Capitolo 4

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Capitolo 4 : Parte sperimentale

4.1 Materiale vegetale

Le parti aeree di Euphorbia laurifolia Juss. ex Lam. sono state raccolte nel Settembre 2011 a Puembo-Tumbaco, provincia di Pichincha, Ecuador.

4.2 Estrazione

Le parti aeree (527.0 g) di Euphorbia laurifolia Juss. ex Lam. precedentemente essiccate all’aria e macinate, sono state sottoposte ad estrazione a temperatura ambiente (macerazione) con solventi a polarità crescente. I solventi in successione usati per questo scopo sono stati i seguenti: n-esano, cloroformio, una miscela cloroformio-metanolo (9:1) e metanolo.

La droga è stata macerata in ogni solvente per circa tre settimane durante le quali il solvente è stato rinnovato ogni 72 h per un totale di quattro volte per ogni tipo utilizzato. Gli estratti ottenuti ad ogni cambio di solvente sono stati evaporati a pressione ridotta e a temperatura compresa tra i 35 e i 40 °C per mezzo del rotavapor, riuniti ed ulteriormente evaporati, fino ad ottenere, ad estrazione conclusa, le seguenti rese (Fig 4.1- 4.2)

 Estratto n-esanico (RE): 15.2 g

 Estratto cloroformico (RC): 14.6 g

 Estratto cloroformio-metanolo (RC-M): 2.7 g

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Fig. 4.1 Procedura di estrazione del materiale vegetale

Fig. 4.2 Rese delle estrazioni di Euphorbia laurifolia Juss. ex Lam.

Droga essiccata (527.0 g) Macerazione con n-esano R_E (15.2 g) Macerazione con cloroformio R_C (14.6 g) Macerazione con cloroformio-metanolo(9:1) R_C-M (2.7 g) Macerazione con metanolo R_M (20.2 g) R n-esano R cloroformio R cloroformio-metanolo R metanolo

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Sulla base di un’analisi preliminare attraverso cromatografia su strato sottile (TLC: Thin Layer Chromatography) ma anche in base agli studi fitochimici presenti sul genere Euphorbia sono stati analizzati in tale ordine gli estratti cloroformico, n-esanico e cloroformio-metanolico poiché è stato ipotizzato che contenessero al loro interno i diterpeni, le molecole più importanti per questo genere di studio.

4.3 Studio dell’estratto cloroformico (R

C

)

Il residuo cloroformico (RC) ottenuto per completa evaporazione del solvente,

presenta un peso complessivo di 14.6 g. Una parte di tale residuo (5.0 g) è stata disciolta in circa 35 ml di miscela n-esano-CHCl3-MeOH ed il campione è stato

caricato su SNAP cartridge e lasciato essiccare sotto cappa.

Successivamente il campione è stato sottoposto a cromatografia su colonna di gel di silice usando il sistema di purificazione flash Biotage® Isolera™ Spektra eluendo con miscele di solventi a polarità crescente come illustrato in tabella (Tab 4.1).

Il tutto è avvenuto utilizzando le seguenti condizioni:  SNAP cartridge da 340 g di silice

 Volume colonna: 450 ml  Flusso: 100 ml/min

 Modalità di raccolta: collect all + UV1 (λ=254 nm) + UV2 (λ=320 nm)

 Modalità di rilevamento: scansione in tempo reale PDA  Frazioni da 27 ml

Miscele eluenti Volumi colonna Frazioni

CHCl3-n-esano 1:1 2 1-40 CHCl3-n-esano 1:1 → CHCl3 5 41-133 CHCl3 → CHCl3-MeOH 95:5 4 134-213 CHCl3-MeOH 95:5 → CHCl3-MeOH 9:1 3 214-274 CHCl3-MeOH 9:1 → CHCl3-MeOH 8:2 2 275-319 CHCl3-MeoH 8:2 → MeOH 2 320-356

Tab 4.1 - Cromatografia flash con Biotage®_{Isolera™ Spektra di R} C

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Le 356 frazioni ottenute sono state successivamente raggruppate in 16 riunioni principali tenendo conto delle caratteristiche cromatografiche che si sono evidenziate dalla cromatografia su strato sottile su lastra di gel di silice 60 F254. Le fasi mobili

utilizzate a tale scopo sono state miscele di n-esano e cloroformio (7:3, 8:2), solo CHCl3 ed anche miscele di CHCl3-MeOH (99:1, 98:2, 97:3, 95:5, 9:1, 85:15).

Le frazioni sono state evidenziate su TLC con il reattivo universale spray solfato di cerio, che mette in evidenza la stragrande maggioranza dei metaboliti.

