Les techniques moléculaires sont nombreuses et peuvent être complémentaires.
Certaines méthodes sont utilisables en routine de laboratoire, d’autres sont réser- vées à la recherche de nouveaux types viraux ou de variants HPVs. Toutes ces méthodes reposent sur le principe de l’hybridation moléculaire.
Le point sur ces techniques a largement été rapporté (C. Clavel. Progin 2004 et 2005).
Ces acides nucléiques doivent tout d’abord être extraits. D’autre part, les sondes employées pour la détection des ADN cibles par exemple peuvent être de nature et de taille variables. Les plus courantes sont des petites sondes d’une vingtaine de paires de bases (pb), simple brin, appelées oligonucléotides ou oligosondes ou encore amorces ou primers ; elles sont surtout utilisées pour les techniques de PCR (Polymerase Chain Reaction). Ces sondes sont par ailleurs marquées avec des mar- queurs radioactifs dits « chauds » (32P, 35S, 3H…) ou « froids » (principalement la digoxygénine et la biotine). Pour hybrider une cible à une sonde, il faut dénaturer l’ADN cible viral (par la soude ou la chaleur), afin de séparer les brins d’ADN. Si la cible virale est présente, une réaction d’hybridation (ou de fusion) se produira entre la cible dénaturée et une sonde moléculaire marquée, spécifique et complémentaire d’ADN (ou d’ARN) ; la sonde marquée doit aussi être dénaturée. La réaction d’hy- bridation, in vivo ou in vitro, sera visualisée avec ou sans microscope, via des réac- tions autoradiographiques ou de plus en plus souvent immuno-enzymatiques avec une détection colorimétrique ou fluorescente.
Le test HPV
Principales techniques
Southern Blot
C’est la technique de référence, inventée par M. Southern en 1975. Elle vise à détecter et à caractériser l’ADN alors que le Northern Blot détecte les ARN.
L’ADN est extrait et digéré par des enzymes de restriction, les fragments alors créés sont séparés sur un gel d’électrophorèse.
Cette technique est lourde en routine et nécessite au départ plusieurs micro- grammes d’ADN. Elle n’est pas envisageable en routine anatomopathologique car le prélèvement frais (de préférence pour la biologie moléculaire), voire fixé, serait entièrement « broyé » et digéré afin d’extraire l’ADN. En revanche, c’est une technique de choix en recherche, pour l’étude de nouveaux génomes d’HPV, avec l’établissement de cartes de restriction, la détection de l’intégration virale ou non ou encore de mutations et de variants. Elle sert aussi à valider des réactions de PCR (hybridation contrôle de fragments amplifiés avec une sonde centrale).
Hybridation in situ (HIS) sur coupes tissulaires ou frottis cellulaires
Cette technique in vivo permet de localiser au microscope une hybridation cellulaire sur des cellules précises : sur des coupes histologiques, sur des étalements cellulaires de type frottis, mais également sur des colonies bactériennes recombinantes. Il est aussi possible d’hybrider des chromosomes en métaphase ou des noyaux interpha- siques, on parle alors de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization). Cette méthode d’HIS a ainsi permis la localisation précise de génomes viraux d’HPV, au niveau des cellules épithéliales du col utérin, sur des coupes congelées ou fixées au formol et incluses en paraffine.
La sensibilité et l’efficacité de l’HIS dépendent de plusieurs variables. Certains kits existent comprenant des sondes marquées et des réactifs de détection. Enfin, divers moyens chimiques ont été décrits afin d’amplifier les signaux de détection (et non la cible) via le système TSA (Tyramide Signal Amplification) incorporant des tyramines biotinylées, catalysées par la peroxydase conjuguée à de la streptavidine.
Ceci permet d’augmenter les sites de réaction biotine/streptavidine avec une aug- mentation du signal jusqu’à 1 000 fois, pour alors atteindre un seuil de détection proche de la PCR in situ, mais il faut vérifier de ne pas amplifier de signaux non spé- cifiques. La lecture finale s’effectue via un microscope classique ou à fluorescence.
