INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE

INTRODUZIONE

ALLA PARTE

SPERIMENTALE

Introduzione alla parte sperimentale

38 L’Alzheimer è la patologia neurodegenerativa più comune nella popolazione anziana, è una malattia geneticamente complessa, progressiva ed irreversibile, caratterizzata clinicamente non solo da una perdita precoce e graduale della memoria, ma anche da disturbi cognitivi e comportamentali.

Le cause neuropatologiche dell’AD non sono tutt’ora completamente note. Tuttavia ci sono diversi fattori coinvolti nella patogenesi, tra cui la diminuzione dei livelli di ACh, l’accumulo extracellulare di placche Aβ-amiloidi, la formazione di grovigli neurofibrillari, l’insorgenza di stress ossidativo/nitrosativo, la dis-omeostasi di ioni metallici quali Cu, Zn, Fe e Al, l’eccitotossicità e la neuroinfiammazione.

In particolare, tra questi fattori, lo stress ossidativo sembra giocare un ruolo chiave nella patogenesi.

Lo stress ossidativo è dovuto sia ad un aumento della produzione di specie reattive quali ROS o RNS sia ad una diminuzione nella concentrazione di specie antiossidanti come glutatione, vitamina E, acido ascorbico, superossido dismutasi (SOD).

La sovrapproduzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) quali perossido, ossido nitrico e nitrato, è responsabile dell’apoptosi e del danno cellulare.40

Anche la formazione di placche β-amiloidi contribuisce all’aumento nella produzione di specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto e alla deplezione degli antiossidanti endogeni. Le maggiori fonti di ROS nel SNC sono: i mitocondri, i metalli pesanti (Fe, Cu), la microglia, l’Aβ: tali sostanze sembrano svolgere il loro ruolo interagendo con biomolecole come lipidi, proteine e acidi nucleici, costituendo ulteriori prodotti neurotossici rilevati principalmente nella corteccia frontale e temporale dei pazienti con AD, i quali amplificano il danno ossidativo.41 (Fig.30)

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Figura 30:Effetti tossici indotti dall’interazione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) con ioni metallici quali il rame nell’AD.

Inoltre anche l’eccitotossicità (Fig.31), dovuta ad una eccessiva stimolazione dei recettori ionotropici del glutammato (recettori NMDA) determina un aumento della permeabilità della membrana cellulare al passaggio del Ca2+, con conseguente incremento dei livelli di tale ione all’interno del neurone. A livello mitocondriale, all’aumento della concentrazione del calcio corrisponde una riduzione della produzione di ATP e aumento della produzione di ROS.

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Figura 31: Aumento della concentrazione di calcio intracellulare a seguito della stimolazione dei recettori glutammatergici (NMDA e AMPA).

Tra i fattori capaci di regolare la concentrazione intracellulare di calcio e quindi lo stress ossidativo si annovera anche l’H2S.

L’H2S è considerato come il terzo più abbondante trasmettitore endogeno gassoso dopo

l’ossido nitrico (NO) e il monossido di carbonio. L’H2S è prodotto fisiologicamente

dalla L-cisteina e dall’omocisteina (Hcy) ad opera di due enzimi: cistationina β-sintasi (CBS) e cistationina γ-liasi (CSE). La CBS è espressa principalmente nel sistema nervoso centrale (CNS), mentre l’enzima CSE è espresso principalmente nel sistema cardiovascolare.10

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41 Nei cervelli dei pazienti affetti da AD è stata osservata una drastica riduzione dell’attività dell’enzima CBS e una conseguente marcata riduzione dei livelli di H2S

(circa il 50%).

La sua capacità di regolare la concentrazione intracellulare di ioni calcio sembra essere legata alla sua attività neuromodulatoria mediata dai recettori ionotropi del glutammato NMDA e AMPA.(Fig. 31)

Evidenze sperimentali sia in vivo che in vitro hanno inoltre indicato che l’H2S è capace

di prevenire il deterioramento neuronale e attenuare le disfunzioni cognitive nei modelli sperimentali di AD; i meccanismi alla base del ruolo protettivo dell’ H2S nell’ AD coinvolgono sia le sue proprietà antiossidanti e apoptotiche, ma anche effetti anti-infiammatori. (Fig.32)

Figura 32: Ruolo svolto dall’H2S nella neuromodulazione, nel processo infiammatorio e nella citoprotezione

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42 E’ stato infatti dimostrato che l’idrosolfuro di sodio (NaHS), capace di generare H2S in

vivo, riduce drasticamente il rilascio di citochine proinfiammatorie quali TNF-α, IL-1β e IL-6 indotto dai peptidi β-amiloidi. Inoltre, inibisce la sovraregolazione della COX2 e l'attivazione di NF-kB nell’ ippocampo, indicando così un elevato valore potenziale nella terapia per l’AD.42

In considerazione del fatto che le terapie farmacologiche per l’AD indirizzate verso un unico target molecolare risultano attualmente insoddisfacenti e tenendo presente che sia lo stress ossidativo che la ridotta produzione di H2S costituiscono due fattori patologici

importanti nella patogenesi dell’ AD, in questa tesi di laurea sono state sintetizzate nuove molecole multifunzionali che dovrebbero essere in grado di agire simultaneamente su più target biologici coinvolti nella patologia stessa quali ad esempio il sistema colinergico (AChE e BuChE), lo stress ossidativo e la neuroinfiammazione.

In particolare le molecole sintetizzate sono state ottenute:

(a) attraverso la combinazione di un inibitore dell’AChE e porzioni molecolari capaci di chelare metalli quali Cu, Fe, che contribuiscono allo stress ossidativo. (b) attraverso la combinazione di inibitori dell’AChE e porzioni molecolari capaci

di donare H2S in vivo.