Al termine si è ottenuto lo schema di riunione presentato in (Tab 4.2), eliminando quelle meno significative (1-18, 325-341):

Riunioni Frazioni riunite Resa in mg

1 19-39 425.2 mg 2 40-63 97.2 mg 3 64-81 246.6 mg 4 82-132 1748 mg 5 133-145 93.3 mg 6 146-159 92.7 mg 7 160-198 136.2 mg 8 199-239 350.1 mg 9 240-248 180.5 mg 10 249-253 84.1 mg 11 254-266 485.6 mg 12 267-298 220.9 mg 13 299-306 34.6 mg 14 307-324 156.3 mg 15 342-349 133.0 mg 16 350-356 106.0 mg

Tab 4.2 - Schema di riunione dell’estratto RC dopo cromatografia flash con Biotage® Isolera™ Spektra

La frazione RC/1 (425.2 mg) appariva come singola macchia bruna su TLC e quindi

sono state fatte subito le analisi spettroscopiche che hanno portato all’identificazione di un carotenoide non interessante ai fini di tale studio.

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4.3.1 Analisi della frazione R

c

/5

La frazione Rc/5 (93.3 mg) è stata sciolta in 1 ml di soluzione MeOH-H2O (65:35) e

centrifugata; il sovranatante è stato portato a secco ottenendo un campione di 12.8 mg che è stato sciolto in 200 μl di una soluzione MeOH-H2O (65:35), e sottoposto a

cromatografia ad alta pressione (HPLC) su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm x 7.8

mm). La colonna è stata condizionata ed eluita con una miscela di MeOH-H2O

(55:45), utilizzando le seguenti condizioni:  Attenuazione: 7x

 Eluente: MeOH-H2O (55:45)

 Velocità flusso: 2.0 ml/min  Iniettata: 100 μl

 Numero iniettate: 2

Dalla cromatografia sono state ottenute 23 frazioni, più quella ottenuta dal lavaggio della colonna con MeOH. Tali frazioni dopo completa evaporazione del solvente, sono state disciolte in una minima quantità di metanolo e sottoposte a TLC su lastra di gel di silice 60 F254 usando come fase mobile una miscela CHCl3-MeOH (97:3) e come

reattivo spray il solfato di cerio.

Sulla base delle caratteristiche cromatografiche le frazioni sono state raggruppate in una frazione principale, eliminando quelle non significative (Fig 4.3).

Fig 4.3 - HPLC della frazione RC/5

Frazione R_C/5 5/1= 15-17 RP-HPLC MeOH-H₂O (55:45) Composto 1 11

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La frazione 5/1 (2.3 mg; tR=11 min) su TLC si presentava come una singola macchia

chiara bruno-giallastra. Le analisi spettroscopiche hanno permesso la sua identificazione come composto a struttura cumarinica già noto in natura;

isofraxidina (1)

I dati chimico-fisici del composto (1) sono i seguenti:

Composto (1): solido giallo fosforescente; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab 3.7);}

ESI-MS m/z 221 [M-H]-_{, 206 [M-H-15]}-_{, 191 [M-H-15-15]}-_{, 223 [M+H]}+_.

4.3.2 Analisi della frazione R

c

/7

La frazione Rc/7 (136.2 mg) è stata disciolta in 1 ml di MeOH-H2O (85:15), il

sovranatante portato a secco in un pallone tarato, pesato il residuo corrispondente a (22.5 mg). Quest’ultimo è stato disciolto in 300 μl di MeOH-H2O (85:15),

nuovamente centrifugato, e sottoposto a cromatografia ad alta pressione (HPLC) su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm x 7.8 mm). La colonna è stata condizionata ed

eluita con una miscela di MeOH-H2O (85:15) utilizzando le seguenti condizioni:

 Attenuazione: 7x

Dalla cromatografia sono state ottenute 25 frazioni più quella ottenuta dal lavaggio della colonna con il solo metanolo. Tali frazioni dopo completa evaporazione del solvente, sono state disciolte nella minima quantità di metanolo e sottoposte a TLC su lastra di gel di silice 60 F254 usando come fase mobile una miscela di CHCl3-MeOH

(97:3) e come reattivo spray di rivelazione il solfato di cerio.

Sulla base delle caratteristiche cromatografiche le frazioni sono state raggruppate in 6 riunioni principali (Fig 4.4) eliminando quelle non significative.

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La frazione 7/2 (0.5 mg; tR=7 min) si presentava su TLC come una singola macchia

bruna. Le analisi spettroscopiche di tale composto hanno permesso di identificarlo come un diterpene, composto A, ma ancora in fase di caratterizzazione.

La frazione 7/3 (0.3 mg; tR= 14 min) si presentava su TLC come una macchia bruna

e di forma appuntita. Le analisi spettroscopiche hanno permesso la sua identificazione come un composto appartenente alla classe dei grassi, ma non è stato ulteriormente caratterizzato in quanto non significativo ai fini di questo studio.