Le seuil de détection de l’HIS est faible, de 20 à 50 copies par cellule, mais quelques cellules seulement sont nécessaires, si l’axe de coupe est le bon ou si des cellules étalées de type koïlocytes ne se sont pas décollées lors des prétraitements et/ou de l’hybridation, de la révélation et des nombreux lavages. Même si la tech- nique peut être automatisée, elle reste longue et délicate, nécessite une grande quan- tité de sondes, proportionnelle à la surface tissulaire ou cellulaire. La sensibilité est modérée et donc insuffisante (environ 60 %), la spécificité est bonne. Cette tech- nique est bien moins sensible que le Southern Blot, le Dot Blot ou la PCR ; elle est
maintenant largement remplacée par des techniques plus sensibles, rapides et faciles, comme la PCR et l’hybridation en phase liquide.
Définition du Dot Blot
Ici un simple dépôt d’ADN est effectué sur une membrane synthétique, suivi d’une hybridation moléculaire avec une sonde marquée. Cette technique est plus simple, plus rapide, applicable à de grandes séries d’échantillons mais moins sensible que le Southern Blot : le seuil de détection est environ d’une copie par cellule.
Cette technique est maintenant utilisée après PCR, ce qui augmente sa sensibi- lité : l’ADN amplifié étant alors déposé sur une membrane synthétique, puis hybridé avec des sondes de divers HPVs.
PCR (Polymerase Chain Reaction)
La PCR est apparue de manière automatisée dans les années 1985-90 et a révolu- tionné l’analyse moléculaire, qu’elle soit virale, humaine, animale, végétale… Elle a quasiment remplacé le Southern Blot pour l’étude de gènes connus et se révèle en fait être une base pour de nombreuses autres techniques : hybridations diverses, séquençage… La cible ADN correspondant à une séquence connue est amplifiée exponentiellement selon trois étapes de dénaturation, hybridation, et extension, le tout formant un cycle ; trente à quarante cycles sont nécessaires et sont réalisés en une à deux heures. La dénaturation se fait par la chaleur, l’hybridation via des oli- gonucléotides spécifiques encadrant la région à amplifier et l’extension via une ADN polymérase (Taq polymérase), des dNTP et tampons adéquats. Le produit d’amplification est nommé amplicon ou amplimer. On peut ainsi avoir au départ 10-18g et obtenir un mg d’ADN amplifié, soit passer de quelques copies à plusieurs millions de copies cellulaires. C’est la technique la plus sensible actuellement détec- tant 10-5à 10-6copies. Elle est également spécifique, rapide et simple pour la routine ou la recherche, quand les conditions de réalisation sont bien maîtrisées tant au niveau des réactifs qu’au niveau des contrôles (négatifs et positifs), des locaux et des personnes. Les réactions de PCR sont contrôlées sur gel d’agarose, avec l’apparition de la bande (amplicon) attendue. Le risque de contamination est faible entre des mains expertes, avec des salles pré-PCR et post-PCR.
La PCR est souvent suivie d’autres techniques complémentaires : analyse de fragments, analyse de restriction, séquençage, hybridation avec une détection de type ELISA (PCR-EIA)… avec des analyses finales sur gel d’agarose. D’autre part, une PCR peut aussi être réalisée avec des oligonucléotides consensus marqués dès le départ, avec une hybridation finale, ce système est nommé Reverse Line Blotting.