Per la sintesi dei nuovi composti è stato selezionato quale inibitore dell’AChE la rivastigmina. Tale farmaco è ampiamente utilizzato per l’AD. Analogamente ad altri derivati che presentano la funzione carbammica, inibisce l’AChE attraverso la carbamoilazione della Ser203 presente nel sito catalitico dell’enzima, indicando quindi che la porzione farmacoforica è rappresentata dalla funzione N-etil-N-metilcarbammica. La Rivastigmina ha un’ottima capacità di penetrare la barriera emato-encefalica, mostra una maggiore affinità per l’AChE cerebrale rispetto ad altri inibitori dell’AChE, ed è inoltre un potente inibitore della BuChE la cui attività sembra essere associata alla formazione di placche Aβ e grovigli neurofibrillari.43

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43 Le molecole 1 e 4 sintetizzate sono state ottenute attraverso la combinazione della porzione farmacoforica della rivastigmina (N-etil-N-metilcarbamoile), con una porzione 2-idrossibenzilamminica dotata di proprietà chelanti. Inoltre sono state sintetizzate le molecole 2 e 3 attraverso la combinazione di frammenti molecolari della rivastigmina con porzioni capaci di rilasciare in vivo H2S quali ad esempio l’ ADT-OH

(4-idrossifenilditiol-2-tione) (2) e l’acido 4-isotiocianatobenzoico (3).

2- idrossibenzilammina Linker Porzione N-etil-N-metilcarbammica

2-idrossibenzilammina Linker Porzione

N-etil-N-metilcarbammica NH O N O CH₃ CH₃ OH 1 OH NH O N O CH₃ 4

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44 ADT-OH Linker Porzione

N-etil-N-metilcarbammica

NH

O

N

O

O

O

S S

S

2

Introduzione alla parte sperimentale 45

SCHEMA 1

+

Reagenti e condizioni: (I) NaHCO3, trifosgene, CH2Cl2, 10-15 °C, 12h; (II) Et3N,

95°C, reflusso, 15h; (III) EtOH, Pd/C, H2, t.a, 12h; (IV) (a)EtOH, t.a. 4h;(b) NaBH4,

0°C, 2h (V) a)NaHCO3, trifosgene, CH2Cl2, 10-15°, 4h b) Et3N, 95°C, reflusso 10-15h.

La sintesi dei composti 1 e 2 è stata effettuata seguendo la procedura sintetica illustrata nello schema 1.

La reazione di sostituzione tra il trifosgene e la N-etil-N-metilammina in presenza di NaHCO3 ha fornito il derivato 5. L’N-etil-N-metilcarbamoilcloruro 5 è stato fatto

reagire con il 3-nitrofenolo (6) in presenza di Et3N, a fornire il derivato 7.

L’idrogenazione catalitica del gruppo nitro del carbammato 7, in presenza di Pd/C, ha fornito la corrispondente ammina 8.

La successiva reazione di amminazione riduttiva dell’anilina 8 con la salicilaldeide ha fornito il derivato 1.

Mentre il carbammato 2 è stato sintetizzato attraverso la formazione del

carbamoilcloruro del derivato anilinico 8 (che non è stato isolato) e successiva aggiunta del derivato fenolico 9 e Et3N.

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SCHEMA 2

Reagenti e condizioni: (I) THF, DCC, 70°, reflusso, 12h; (II) MeOH, NH2NH2, FeCl3,

carbone, 65°, reflusso, 12h; (III) soluzione di NaHCO3 (0.4M), tiofosgene, t.a, 2h.

La sintesi del composto 3 è stata effettuata seguendo la procedura sintetica illustrata nello schema 2.

La reazione di condensazione fra l’acido para-nitrobenzoico (10) e il derivato anilinico

8 ha fornito l’ammide 11. La successiva reazione di riduzione del nitro gruppo con

idrazina idrata in presenza di tricloruro ferrico ha fornito l’anilina 12.

Il composto desiderato 3 è stato sintetizzato per reazione di 12 con tiofosgene.

O2N COOH 10 + N H₂ O N O 8 NH O N O O O2N 11 O NH O N O N H₂ 12 O NH O N O SCN 3 I II III

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SCHEMA 3

+

Reagenti e condizioni: (I) Et3N, 95°C, reflusso, 15 h; (II) EtOH, Pd/C, H2, t.a, 12h;

(III) EtOH, salicilaldeide, t.a. 5h.

La sintesi del composto 4 è stata effettuata seguendo la procedura sintetica illustrata nello schema 3.

Il 3-idrossibenzonitrile commerciale (13) è stato sottoposto a reazione con l’etil N-metilcarbamoilcloruro 5, in presenza di Et3N, a fornire il derivato 14. Successivamente

per idrogenazione catalitica del nitrile del derivato carbammico 14, in presenza di Pd/C, è stata ottenuta la corrispondente ammina 15. Il composto desiderato 4 è stato sintetizzato tramite amminazione riduttiva tra la benzilammina 15 e la salicilaldeide.

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SCHEMA4

Reagenti e condizioni: (I) solfuro, 145°, 6h; (II) piridina cloridrato, 215°, 25 min.

Il derivato fenolico 9 necessario per la sintesi del prodotto finale 2, è stato sintetizzato come riportato nello schema 4.

L’anetolo (16) è stato fatto reagire con l’N,N-dimetilacetammide e zolfo a 145°C ed ha fornito il composto 17. La successiva reazione di demetilazione con la piridina cloridrato ha fornito il fenolo desiderato 9.

H₃CO 16 + O N H₃CO S S S 17 HO S S S 9 I _II