4.3.3 Analisi della frazione R

C

/9

La frazione RC/9 (180.5 mg) è stata sciolta in 2 ml di una miscela di MeOH-H2O

(7:3), è stato prelevato il surnatante e portato a secco in un pallone tarato ottenendo un residuo di 33.0 mg che successivamente è stato sciolto in 330 μl di MeOH-H2O

(7:3), e sottoposto a cromatografia ad alta pressione (HPLC) su colonna μ-Bondapak

Frazione R_C/7 7/5= 19-20 7/6= 23-25 RP-HPLC MeOH-H2O (85:15) 7/2= 9 7/1= 6-7 7/4= 18 7/3= 15-17 Composto A aaA1A11

(9)

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77

RP18 (30 cm x 7.8 mm). La colonna è stata condizionata ed eluita con una miscela di

MeOH-H2O (7:3) utilizzando le seguenti condizioni:

(10)

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78

La frazione 9/7 (3.2 mg; tR= 12min) che su TLC si presentava come una singola

macchia molto evidente di colore bruno intenso. Le analisi spettroscopiche hanno permesso la sua identificazione, come composto diterpenico noto, ent-16α,17diidrossikauran-3-one (2).

I dati chimico fisici del composto (2) sono i seguenti:

Composto (2): solido bianco cristallino; 1H-NMR e 13C-NMR (Cap 3, Tab 3.1); ESI-MS m/z 319 [M-H]-_.

La frazione 9/10 (0.3 mg; tR= 21 min) si presentava su TLC come una singola

macchia non molto evidente e di colore brunastro. Le analisi spettroscopiche hanno permesso la sua identificazione come un composto appartenente alla classe dei grassi e quindi non di interesse ai fini del nostro studio.

Frazione R_C/9 9/8= 22-23 9/11= 29 9/10= 28 RP-HPLC MeOH-H₂O (7:3) 9/3= 11 9/1= 7 9/5= 14 9/2= 10-13 9/7= 20-21 9/4= 12 9/9= 25 9/6= 17-18 Composto 2 11

(11)

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79

4.3.4 Analisi della frazione R

C

/11

La frazione RC/11 (485.6 mg) è stata disciolta in 2 ml di CHCl3 per estrarre più

composto possibile, il sovranatante trasferito in un pallone tarato e portato a secco, nuovamente disciolto in MeOH-H2O (7:3). Il surnatante, è stato prelevato,

centrifugato e portato a secco ottenendo così un residuo di 99.5 mg. Questi sono stati sciolti in 1 ml di MeOH-H2O (7:3) e sottoposti a cromatografia ad alta pressione

(HPLC) su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm x 7.8 mm). La colonna è stata

condizionata ed eluita con una miscela di MeOH-H2O (65:35) utilizzando le seguenti

condizioni:

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macchia bruna. Le analisi spettroscopiche hanno permesso di identificare questo come uno ionone già noto in natura, vomifoliol (3).

I dati chimico-fisici del composto (3) sono i seguenti:

Composto (3): olio giallo; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab 3.5); ESI-MS m/z 223}

[M-H]-. Frazione RC/11 RP-HPLC MeOH-H₂O (65:35) 11/2= 6 11/1= 4-5 11/4= 9 11/3= 7 11/6= 17-18 11/5= 10-14 11/8= 20-21 11/7= 19 11/10= 24-25 11/9= 23 20/12= 28 bis 11/11= 28 11/12= 29-30 Composto 3 11 Composto 4 11

(13)

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macchia bruna chiara. Le analisi spettroscopiche hanno permesso l’identificazione di tale come diterpene già noto in natura, ent-16α-17-diidrossiatisan-3-one (4).

I dati chimico-fisici del composto (4) sono qui di seguito riportati:

Composto (4): solido bianco cristallino; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab 3.2);}

ESI-MS m/z 639 [2M-H]-_.

macchia bruno chiara ed anche la frazione 11/12 (3.8 mg; tR= 39 min) si

presentava su TLC come una singola macchia bruna. Le indagini spettroscopiche di tali frazioni hanno portato a dire che entrambe erano grassi, non interessanti dal punto di vista di tale lavoro.

4.3.5 Analisi della frazione R

c

/12

La frazione RC/12 (220.9 mg) è stata disciolta in 2 ml di una miscela MeOH-H2O

(7:3), portata a secco in un pallone tarato, pesata (40.0 mg) e sciolta nuovamente in 400 μl di MeOH-H2O (4:6). Il surnatante, è stato sottoposto a cromatografia ad alta

pressione (HPLC) su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm x 7.8 mm). La colonna è stata

condizioni:

(14)

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La frazione 12/1 (1.6 mg; tR=12 min) si presentava su TLC come una singola

macchia bruna chiara. Le analisi spettroscopiche hanno permesso di identificarla come un composto aromatico semplice, non di interesse ai fini di tale lavoro.

macchia molto chiara. Le analisi spettroscopiche di tale frazione hanno portato all’identificazione di un nuovo ionone 6,9,13-triidrossimegastigman-7-en-3-one

(5).

