Malgré les progrès accomplis ces dernières années, la survie des patientes atteintes d’un cancer du sein stagne autour de 70 % à cinq ans. Les indications thérapeu- tiques sont basées sur des facteurs pronostiques (« choix du patient ») et prédictifs de la réponse thérapeutique (« choix du protocole ») qui, globalement, ont peu évolué depuis une quinzaine d’années. Ces facteurs, histologiques, cliniques et moléculaires, sont insuffisants pour rendre compte de l’hétérogénéité évolutive de la maladie, conduisant un certain nombre de patientes vers des traitements inadaptés, toxiques, inutiles ou inefficaces, et traduisant l’existence de sous-classes pronostiques non identifiées par ces approches classiques. Etant donné la disponi- bilité croissante de nouvelles molécules anti-tumorales, il est crucial d’améliorer la classification pronostique du cancer du sein pour affiner les indications thérapeu- tiques et améliorer la survie des patientes.
Face aux limites des approches conventionnelles, il est apparu que de nouvelles percées thérapeutiques ne seraient possibles qu’à travers une caractérisation molé- culaire plus globale, détaillée et objective de la maladie. Le cancer du sein est une maladie génétique complexe, caractérisée par l’accumulation et la combinaison de multiples altérations moléculaires qui confèrent à chaque tumeur un phénotype et un potentiel évolutif propres. La nécessité d’une compréhension approfondie de la maladie au niveau moléculaire se heurtait donc jusqu’à présent à des contraintes techniques, donnant peu d’informations par rapport à la complexité du processus.
Depuis quelques années, la recherche biomédicale connaît une véritable révolution avec l’apport de la génomique, fruit de deux facteurs : les avancées et les ressources sans cesse croissantes produites par le projet Génome humain (clones d’ADN, séquences de gènes, de protéines…) et l’essor de nouvelles technologies (bio-infor- matique, robotique…) capables de les exploiter. Les techniques d’analyse molécu- laire à grande échelle qui ont ainsi été récemment développées permettent d’ana- lyser l’activité de plusieurs milliers de gènes ou protéines simultanément, dans un échantillon en une expérience, rendant plus abordable la complexité moléculaire des tumeurs. L’hypothèse, confirmée par les travaux publiés, est que l'étude d'une
ADN dans le cancer du sein : choix du patient, choix du protocole
F. Bertucci
combinaison de molécules impliquées dans un phénotype complexe est plus infor- mative que chaque molécule prise isolément. Pour des raisons techniques, ce typage à grande échelle s’est d’abord focalisé sur l’étude du transcriptome (ensemble des ARN d’un échantillon) au moyen de la technique des puces à ADN qui mesurent de manière quantitative le niveau d’expression au niveau de l’ARN (1, 2). Les applica- tions attendues sont multiples aux niveaux fondamental, clinique et thérapeutique (3). Au niveau clinique, plusieurs publications ont notamment suggéré l’impact de cette approche dans l’évaluation pronostique des tumeurs, le cancer du sein en par- ticulier.
Puces à ADN ou DNA micro-arrays
Le principe repose sur l'hybridation d'un jeu ordonné de gènes cibles (représentés par des clones d’ADN complémentaire ADNc ou des oligo-nucléotides) immobi- lisés sur un support solide (puce ou array) avec une sonde complexe produite par rétro-transcription et marquage à partir d'un ARN d'intérêt (figure 1). Elle est dite complexe car elle contient, en solution, de nombreuses séquences d'ADNc en quan- tités variables, correspondant aux abondances des espèces d'ARNm dans l'ARN de départ. L’hybridation sur la puce aboutit à la fixation sur chaque gène cible d’une quantité de l’espèce correspondante d’ARNm de la sonde, proportionnelle à son abondance dans l’ARN de départ. Après lavage et acquisition de l’image d’hybrida- tion, le signal fixé sur chaque cible est détecté, quantifié et enregistré de façon auto- matique grâce à des logiciels d’analyse. Ce signal reflète la concentration de la séquence correspondante dans la sonde, donc le niveau d'expression du gène concerné. Les intensités obtenues sont ensuite normalisées, permettant de dresser pour chaque échantillon (une tumeur, par exemple) un véritable portrait molécu- laire qui pourra alors être comparé à celui d’autres échantillons. L’objectif de cette analyse comparative est l’identification d’une signature moléculaire (combinaison de plusieurs gènes) permettant de définir de nouvelles classes de tumeurs sur la seule base de leur profil d’expression (approches non supervisées) et/ou de caracté- riser des classes de tumeurs associées à un phénotype d’intérêt (la survie par exemple, approches supervisées) (4). Elle fait appel à des outils bio-informatiques sophistiqués traitant l’énorme quantité des données produites.