Enfin, la PCR peut être quantitative, elle est dite en temps réel (Q-PCR) et paraît déjà prometteuse. Elle nécessite un appareillage adéquat avec détection de fluores- cence. Des standards et la cible, voire un gène domestique (contrôle), sont amplifiés et analysés en même temps. L’analyse automatique de la pente de la courbe des réac- tions de PCR, au tout début de la phase exponentielle (cycle seuil), permet la quan-
tification reproductible de la cible et ceci en tubes fermés. La mesure de la fluores- cence est alors liée à la quantité de cible d’ADN. Différentes stratégies chimiques existent, avec principalement des sondes Taqman ou « 5’ exonuclease assay » spéci- fiques, ou encore l’incorporation d’un intercalant non spécifique tel que le SybrGreen. Enfin, des ARNm peuvent aussi être quantifiés.
La trousse Amplicor HPV Test® (Roche Diagnostics) est la première trousse uti- lisant la technique de PCR disponible sur le marché, elle est décrite en figures 1 et 2. Le résultat est qualitatif : positivité pour un pool de 13 HPV haut risque : HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 ; sensibilité analytique : < 100 copies/PCR.
D’autres sont en cours de validation : Reverse Line Blot Assay®, Bioline HPV PCR ELISA kit® (Argene Biosoft), HPV DNA Chip® (Biocore).
Fig. 1 - Principe du test PCR Amplicor® (Roche Diagnostics).
Fig. 2 - Sets d’amorces générales : HPV L1.
Hybridation en phase liquide
Il s’agit d’une ancienne technique permettant une hybridation en solution, en trois dimensions, et non plus en deux dimensions comme le Southern Blot, le Dot Blot et l’HIS. Le seul système actuellement utilisable est commercialisé sous le nom d’Hybrid Capture. Une seconde génération, appelée « Hybrid Capture 2 », en microplaques, est commercialisée depuis 1997. Il s’agit d’une hybridation suivie d’une immunodétec- tion en microplaques avec détection luminométrique.
Sa sensibilité est proche de celle de la PCR. Deux groupes de sondes sont dispo- nibles : un mélange de sondes de treize HPVs oncogènes (HPVs 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) et un mélange de cinq sondes d’HPVs non oncogènes (HPVs 6, 11, 42, 43, 44). Le seuil de détection retenu est d’un pg/ml.
Le groupe Digene Corp, créé en 1995, est devenu le leader dans le domaine du dépistage du papillomavirus humain à haut risque (HPV) en développant et en bre- vetant la technologie dite de capture des hybrides version 2 ou « Hybrid Capture® 2 » qui permet de détecter différents virus tels les HPV oncogènes ou à haut risque et les HPV non oncogènes ou à bas risque.
Ce système repose sur une hybridation en phase liquide d’un ADN viral avec une sonde ARN complémentaire de la cible recherchée et une amplification de signal. La technique est décrite en figures 3, 4 et 5.
Les tests HPV à bas risque et à haut risque sont marqués CE depuis décembre 2003, agréés par l’AFSSAPS et la FDA.
Digene France commercialise le test Hybrid Capture® 2 HPV à haut risque, capable de détecter un cocktail de treize types viraux (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) à partir d’un prélèvement fait au niveau de la zone de jonction endocol-exocol.
Le rendu du résultat est qualitatif :
– test HPV HR positif, présence d’HPV à haut risque ; – test HPV HR négatif, absence d’HPV à haut risque.
De nombreuses études nationales et internationales ont montré la très forte valeur prédictive du test HC2 HPV HR qui est proche de 100 %. Une femme ayant un résultat HPV HR HC2 négatif a un risque quasi nul de développer un cancer dans les années suivantes.
Ainsi le test HC2 HPV oncogène dépiste les femmes à risque et le frottis cytolo- gique dépiste les femmes ayant déjà des lésions intraépithéliales. D’où la complémen- tarité de ces deux examens dans la prise en charge du dépistage du cancer du col de l’utérus.
En conclusion, le test ADN HPV (ADN de papillomavirus humains) est actuelle- ment considéré comme un test complémentaire de la trilogie cytologie-colposcopie- histologie, de nombreuses lésions pouvant ainsi être détectées, voire traitées, plus précocement. Techniquement, les HPV ne peuvent être détectés que par biologie moléculaire et le choix technique est essentiel dans cette problématique de dépistage.