I dati chimico fisici di tale composto (5) sono qui riportati:

Composto (5): solido amorfo incolore; [α]D= +8 (c 0.125, MeOH); 1H-NMR e 13

C-NMR (Cap 3, Tab 3.6); HRESIMS m/z 507.3278 [2M+Na]+_.

4.3.6 Analisi della frazione R

C

/14

La frazione RC/14 (156.3 mg) è stata disciolta in 1 ml di una miscela MeOH-H2O

(65:35). Il surnatante è stato prelevato e portato a secco ottenendo un residuo di 89.9 mg che è stato a sua volta disciolto in 900 μl di MeOH-H2O (55:45),

centrifugato, sottoposto a cromatografia ad alta pressione (HPLC) su colonna

μ-Frazione RC/12 RP-HPLC MeOH-H₂O (40:60) 12/2= 13-14 12/1= 9-10 12/4= 24-25 12/3= 19 Composto 5 11

(15)

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83

Bondapak RP18 (30 cm x 7.8 mm). La colonna è stata condizionata ed eluita con una

miscela di MeOH-H2O (55:45) utilizzando le seguenti condizioni:

macchia bruno scuro ed intensa. Le analisi spettroscopiche hanno portato all’identificazione di un nuovo composto diterpenoidico in natura mai

Frazione R_C/14 RP-HPLC MeOH-H₂O (55:45) 14/2= 18-19 14/1= 17 14/4= 22-24 14/3= 20-21 Composto 6 11

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precedentemente isolato: 18-idrossi-9H,11 H-lathyra-4(15),5(6)-dien-1,14-dione-18--D-glucopiranoside (6).

I dati chimico-fisici relativi a tale composto (6) sono qui riportati:

Composto (6): olio giallo; [α]D= +19 (c 0.1, MeOH); 1H-NMR e 13C-NMR (Cap 3,

Tab 3.3); HRESIMS m/z 501.2446 [M+Na]+_{, 339.1924 [M+Na-162]}+_{, 317.2104}

[M+H-162]+; UV (MeOH) λmax 245, 230 sh nm.

La frazione 14/4 (12.6 mg; tR=14 min) si presentava su TLC come una singola

macchia bruno scuro ed intensa. Le analisi spettroscopiche hanno portato all’identificazione di una miscela contenente il composto 6 ed il suo stereoisomero.

4.4 Studio dell’estratto

n

-esanico (R

E

)

Ripartizione dell’estratto

n

-esanico

L’estratto n-esanico (RE), ottenuto dalla completa evaporazione del solvente grazie

all’aiuto del rotavapor, con peso complessivo di 15.2 g è stato disciolto in una miscela con rapporto 1:1 di n-esano e MeOH-H2O (3:2) il tutto tramite l’utilizzo dell’imbuto

separatore. Grazie a questo, è stato possibile ottenere due fasi distinte in base alla loro polarità:

 REE (residuo n-esanico: 12.5 g)

 REW (residuo n-esano-MeOH-H2O: 473 mg)

Frazionamento del residuo R

EW

Il residuo REW (residuo n-esano-MeOH-H2O, 473 mg) dopo successiva evaporazione

del solvente, è stato disciolto nella minima quantità di CHCl3 (5 ml) e sottoposto a

cromatografia su colonna di gel di silice usando il sistema di purificazione flash Biotage®_{Isolera™ Spektra eluendo con}_{n-esano, cloroformio e metanolo a polarità}

crescente come illustrato in Tabella 4.3.

Il campione è stato caricato in Samplet cartridge per SNAP cartridge e lasciato essiccare sotto cappa.

(17)

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85

 Modalità di rilevamento: scansione in tempo reale PDA  Frazioni da 12 ml

Miscele eluenti Volume colonna Frazioni

n-esano-CHCl3 1:1 1 1-5

n-esano-CHCl3 1:1 → CHCl3 3 6-17

CHCl3→ CHCl3-MeOH 97:3 6 18-34

CHCl3-MeOH 97:3 → CHCl3-MeOH 9:1 3 35-42

CHCl3-MeOH 9:1 → MeOH 2 43-46

Tab 4.3 - Cromatografia con flash Biotage®_{Isolera™ Spektra di R} EW

Le 46 frazioni ottenute sono state raggruppate in 5 riunioni principali tenendo conto delle caratteristiche cromatografiche evidenziate da cromatografia su strato sottile TLC su gel di silice 60 F254.