268 Cancer du sein
Figure 1 - Principe de la mesure d’expression génique sur puces à ADN.
Profils d’expression et pronostic
Plusieurs études rétrospectives ont suggéré le potentiel pronostique des puces à ADN en cancérologie mammaire à travers l’identification de nouvelles classes pro- nostiques non identifiables par les moyens conventionnels, dans des groupes de tumeurs d'apparence histo-clinique homogène, mais hétérogènes sur le plan évo- lutif. Ces études ont porté sur la recherche de profils d’expression associés à la survie sans ou avec traitement systémique (chimiothérapie CT et/ou hormonothérapie HT) en situation adjuvante (analyse de la tumeur réséquée) ou néo-adjuvante (ana- lyse de la biopsie tumorale avant CT), dans des formes localisées ou localement avancées.
Lors d’une étude pilote analysant l’expression d’environ 200 gènes candidats dans une série de 34 cancers du sein localisés, nous avons identifié, parmi des tumeurs de mauvais pronostic traitées par CT adjuvante, deux classes d’évolution différente en terme de survie. Cette discrimination résultait de l’expression différen- tielle de 23 gènes (5). Nous avons ensuite analysé l’expression d’environ 1 000 gènes, incluant les 200 précédents, dans une population théoriquement homogène de 55 tumeurs localisées, de mauvais pronostic (6). Toutes les patientes avaient reçu une CT adjuvante à base d’anthracyclines. Nous avons dans un premier temps validé l’intérêt pronostique de notre jeu de 23 gènes dans cette série indépendante de tumeurs. Une analyse plus approfondie a ensuite identifié une signature de 40 gènes, directement dérivée de la précédente, qui affinait la classification en dis- tinguant trois classes de patientes équilibrées sur les facteurs pronostiques clas- siques, mais présentant une survie globale et sans métastase significativement diffé- rente sur un suivi médian de cinq ans (figure 2). Une étude de validation rétrospec- tive est en cours aujourd’hui au niveau uni- et multicentrique.
Figure 2
– Représentation en 2D des résultats de classification hiérarchique des 55 tumeurs en fonc- tion de l’expression respective des gènes du cluster I (25 gènes corrélés à ESR1 qui code pour RE) et des gènes du cluster II (15 gènes). Pour chaque classification (attention, celle concernant les gènes du cluster II a été pivotée de 90° pour des raisons de représentation graphique), chaque ligne représente un gène et chaque colonne représente une tumeur. Les gènes sont référencés par leur symbole LocusLink et les tumeurs par un numéro. Les numéros des tumeurs avec une évolution fatale sont notés en rouge. Pour chaque gène, les niveaux d’expression sont rapportés au niveau d’expression médian à travers toutes les tumeurs et sont représentés par une échelle de couleur allant du vert pour les gènes sous- exprimés au rouge pour les gènes sur-exprimés. La classification hiérarchique a été appli- quée aux échantillons et aux gènes sur la base d’une similarité des niveaux d’expression génique : les échantillons les plus similaires entre eux sont regroupés sur l’axe horizontal, de même que les gènes sur l’axe vertical. La longueur des branches du dendrogramme reliant les éléments reflète leur degré de similarité. La représentation croisée en 2D définit quatre groupes de tumeurs (A, B, C et D). Les carrés noirs indiquent les patientes en vie au dernier suivi et les carrés rouges les patientes décédées de leur maladie. Trois classes de patientes (A, B+C, D) sont définies avec une survie significativement différente.
– Courbe de survie sans métastase pour les trois classes.
– Courbe de survie globale pour les trois classes.
270 Cancer du sein
Figure 2 - Classification pronostique de 55 cancers du sein localisés en fonction de l’expres- sion de 40 gènes discriminants.