Actuellement, deux grands types de techniques sensibles sont envisageables : des techniques d’hybridation en phase liquide, à sensibilité proche de celle de la PCR
(Hybrid Capture® 2, Digene) et des techniques d’amplification génique, dites de PCR (Polymerase Chain Reaction).
En ce qui concerne les techniques de PCR classiques, il existe des PCR consensus et des PCR de types d’HPV. La première catégorie détecte globalement un ou plu- sieurs HPV-HR, avec des amorces moléculaires consensus (principalement MY09/11 et GP5+/6+) dont certaines sont commercialisées (PGMY 09/11 : Amplicor®, Roche).
Les tests commercialisés détectent ainsi globalement un groupe de treize HPV-HR, couvrant environ 95 % des HPV-HR (HPV de types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) pour Hybrid Capture® 2 (Digene) et pour Amplicor® (Roche). La réponse est donc globalement positive ou négative pour ces HPV-HR, ce qui suffit à la surveillance clinique. Ces kits proposent un seuil de positivité correspondant à un certain nombre de copies virales avec une signification clinique.
Fig. 4 - Capture d’hybrides® (Digene).
Fig. 5 - Protocole technique HC2 HPV : résumé.
Nouvelle génération de tests HPV
Après détection des femmes HPV-HR positifs dans un premier temps, le génoty- page HPV peut ensuite être réalisé via d’autres tests de PCR multiplex, permettant l’identification de types d’HPV, avec cette fois des amorces spécifiques d’une tren- taine d’HPV de différents types, oncogènes et non oncogènes (Linear Array® de Roche, fig. 6 et 7 ; InnoLipa® de Innogenetics fig. 8). Enfin, plusieurs types de puces ADN HPV sont en cours de développement pour le génotypage (Clinical Arrays®
HPV Genomica, Ivagen…) et l’étude de leur sensibilité devra être validée au niveau clinique. Le génotypage constituera très certainement une nouvelle étape dans les programmes de dépistage pour évaluer la persistance virale et le contrôle de patientes vaccinées, les vaccins anti-HPV 16 et 18 (fig. 9) (actuellement prévus) arrivant prochainement.
Une troisième génération d’Hybrid Capture (HC 4) permettra bientôt le géno- typage spécifique, avec automatisation du système (fig. 10).
D’autre part, l’analyse d’autres paramètres viraux met en jeu d’autres tech- niques. La PCR quantitative (real-time PCR) permet ainsi l’étude de la charge virale (sans commercialisation actuelle). Le système NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) est un autre système d’amplification sans PCR, très prometteur car
sans doute plus spécifique, qui analyse l’initiation et la maintenance de l’état pré- cancéreux et cancéreux avec l’identification de la présence ARNm E6/E7 de 5 HPV- HR : types 16, 18, 31, 33, 45 (PreTect® HPV-Proofer, Norchip). Dans tous les cas, des protocoles et des contrôles de qualité validés, dans des locaux adéquats avec du per- sonnel qualifié en biologie moléculaire sont indispensables.
Il est aujourd’hui bien établi que ce sont les oncogènes viraux E6 et E7 qui sont responsables de la carcinogenèse liée aux papillomavirus à haut risque (HR-HPV) au niveau du col utérin. Ainsi, la détection des ARN messagers E6/E7, attestant d’une activité transcriptionnelle pour ces oncogènes, apparaît comme un marqueur pertinent pour cibler les femmes ayant un risque réel d’évolution vers une lésion précancéreuse et/ou un cancer du col.