Le fasi mobili utilizzate a tale scopo sono state n-esano-CHCl3 (1:1), CHCl3, CHCl3

-MeOH (98:2, 95:5, 9:1).

Le frazioni sono state evidenziate su TLC con il reattivo universale spray solfato di cerio, che mette in evidenza la maggior parte dei metaboliti.

Al termine si è ottenuto lo schema di riunione presentato in (Tab 4.4):

1 1-5 1.9 mg

2 6-7 7.4 mg

3 8-14 295.6 mg

4 15-40 29.5 mg

5 41-46 38.5 mg

(18)

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86

4.4.1 Analisi della frazione R

EW

/3

La frazione REW/3 (295.6 mg) è stata sottoposta a cromatografia HPCPC (High

Performance Centrifugal Partition Chromatography). Dato che la scelta del sistema solvente è la fase cruciale per l’ottenimento di una buona cromatografia, sono stati preparati molteplici sistemi solvente con l’ausilio di un imbuto separatore, le cui fasi organiche sono state utilizzate come eluenti per la cromatografia su strato sottile. Presa visione della corsa delle macchie su TLC, il sistema solvente trovato idoneo alla separazione dei composti costituenti tale frazione è il seguente: n-esano-AcOEt-MeOH-H2O (8:5:5:2) utilizzando come fase mobile la fase più polare, che si trovava

nella parte inferiore dell’imbuto separatore, e come fase stazionaria quella più apolare, con densità minore. Quindi la cromatografia è stata effettuata in modalità discendente. La frazione REW/3 è stata disciolta in 1 ml di fase mobile, centrifugata

ed il sovranatante sottoposto a HPCPC. La fase stazionaria è stata introdotta nelle celle al flusso costante di 10 ml/min, mentre l’eluizione è stata effettuata con fase mobile al flusso di 3 ml/min, facendo girare il rotore a 700 rpm.

Sono state raccolte 206 frazioni, di circa 1 ml ciascuna, di cui 146 ottenute eluendo con fase mobile e 59 eluendo con fase stazionaria. Le frazioni raccolte sono state sottoposte a TLC su gel di silice 60 F254 usando come eluenti le miscele CHCl3-MeOH

(95:5) e n-esano-AcOEt-MeOH-H2O (8:5:5:2). La rivelazione è stata condotta con

reattivo spray solfato di cerio ed in base alle caratteristiche, in tal modo evidenziate, le frazioni sono state successivamente riunite in 9 frazioni principali (compreso il lavaggio con MeOH) e quelle meno significative sono state eliminate (1-21, 111-145). Al termine si è ottenuto quindi lo schema di riunione presentato in tabella (Tab 4.5):

A 22-28 17.5 mg B 29-48 23.1 mg C 49-63 13.4 mg D 64-67 2.7 mg E 68-76 5.2 mg F 77-87 5.0 mg G 88-111 13.4 mg H 146-155 5.1 mg I Lavaggio MeOH 4.6 mg

(19)

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87

4.4.1.1 Analisi della frazione R

EW

/E

La frazione REW/E (5.2 mg) è stata sciolta in 100 μl di una soluzione MeOH-H2O

(75:25), centrifugata e il sovranatante sottoposto a cromatografia ad alta pressione (HPLC) su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm x 7.8 mm). La colonna è stata

condizioni:

Fig 4.9 - HPLC della frazione REW/E

Frazione R_EW/E RP-HPLC MeOH-H₂O (75:25) I/2= 10-12 E/1= 7 E/2= 10-12 E/3= 13 Composto B 11

(20)

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88

La frazione E/1 (0.5 mg; tR= 8 min) si presentava su TLC come una singola macchia

di colore beige. Le analisi spettroscopiche hanno permesso di identificare da essa un composto di natura diterpenica ancora in fase di caratterizzazione, composto B.

4.4.1.2 Analisi della frazione R

EW

/F

La frazione REW/F (5.0 mg) è stata sciolta in 100 μl di una soluzione MeOH-H2O

condizioni:

(21)

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89

Fig 4.10 - HPLC della frazione REW/F

La frazione F/1 (0.5 mg; tR= 9 min) si presentava su TLC come una singola macchia

brunastra. Le analisi spettroscopiche hanno permesso di identificare questa frazione come un composto appartenente alla classe dei diterpeni ma ancora in fase di caratterizzazione, composto C.

La frazione F/6 (0.3 mg; tR=13 min) si presentava su TLC come una singola macchia

non molto evidente, ma le analisi spettroscopiche hanno permesso di identificare un diterpene, ancora in corso di caratterizzazione, composto D.

