54 PREMESSA E SCOPO DELLO STUDIO
Accanto alla risposta proinfiammatoria nella malattia celiaca è stato documentato un deficit della funzione immunoregolatoria (78, 79, 80, 81). Nella mucosa dell’intestino dei pazienti celiaci è stata riportata la coespressione di citochine proinfiammatorie e regolatorie (82, 83). L’IL10 viene principalmente prodotta dalle cellule T CD4+ nella fase precoce dell’attivazione immunologica e si riduce nella celiachia attiva, in correlazione inversa, quindi, con la produzione di interferon γ (84). La percentuale di linfociti T regolatori CD4+CD25+ sia di derivazione timica sia indotte perifericamente durante il processo infiammatorio che esprimono il fattore di trascrizione Foxp3 (forkhead box P3), con ruolo cruciale nel controllo dell’infiammazione intestinale, è significativamente più alta nella mucosa intestinale dei celiaci non trattati rispetto ai pazienti a dieta aglutinata ed ai controlli sani; tale percentuale correla con il livello di danno istologico (80, 84,85). Anche Frisullo e coll. (86) hanno riportato un’espressione più elevata di Foxp3 nelle cellule T CD4+CD25+ presenti nel sangue periferico dei pazienti con celiachia attiva, seguita da una riduzione significativa dopo l’inizio del trattamento dietetico. Inoltre, sono stati isolati dalla mucosa intestinale di pazienti celiaci in remissione dopo stimolazione con peptidi gliadinici e in presenza di IL10 cloni di cellule regolatorie Tr1 gliadina-specifici, DQ2 ristretti e in grado di produrre IL10 (87). Nel complesso, questi dati suggeriscono il tentativo dei meccanismi regolatori di contrastare la risposta immunitaria proinfiammatoria. La recente letteratura ha dimostrato che le cellule T regolatorie isolate da
55 celiaci a dieta libera sono funzionalmente attive (84, 85); tuttavia esse sono incapaci di inibire la risposta immunitaria effettrice; questa perdita di funzione sembra essere correlata al livello di danno istologico; nella celiachia trattata, con il conseguente ripristino della architettura mucosale, la loro funzione soppressiva è stata trovata di entità paragonabile a quella controlli, suggerendo un processo infiammazione-dipendente (80). L’inibizione della funzione regolatoria è dipendente dall’azione sia dell’ IL 15, citochina in grado di interferire con il signalling del TGF β Smad3-mediato, rendendo così i linfociti T effettori resistenti all’attività soppressiva dei linfociti T CD4+CD25+Foxp3+ (80, 85, 88), sia dell’ IL21, citochina proinfiammatoria prodotta dai linfociti intraepiteliali e della lamina propria nei pazienti celiaci a dieta libera (89, 90, 91).
Nella letteratura corrente, il fenotipo regolatorio delle cellule T è comunemente identificato dall’ espressione del Foxp3, che tuttavia può essere indotta nelle cellule T CD4+CD25- in presenza di TGFβ o a seguito della stimulazione TCR-mediata, senza che esso conferisca attività soppressiva (92, 93, 94). Un altro marker di immunoregolazione largamente adottato è l’espressione ad alta concentrazione di CD25 (CD25hi); è stato inoltre dimostrato che solamente le cellule T CD4+CD25hi esprimono in modo uniforme il Foxp3. D’altra parte, il CD25 è anche un marker di attivazione e non può distinguere con accuratezza le cellule T regolatorie dalle cellule T
responder. Per superare tali limitazioni, i ricercatori hanno cercato di
identificare marker presenti sulla membrana cellulare specifici per il fenotipo T regolatorio.
56 Il latency associated peptide (LAP) è il pro-peptide amino terminale del peptide precursore del TGFβ; esso rimane associato in forma dimerica, mediante legami non covalenti, al peptide attivo carbossiterminale (complesso inattivo del TGFβ latente). Il rilascio del TGFβ avviene principalmente attraverso la rimozione del LAP ad opera di enzimi proteolitici come la plasmina (95), le metalloproteinasi MMPs (96), oppure attraverso una variazione di conformazione del LAP, che rende visibile il sito di legame per il recettore del TGFβ nel TGFβ latente, ad opera della trombospondina 1(97) o ancora mediante l’azione delle integrine αV (98 ).
Poiché il meccanismo regolatorio più importante della funzione del TGF β è basata sull’equilibrio tra la forma latente e la forma biologicamente attiva, il LAP gioca un ruolo fondamentale nella regolazione degli effetti biologici del TGF β, come ben evidenziato nella malattia di Camurati-Englemann, un tipo autosomico dominante di displasia ossea umana associata a mutazioni missense localizzate nella regione codificante per il LAP e in grado di provocare l’alterazione della dimerizzazione del LAP, una minore stabilità del TGF β latente e pertanto la anticipata attivazione del TGF β maturo. Il complesso LAP/TGFβ legato alla membrana e capace di mediare l’immunosoppressione attraverso un meccanismo contatto-dipendente è stato descritto per la prima volta da Nakamura e collaboratori sulle cellule T regolatorie CD4+CD25+ prima murine (99) e successivamente umane (100), rapidamente indotto sulla membrana cellulare dopo l’attivazione. Il LAP è stato identificato come marker altamente specifico di fenotipo T regolatorio e proposto in protocolli
57 per la purificazione di tali cellule candidate ad applicazione terapeutiche e ad analisi funzionali (101).
Questi dati ci hanno indotto a investigare la presenza di cellule T CD4+LAP+ in un gruppo di pazienti celiaci a dieta libera e a dieta aglutinata. I due gruppi sono stati confrontati tra loro e con una popolazione di controllo senza patologie intestinali.