Il existe aujourd’hui une trousse commerciale, PreTect® HPV-Proofer (Norchip), permettant la détection qualitative des ARNm E6/E7 des HPV 16, 18, 31, 33 et 45, à partir d’échantillons cervicaux en solution, PreservCyt® (Cytyc) ou NucliSens® Lysisbuffer (bioMérieux). Après une étape d’extraction d’ARN, la tech- nologie NASBA en temps réel permet l’amplification des ARN viraux cibles à l’aide de couples d’amorces. Cette technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) repose sur un processus d’amplification des ARN utilisant l’action simultanée de trois enzymes à température constante : une reverse transcriptase, une ARN polymérase et une RNase (fig. 11 et 12). L’amplification des ARN est alors détectée en temps réel à l’aide de sondes fluorescentes spécifiques. Un contrôle interne, basé sur un système amorces/sonde ciblant l’ARN humain ubiquitaire U1A, permet d’éviter les éventuels faux-négatifs dus à une extraction ARN non satisfai- sante ou à une dégradation des acides nucléiques.
Fig. 6 - Principe du génotypage HPV, Linear Array® (Roche).
Fig. 7 - Test HPV Linear Array® (Roche).
Fig. 9 - Génotypes HPV.
Fig. 10 - HC4 : génotypage (Digene).
Les études publiées en 2004 et 2005 utilisant pour la première fois cette techno- logie innovante rapportent une positivité en ARNm E6/E7 équivalente à la positi- vité ADN HPV dans les lésions de haut grade validées en histologie (fig. 13). En revanche, la prévalence en ARNm E6/E7 serait deux fois plus faible que la préva- Fig. 11 - Technique NASBA.
Fig. 12 - Technique NASBA (Norchip).
lence en ADN HPV en cas de frottis LGSIL ou ASC-US, conduisant à une améliora- tion de la spécificité du test HPV. Si ces résultats nécessitent confirmation par d’autres études et sur des cohortes plus importantes, la détection des ARNm E6/E7 apparaît prometteuse. En particulier, il pourrait être intéressant de l’utiliser après un test ADN HPV positif en cas de cytologie normale, s’il était confirmé que l’ab- sence de détection de transcrits E6/E7 est en faveur d’une infection HPV à très faible risque d’évolution.
Apport de la P16ink4a dans le dépistage et le diagnostic
La P16 est un inhibiteur de la cycline kinase (CDK) qui décélère le cycle cellulaire en inactivant les CDK qui assurent la phosphorylation de la protéine du rétinoblastome (Rb). Dans les CIN 3 et les cancers du col, l’immunomarquage de la P16 est augmenté.
La présence de la P16 est directement ou indirectement liée aux HPV à risque, proba- blement du fait de la production accrue des oncoprotéines E6 et E7 dont la liaison aux protéines p53 et pRb sont nécessaires à la transformation. L’expression de la P16 est le témoin de l’expression des oncogènes viraux E6/E7 dans les cellules dysplasiques. Par voie de conséquence, les anomalies cytologiques ou histologiques qui ne sont pas asso- ciées aux HPV à risque n’expriment pas la P16.
Partant de ce constat, il a été possible d’utiliser des méthodes de marquage immu- nochimique de la P16 en histologie ou en cytologie pour augmenter la performance du diagnostic ou du dépistage.
Pour résumer les études actuelles portant sur l’histologie, on peut dire que la P16 est un marqueur performant pour identifier les CIN 1 HPV à risque positif et à risque évolutif. Compte tenu de la reproductibilité faible de ces lésions, la technique augmente nettement la concordance diagnostique. Elle est aussi un bon marqueur de risque des Fig. 13 - PreTect® HPV Proofer, Norchip.
CIN 1 à prendre en charge. L’intérêt de la P16 dans les CIN de haut grade n’est pas démontré. La surexpression de la P16 est considérée comme un bon marqueur biolo- gique de dysplasie dans les lésions cervicales utérines. Les lésions endocervicales parais- sent moins faciles à diagnostiquer, surtout en cas de métaplasie tubaire ou tubo-endo- métriale qui sont P16 +. Si cette positivité peut constituer une source d’erreur, notam- ment dans le diagnostic des lésions endocervicales, elle reste un marqueur biologique de référence dans les lésions exocervicales liées à l’HPV.