Une équipe hollandaise a abordé le problème du sur-traitement par CT adjuvante des tumeurs localisées sans envahissement ganglionnaire N- (7). Les auteurs ont mesuré l’expression d’environ 25 000 gènes dans une série de 97 cancers du sein non traités par CT adjuvante. Les patientes étaient sélectionnées de telle sorte qu’une moitié avait développé des métastases dans les cinq ans et l’autre moitié en était indemne au-delà de cinq ans. Une analyse supervisée réalisée sur 78 échantillons a identifié un jeu discriminant de 70 gènes qui prédisait correctement le devenir cli- nique dans 83 % des cas. Ce jeu a ensuite été validé sur les 19 échantillons indépen- dants restants. Les auteurs ont ensuite comparé le nombre de patientes qui auraient été candidates à une CT adjuvante selon les critères consensuels de Saint-Gallen et du NIH, ou selon ce prédicteur à 70 gènes. Les critères classiques auraient conduit à traiter environ 95 % des patientes qui ont rechuté et 70 à 91 % de celles qui n’ont pas rechuté, alors que le critère moléculaire aurait permis de traiter un nombre identique de patientes qui ont rechuté (91 %), mais un nombre bien inférieur parmi celles qui n’ont pas rechuté (27 %). Cette signature moléculaire a été analysée secon- dairement sur une série de 295 tumeurs avec et sans atteinte ganglionnaire (8) et son impact pronostique a été confirmé sur l’ensemble de la série, mais également chez les patientes N- et les patientes N+.
Une troisième étude s’est intéressée au cancer du sein localement avancé (9).
L’équipe de Stanford a mesuré l’expression d’environ 8 000 gènes dans un jeu de 78 tumeurs du sein comprenant une majorité de formes localement évoluées chez des patientes traitées par doxorubicine en néo-adjuvant. Les auteurs ont défini un jeu de 496 gènes dont l’expression définissait cinq classes de tumeurs différentes du point de vue de leur signature transcriptionnelle et de la survie à long terme. Ces classes étaient reliées au type cellulaire à l’origine de la tumeur et à certaines don- nées d’immuno-histochimie. Les tumeurs négatives pour le récepteur aux estro- gènes (RE-) étaient subdivisées en une classe présentant un profil d’expression proche de celui des cellules épithéliales basales, une classe qui sur-exprimait un groupe de gènes contenant ERBB2 et une classe présentant un profil proche du tissu mammaire normal. Les tumeurs RE+ présentaient un profil d’expression proche des cellules épithéliales luminales et étaient subdivisées en deux classes (luminal A et luminal B) de survie différente. Ces résultats ont été confirmés par la même équipe sur un jeu plus étendu de 115 tumeurs (incluant les 78 tumeurs précédentes) et sur deux séries de données publiées par deux autres équipes et disponibles sur Internet (10). Ces sous-types moléculaires cliniquement et biologiquement rele- vants ont été aussi validés par C. Sotiriou et al. sur 99 tumeurs localisées analysées sur des puces contenant 7 650 gènes (11), renforçant encore la validité de cette clas- sification.
Une autre étude à visée pronostique a été rapportée en 2002 par une équipe alle- mande (12) et concernait, en fait, toutes les formes cliniques du cancer du sein, des stades localisés aux stades métastatiques. Il s’agissait de l’actualisation avec les don- nées de survie d’une étude publiée l’année précédente (13). Les auteurs ont classé 55 tumeurs en fonction de l’expression de 41 gènes, et ont identifié une classe de patientes présentant une survie sans métastase significativement inférieure aux autres classes. Cependant, certains aspects méthodologiques cliniques de cette étude apparaissent peu rigoureux : l’analyse de survie n’a pas pris en compte les tumeurs 272 Cancer du sein
T4, et des paramètres pertinents pour le pronostic tels que le traitement, l’âge des patientes, le statut RE, le grade et le type histologique des tumeurs n’ont pas été mentionnés. Aucune étude n’a été publiée ensuite par ce groupe sur le sujet.
Plus récemment, E. Huang et al. (14) ont analysé l’expression de plus de 12 000 gènes (puces Affymetrix) dans une série de 89 cancers du sein localisés. L’étude pro- nostique a porté sur 52 tumeurs ayant 1 à 3 ganglions axillaires envahis (18 rechutes à trois ans contre 34 sans rechute). La méthode d’analyse était originale et utilisait, non pas les gènes individuellement, mais 496 métagènes préalablement définis par k-means clustering afin de réduire la multidimensionnalité du jeu de données. Par une méthode de « partitionnement successif » des échantillons, les auteurs ont iden- tifié un prédicteur moléculaire multigénique permettant de classer correctement 90 % des cas (estimation par la méthode leave-one-out cross-validation).