4.4.1.3 Analisi della frazione R

EW

/G

La frazione REW/G (13.4 mg) è stata sciolta in 200 μl di una soluzione MeOH-H2O

condizioni:  Attenuazione: 7x  Eluente: MeOH-H2O (8:2) Frazione REW/F RP-HPLC MeOH-H2O (75:25) F/6= 18-19 F/1= 9 F/2= 12-13 F/3= 14-15 F/4= 16 F/5= 17 Composto C CCC<CC 11 Composto D DCDCCC<C C 11

(22)

_________________________________________

90

Fig 4.11 - HPLC della frazione REW/G

La frazione G/5 (0.8 mg; tR= 11 min) si presentava su TLC come singola macchia di

colore brunastro. Le analisi spettroscopiche hanno portato ad identificare tale frazione essere un composto diterpenico ancora in fase di caratterizzazione uguale a quello della frazione REW/F/6 (composto D).

Frazione R_EW/G RP-HPLC MeOH-H₂O (8:2) G/1= 8-9 G/2= 10-11 G/3= 12 G/4= 13-14 G/5= 19 Composto D DCDCCC<C C 11

(23)

_________________________________________

91

4.4.2 Analisi della frazione R

EW

/4

La frazione REW/4 (29.5 mg) è stata disciolta in 1 ml di miscela MeOH-H2O (75:25); il

surnatante è stato prelevato, portato a secco in un pallone tarato ottenendo un residuo di 20.0 mg che è stato disciolto in 200 μl di MeOH-H2O (75:25) e sottoposto

a cromatografia ad alta pressione (HPLC) su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm x 7.8

(75:25) utilizzando le seguenti condizioni:  Attenuazione: 7x

(24)

_________________________________________

92

Fig 4.12 - HPLC della frazione REW/4

Le frazioni ricavate da questo HPLC sono ancora in corso di studio.

Frazionamento del residuo R

EE

Una parte di residuo REE (residuo n-esano, 5.0 g) ottenuto dalla ripartizione

dell’estratto n-esanico, è stato disciolto nella minima quantità di esano (10 ml) e sottoposto a cromatografia su colonna di gel di silice usando il sistema di purificazione flash Biotage®_{Isolera™ Spektra eluendo con}_{n-esano, cloroformio e}

metanolo con miscele a polarità crescente come illustrato in Tabella 4.6.

Il campione è stato caricato in Samplet cartridge per SNAP cartridge e lasciato essiccare sotto cappa.

 Modalità di rilevamento: scansione in tempo reale PDA  Frazioni da 27 ml Frazione REW/4 RP-HPLC MeOH-H2O (75:25) 4/6= 23 4/1= 13 4/2= 15 4/3= 16-17 4/4= 18 4/5= 19

(25)

_________________________________________

93

Miscele eluenti Volume colonna Frazioni

n-esano 1 1-19 n-esano → n-esano-CHCl3 8:2 3 20-74 n-esano-CHCl3 8:2→ n-esano-CHCl3 7:3 3 74-131 n-esano-CHCl3 7:3→ n-esano-CHCl3 1:1 3 132-190 n-esano-CHCl3 1:1→ CHCl3 3 191-247 CHCl3 1 248-268 CHCl3 → CHCl3-MeOH 97:3 2 269-305 CHCl3-MeOH 97:3 → CHCl3-MeOH 95:5 1 305-325

Tab 4.6 - Cromatografia flash Biotage®_{Isolera™ Spektra di R} EE

Le 325 frazioni ottenute sono state raggruppate in 8 riunioni principali tenendo conto delle caratteristiche cromatografiche evidenziate da cromatografia su strato sottile TLC su gel di silice 60 F254.

Le fasi mobili utilizzate a tale scopo sono state n-esano-CHCl3 (9:1, 8:2, 7:3, 1:1),

CHCl3, CHCl3-MeOH (99:1).

Le frazioni sono state evidenziate su TLC con il reattivo universale spray solfato di cerio, che mette in evidenza la stragrande maggioranza dei metaboliti.

Al termine si è ottenuto lo schema di riunione presentato in (Tab 4.7) eliminando le frazioni non significative (1-20, 58-80, 284):

1 21-57 93.0 mg 2 81-125 662.7 mg 3 126-215 406.7 mg 4 216-240 428.6 mg 5 241-251 695.6 mg 6 252-273 1.437 g 7 274-283 156.1 mg 8 285-325 118.9 mg

Tab 4.7 - Schema di riunione dell’estratto REE dopo cromatografia flash Biotage® Isolera™ Spektra

Le frazioni REE/1 (93.0 mg) ed REE/2 (662.7 mg) apparivano su TLC come singole

macchie, le analisi spettroscopiche hanno portato ad identificare tali composti come grassi e quindi senza rilevanza ai fini di tale tesi.