Si l’on quantifie l’expression de la P16 avec un score de 0 à 8, la P16 exprime le meilleur score dans les AIS (7,4 ; p < 0,0001) et dans les ADK invasifs (6,6 ; p < 0,0001), tandis que les contrôles n’ont un score que de 0 à 2.
Un seuil d’expression à 5 a une sensibilité de 94,5 % et une spécificité de 100 %.
Quatre-vingt-huit pour cent des carcinomes invasifs étaient HPV +.
La surexpression de P16 reflète donc essentiellement les altérations du cycle cellu- laire HPV induites.
L’intérêt de l’utilisation de la P16 est de mettre en évidence une infestation virale persistante par un HPV oncogène (marquage franc et intense des noyaux et des cyto- plasmes), de trier les CIN 1 en P16 + et P16 – et de distinguer les métaplasies imma- tures des lésions liées aux HPV (fig. 14, 15, 16).
En cytologie, l’immunomarquage P16 permet d’identifier les anomalies à risque (fig. 17). Le triage des ASC-US est l’une des indications.
Dans ce contexte, la P16 est moins sensible et plus spécifique que le test HPV.
Actuellement, il y a encore des situations où la P16 manque de performance, en parti- culier certains cas de métaplasie malpighienne immature P16 peuvent être marqués P16 sans présence d’ADN viral HPV. Les études sont en cours pour préciser les moda- lités d’application pratique de cette technique.
Conclusion
Les nombreuses controverses de la littérature concernant la sensibilité des tests HPV dans les lésions du col utérin provenaient de techniques plus ou moins efficaces.
Actuellement, les méthodes les plus performantes sont donc, d’une part les réac- tions de PCR avec détection finale d’HPVs sur microplaque ou sur bandelette et, d’autre part, l’hybridation en phase liquide avec détection luminométrique. La détection des HPV sera dans les prochaines années un outil indispensable au dia- gnostic, au suivi des lésions du col utérin et à la mise en place des vaccinations pro- phylactiques et/ou thérapeutiques.
Le tableau I et la figure 18 résument la place des tests morphologiques, biolo- giques et moléculaires dans le diagnostic et le dépistage des lésions cervicales. Si la recherche de l’ADN viral apparaît comme le marqueur le plus sensible et le plus pré- coce, sa spécificité n’est pas optimum. De fait, son intérêt se positionne plus dans le dépistage primaire, en particulier après l’âge de 30 ans, et dans le triage des ASC-US.
Les marqueurs moléculaires vont avoir un intérêt dans le diagnostic histologique, en particulier pour distinguer les CIN 1 à risque évolutif et la métaplasie malpighienne immature d’évaluation difficile avec les CIN de haut grade.
Fig. 15 - Après le marquage P16 : CIN 2.
Fig. 14 - Avant le marquage P16 : une métaplasie malpighienne.
Fig. 17 - Marquage P16ink4a en cytologie.
Fig. 16 - Métaplasie de diagnostic difficile : P16+ : CINHG de haut grade.
Méthode Sensibilité Spécificité Commentaire
Frottis (cytologie) Moyenne Moyenne Facile, peu coûteux mais subjectif
Dot Blot Moyenne Moyenne Radioactive,
sophistiquée
Hybridation Moyenne Moyenne Détection sur lame
in situ à partir des blocs de
paraffine (histologie)
Southern Blot Moyenne Moyenne Gold standard,
technique sophistiquée
Hybrid capture Élevée Élevée Simple à réaliser,
(2eversion) reproductible, pas
très coûteuse
PCR Élevée Élevée Reconnaît les
différents types viraux, risque de contamination (faux positifs)
Fig. 18 - Place des tests morphologiques, biologiques et moléculaires dans le diagnostic et le dépistage des lésions cervicales.
Tableau I - Comparaison des différentes méthodes disponibles pour la détection des HPV.
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