Enfin, l’étude la plus récente a été publiée en juin 2004 (15). Elle concernait le pronostic des formes localisées traitées par HT adjuvante. Les auteurs ont analysé l’expression de plus 22 000 gènes (puces Agilent) dans une série de 60 cancers du sein localisés RE+ traités en adjuvant par tamoxifène. L’analyse parallèle des échan- tillons tumoraux « entiers » et micro-disséqués a permis de réduire la liste des gènes associés à la rechute métastatique à deux gènes HOXB13 et IL17BR. Le ratio de l’ex- pression des deux gènes représentait un facteur pronostique fort et indépendant en analyse uni- puis multivariée, qui a été ensuite validé sur les mesures d’expression définies par RQ-PCR sur les mêmes échantillons congelés, mais aussi sur 20 échan- tillons indépendants inclus en paraffine. Il s’agit de la première étude par puces à ADN s’intéressant à l’évolution sous HT.
Profils d’expression et réponse à la chimiothérapie
Trois études rétrospectives récentes se sont intéressées plus directement à la réponse à la CT dans le cancer du sein localisé et localement avancé, traité par CT première.
Toutes suggèrent le potentiel des profils d’expression définis sur puces à ADN dans la prédiction de cette réponse.
La première a été rapportée dans le Lancet par l’équipe du Baylor College de Houston (16). L’analyse, réalisée sur puces à 12 000 gènes (Affymetrix), a concerné 24 tumeurs localement avancées traitées par 4 cures de taxotère en néo-adjuvant.
L’analyse supervisée a identifié un jeu de 92 gènes dont l’expression était corrélée à la réponse clinique (12 répondeurs et 12 non-répondeurs). En expérience de cross- validation, le taux de classifications correctes était de 88 %.
La seconde étude a été rapportée par l’équipe du MD Anderson (17). Les auteurs ont analysé l’expression de 30 721 clones (puces personnelles) dans 42 cancers du sein T2-T4 traités par un schéma séquentiel de CT délivrant 12 cures hebdoma- daires de Taxol®, suivies de 4 cures de FAC en néo-adjuvant. L’analyse supervisée portant sur la réponse histologique après CT dans un learning set de 24 tumeurs (13 RCH ou réponse complète histologique et 11 non-RCH) a identifié une signa- ture de 74 clones dont l’expression classait correctement 78 % des tumeurs du vali- dation set (18 tumeurs).
La dernière étude concerne le cancer du sein inflammatoire (18). Nous avons analysé l’expression de 8 000 clones (puces personnelles) dans 37 cancers du sein inflammatoires. Pour 26 patientes, la réponse histologique à une CT première à base d’anthracycline était documentée, incluant 9 RCH+ et 17 RCH-. Par analyse super- visée, nous avons identifié un jeu de 85 gènes discriminants dont l’expression com- binée permettait de séparer cette population en deux groupes présentant respecti- vement 70 % de RCH pour l’un et 0 % pour l’autre (figure 3).
Figure 3 - Classification pronostique de 26 cancers du sein inflammatoires en fonction de l’expression de 85 gènes discriminants. Les gènes sont ordonnés de haut en bas en fonction de leur score discriminant mesuré en analyse supervisée. Les tumeurs sont ordonnées de gauche à droite en fonction du coefficient de corrélation de leur profil d’expression avec le profil médian des tumeurs en réponse complète histologique (RCH). La ligne orange définit deux classes de tumeurs ayant des taux de RCH significativement différents (rectangle noir, RCH ; rectangle blanc, absence de RCH).
274 Cancer du sein
Conclusion
Dans toutes ces études, les signatures multigéniques pronostiques et/ou prédictives paraissaient plus performantes que les classifications conventionnelles basées sur des facteurs histo-cliniques et moléculaires. Des études de validation sont, bien entendu, nécessaires avant toute application clinique sur de plus grandes séries rétrospectives de patientes. Certaines sont en cours de manière uni- ou multicen- trique, et précèderont l’éventuelle incorporation de ces signatures dans des essais cliniques prospectifs, premier niveau d’application clinique de cette approche.
Le succès de ces études dépendra de collaborations étroites entre chercheurs de dif- férentes disciplines (cliniciens, anatomo-pathologistes, biologistes, bio-informati- ciens, mathématiciens…), de la qualité et de la quantité des échantillons tumoraux disponibles (avec leurs annotations informatisées cliniques, histologiques et molé- culaires), de l’amélioration de la technologie et des outils d’analyse, et, bien sûr, du bon design des essais.
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