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CAPITOLO 6
DISCUSSIONE E
CONCLUSIONI
91 6. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
Le Heat Shock Protein (HSP) costituiscono un gruppo di proteine che negli ultimi anni hanno suscitato un crescente interesse per la scoperta delle loro proprietà regolatrici del sistema immunitario degli animali e in particolare di quello umano. Numerosi studi hanno dimostrato il loro potenziale impiego nell’industria farmaceutica per la cura di una ampia varietà di patologie che riguardano il sistema immunitario, da malattie infettive, a malattie autoimmuni e perfino a tumori di svariati tipi.
Partendo dal dato scientifico che le proteine HSP rappresentano una classe di proteine altamente conservate sia dal punto di vista strutturale che funzionale, è lecito pensare che le proteine HSP di origine vegetale possano sostituire quelle umane nelle sperimentazioni cliniche. Ragion per cui la Società Metapontum Agrobios, presso la quale questo lavoro sperimentale è stato svolto, sta sviluppando strumenti che consentano l’accumulo di quantità rilevanti di proteine HSP in pianta.
Il lavoro sviluppato nell’ambito di questa tesi si inserisce in questo obiettivo più ampio e ha riguardato un’esperimento che ha portato all’ottenimento di piante di
Nicotiana tabacum transgeniche per il gene HSP70 a cui era stato fuso il Signal
Peptide della calreticulina. L’obiettivo del lavoro è di direzionare la proteina verso l’ER e successivamente verso l’esterno. Il risultato atteso è che la proteina ricombinante possa essere rizosecreta o escreta all’esterno attraverso il liquido di guttazione.
Quest’esperimento non è il primo del suo tipo, altri lavori precedenti sono stati fatti in cui è stata ottenuta la secrezione di proteine dalle radici. Diversi esempi di proteine espresse in piante trasformate e indirizzate verso specifici compartimenti cellulari sono riportati in letteratura. Uno studio del 1999, riporta da secrezione della SEAP (Secreted Alkaline Phophatase), la xilanasi batterica, e la GFP (Green Florescent Protein) dalle radici di piante di tabacco transgeniche (Borisjuk et. al. 1999). In un lavoro più recente, è stato riportato la secrezione della SEAP da tabacco in piante
92 indotte alla produzione di hairy roots con un miglioramento di 5 a 7 volte della resa (Gaume, 2003). Un altro studio ancore riporta la raccolta di proteine ricombinanti di SEAP e GFP nel liquido di guttazione escreto dalle foglie di piante transgeniche di tabacco (Komarnytsky et al. 2000).
Per direzionare la proteina HSP70 verso la rizosecrezione è stato disegnato un oligonucleotide sintetico che consentisse di porre in posizione 5’ del gene HSP70 la sequenza del signal peptide della calreticulina in frame con il gene HSP70. Il costrutto ottenuto attraverso PCR è stato successivamente clonato in un vettore per l’espressione in pianta e trasferito in piante di tabacco mediante trasformazione genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens. I risultati ottenuti sono stati incoraggianti per quanto riguarda l’ottenimento di numerose piante transgeniche e la verifica dell’espressione nei transgeni. Infatti 2 degli 11 eventi di trasformazione analizzati mostrano un livello di espressione del transgene notevolmente più elevato di quanto si riscontra in Arabidopsis sia in condizioni di metabolismo non stressato che in condizioni di stress (Figuraxxx). A livello proteico però non sono state riscontrate differenze tra le piante di tabacco transgeniche e la linea isogenica non trasformata in termini di accumulo di HSP70 sia nei microsomi che nel citosol. Questo dato (anche se va ulteriormente verificato) potrebbe essere dovuto alle caratteristiche intrinseche dell’analisi western che non consente di avere una linearità assoluta tra il contenuto di una specifica proteina e il livello di fluorescenza oppure alle proprietà dell’anticorpo che riconosce non solo la proteina derivante dal transgene ma anche la HSP70 endogena e anche la forma costitutiva HSC70.
Infatti quando utilizziamo delle sonde specifiche per il transgene come nella PCR quantitativa siamo in grado di rilevare differenze sostanziali nell’espressione del transgene tra le diverse linee di tabacco osservando anche una notevole incremento dell’espressione nelle piante transgeniche rispetto ad un’induzione mediante shock termico (campione AL di Arabidopsis). Questo risultato ci fa ben sperare che la produzione di proteina HSP70 sia costitutivamente incrementata. Resta da verificare (gli esperimenti sono attualmente in via di conclusione presso i laboratori della
93 Metapontum Agrobios per cui i risultati non sono stati inseriti nella presente tesi) se la proteina ricombinante viene effettivamente escreta dalle radici. Le piante di tabacco che esprimono livelli elevati di RNA del transgene sono attualmente in fase di radicazione in coltura idroponica in condizioni axeniche. Il liquido contenrente gli essudati radicali sarà a breve analizzato e la composizione proteica sarà verificata.