(26)

_________________________________________

94

4.4.3 Analisi della frazione R

EE

/8

La frazione REE/8 (118.9 mg) è stata disciolta in 1 ml di miscela MeOH-H2O (85:15),

prelevato il sovranatante e portato a secco in un pallone tarato ottenendo un residuo di 10.0 mg che successivamente è stato disciolto in 200 μl di MeOH-H2O (85:15),

centrifugato e sottoposto a cromatografia ad alta pressione (HPLC) su colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm x 7.8 mm). La colonna è stata condizionata ed eluita con una

miscela di MeOH-H2O (85:15) utilizzando le seguenti condizioni:

(27)

_________________________________________

95

Fig 4.13 - HPLC della frazione REE/8

Le frazioni ricavate da questo HPLC sono ancora in corso di caratterizzazione.

4.5 Studio dell’estratto cloroformio-metanolico (R

C-M

)

Il residuo cloroformio-metanolico (RC-M), dopo evaporazione del solvente, pesava 2.7

g. Tutto il residuo è stato disciolto in 15 ml di MeOH, centrifugato e il sovranatante sottoposto a cromatografia ad esclusione molecolare su una colonna di Sephadex LH-20 (i.d= 2.5 cm) eluendo con MeOH a flusso costante di 1 ml/min. Sono state raccolte 51 provette del volume di 12 ml ciascuna. Ogni frazione è stata sottoposta a TLC su gel di silice 60 F254 usando come eluenti le miscele CHCl3-MeOH (9:1, 85:15)

e CHCl3-MeOH-H2O (80:18:2). La rivelazione è stata condotta con il reattivo spray

solfato di cerio. In base alle caratteristiche cromatografiche, le frazioni sono state raggruppate in 7 riunioni principali, mentre altre meno significative sono state eliminate, ottenendo così lo schema di riunione qui di seguito riportato (Tab 4.8):

Frazione REE/8 8/5= 35-38 RP-HPLC MeOH-H2O (85:15) 8/4= 22-30 8/1= 13-14 8/2= 15 8/3= 16

(28)

_________________________________________

96

1 8-9 270 mg 2 10 142.6 mg 3 11-12 449.0 mg 4 13 147.4 mg 5 14-19 327.6 mg 6 20-26 78.1 mg 7 27-51 31.4 mg

Tab 4.8 - Schema di riunione dell’estratto RC-M dopo cromatografia ad esclusione molecolare

4.5.1 Analisi della frazione R

C-M

/2

La frazione RC-M/2 (142.6 mg) è stata disciolta in 1 ml di miscela MeOH-H2O (55:45)

portata a secco in un pallone tarato, pesata (95.0 mg) e sciolta in 950 μl di MeOH-H2O (55:45), centrifugata e sottoposta a cromatografia ad alta pressione (HPLC) su

colonna μ-Bondapak RP18 (30 cm x 7.8 mm). La colonna è stata condizionata ed

eluita con una miscela di MeOH-H2O (55:45) utilizzando le seguenti condizioni:

(29)

_________________________________________

97

Fig 4.14 - HPLC della frazione RC-M/2

bruna. Le analisi spettroscopiche hanno portato all’identificazione di un diterpene, non ancora caratterizzato, molto probabilmente lo stesso stereoisomero del composto isolato nella frazione 14/4 dell’estratto cloroformico.

macchia bruna. Le analisi spettroscopiche hanno portato ad identificare un nuovo diterpene 18-idrossi-9H,11H-lathyra-4(15),5(6)-dien-1,14-dione-18--D

-glucopiranoside già precedentemente isolato in questo lavoro di tesi nella frazione 14/2 dell’estratto cloroformico. Frazione RC-M/2 RP-HPLC MeOH-H2O (55:45) 2/10= 24-25 2/1= 4 2/2= 5-6 2/3= 7 2/4= 8-9 2/5= 13 2/6= 14-18 2/7= 20 2/8= 21 2/9= 22-23 Composto 6 DCDCCC<C C 11

(30)

_________________________________________

98

4.5.2 Analisi della frazione R

C-M

/3

La frazione RC-M/3 (449.0 mg) è stata disciolta in 4 ml di una miscela di MeOH-H2O

(55:45), portata a secco in un pallone tarato, ed il residuo di peso 257.2 mg sciolto in 2.5 ml di MeOH-H2O (55:45), centrifugato ed il sovranatante sottoposto a

mm). La colonna è stata condizionata ed eluita con una miscela di MeOH-H2O (1:1)

utilizzando le seguenti condizioni:  Attenuazione: 7x

(31)

_________________________________________

99

gialla, le analisi spettroscopiche hanno portato a dire che il composto ottenuto è un grasso, di nessun interesse ai fini di questo lavoro.

bruna. Le analisi spettroscopiche hanno portato all’identificazione di uno ionone già noto in natura: corchoinoside C (7)

I dati chimico-fisici del composto (7) sono qui riportati:

