ 5’-CATTCCACATCATCCTCAGCCAAG-3’ 108 100 2VG1 5’-AGGCTTGGAGCACTTGTGAG-3’ 5’-GTGAACCGTTTCTGCCCTTA-3’ 148 100 5VD5 5’-GCAGCCTCTCCCATCTACCT-3 5’-ACCCTTGGGAATCATGACAG-3’ 239 100 5VE10 5’-ACGACCAGGAGCAAGCAGAG-3’ 5’-AAATCAAACGGGAGGAGCAGAAG-3’ 193 100 5VH4 F 5’-AGCCGCAGGTCCAGTTCAAG-3’ 5’-TGATGGGTCCTCTGTTGGTATGG-3’ 161 100
5ND3 5’-GACCCACTCACCCATGTCTC -3’ 5’-AAATCAGTGCTTGTCGTCCA -3’ 59 100 5VD6 5’-GCTGTCAGTCAGAGCGTAAGG-3’ 5’-CACAAGGTGGGTCCAACTAGC-3’ 125 100 5VF8 5’-CTCTCAGACAAGCGGCAGATTG -3’ 5’-TGTTCCCAAAGCAAACCATCACG -3’ 120 100 7VB6 5’-GTGCTGTATTGACTGTGGAAGAC-3’ 5’-AGAATTGGGATCGCAAAGTGAAC-3’ 98 100 G3PDH 5’-CTACCCACGGCAAGTTCAAC-3’ 5’-CCAGTAGACTTCCACGACATAC-3’ 237 100 RPL13aR 5’- CCTTTTCCTTCCGTTTCTCCTC-3’ 5’- TTGCTTACCTGGGGCGTCT -3’ 87 100
Tab.2: Sequenze dei primers utilizzati nella RT-PCR real time.