Composto (7): solido amorfo giallo; 1_{H-NMR e}13_{C-NMR (Cap 3, Tab 3.4); ESI-MS}

m/z 409 [M+Na]+_{, 795 [2M+Na]}+_. Frazione R_C-M/3 3/9= 27-28 RP-HPLC MeOH-H2O (1:1) 3/8= 26 3/1= 6-7 3/2= 9 3/3= 10 3/4= 11-19 3/5= 13 3/6= 20 3/7= 23-25 Composto 7 DCDCCC<C C 11 Composto 6 DCDCCC<C C 11 Composto 6 DCDCCC<C C 11

(32)

_________________________________________

100

La frazione 3/7 (4.4 mg; tR=16 min) e la frazione 3/9 (4.6 mg; tR=18 min) si

presentavano su TLC come singole macchie brune. Le analisi spettroscopiche di entrambe le frazioni hanno permesso di identificare in esse il diterpene

18-idrossi-9H,11H-lathyra-4(15),5(6)-dien-1,14-dione-18--D-glucopiranoside

nuovo in natura, ma già caratterizzato nella frazione 14/2 dell’estratto cloroformico.

4.5.3 Analisi della frazione R

C-M

/5

La frazione RC-M/5 (327.6 mg) è stata disciolta in 4 ml di una miscela di MeOH-H2O

(25:75), portata a secco in un pallone tarato, ed il residuo di peso 255.0 mg sciolto in 2.5 ml di MeOH-H2O (25:75), centrifugato ed il sovranatante sottoposto a

(25:75) utilizzando le seguenti condizioni:  Attenuazione: 7x

(33)

_________________________________________

101

di colore bruno, le analisi spettroscopiche hanno portato ad identificare un composto aromatico semplice già caratterizzato nella frazione 12/1 dell’estratto cloroformico. La frazione 5/6 (1.6 mg; tR=33 min) si presentava su TLC come una singola macchia

di colore giallo. Le analisi spettroscopiche hanno portato ad identificarla come un composto appartenente alla classe delle cumarine ma ancora in fase di esatta caratterizzazione (composto E).

4.6 Studio dell’estratto metanolico (R

M

)

Il residuo metanolico (RM), ottenuto per completa evaporazione del solvente,

presentava un peso di 20.2 g. Al fine di facilitare lo studio dei metaboliti secondari, eliminando in particolar modo la parte zuccherina, tale estratto è stato ripartito per mezzo dell’imbuto separatore con una miscela n-BuOH-H2O (1:1), in una porzione

n-butanolica RBu (2.9 g) ed in una porzione acquosa (12.3 g).

Frazione RC-M/5 RP-HPLC MeOH-H2O (25:75) 5/6= 21-23 5/1= 2 5/2= 3-4 5/3= 6-7 5/4= 9-10 5/5= 14-15 Composto E DCDCCC<C C 11

(34)

_________________________________________

102

Il residuo n-butanolico così ottenuto è stato disciolto in circa 10 ml di MeOH, il tutto è stato centrifugato ed il sovranatante sottoposto a cromatografia ad esclusione molecolare su colonna Sephadex LH-20 (i.d = 2.5 cm), eluendo con metanolo a flusso costante di 0.8 ml/min.

Sono state raccolte 62 provette da 8 ml ciascuna, ciascuna analizzata mediante TLC su gel di silice 60 F254 usando come eluente una miscela di toluene:acido

formico:acetato di etile (5:1:4), CHCl3-MeOH-H2O (70:30:3) e BAW

(n-BuoH-CH3COOH-H2O, 60:15:25) e come reattivo spray di rivelazione il solfato di cerio.

In base alle caratteristiche cromatografiche così evidenziate, le frazioni sono state riunite in 12 riunioni principali, mentre quelle non significative sono state eliminate (1-5; 9; 23; 41-50; 56) (Tab 4.9):

1 6-8 202.2 mg 2 10-13 512.1 mg 3 14-17 397.0 mg 4 18-19 129.3 mg 5 20-22 163.2 mg 6 24-26 201.4 mg 7 27-28 119.9 mg 8 29-34 452.2 mg 9 35 35.5 mg 10 36-40 80.5 mg 11 51-55 40.1 mg 12 57-62 27.1 mg

Tab 4.9 - Schema di riunione dell’estratto RM dopo cromatografia ad esclusione molecolare

La frazione RM/9 si presentava su TLC come una singola macchia di colore

bruno-arancio, le analisi spettroscopiche hanno permesso di identificarla come un flavonoide già noto: quercetina 3-O-β-D-glucuronopiranoside (8).

I dati chimico fisici di tale composto (8) sono qui di seguito riportati.

Composto (8): solido giallo ocra; 1H-NMR e 13C-NMR (Cap 3, Tab 3.8); ESI-MS m/z 477[M-H]-_{, 301 [M-H-176]}-_{, 479 [M+H]}+_.