Capitolo 6
Materiali e Metodi
Lo studio ha coinvolto 8 pazienti affetti da MH (Tab 1) e 9 controlli appaiati per età, sesso e scolarità (Tab 2).
N Sesso CAG S&F UHDRS Età esordio
Età Scolarità Terapia
1 M 15/43 II 33 52 57 13 Amantadina, 2 M 18/40 II 50 59 77 5 Mirtazapina, Tetrabenazina 3 M 15/40 II 39 49 55 8 Tetrabenazina, Valproato 4 M 14/36 II 35 60 76 5 Tetrabenazina, Valproato, Paroxetina 5 M 15/45 II 29 36 47 13 Pramipexolo 6 F 15/40 II 28 58 60 5 Amantadina, Valproato 7 M 16/42 II 26 44 52 8 Tetrabenazina, Valproato 8 M 14/37 II 40 76 78 5 Amantadina
N Sesso Scolarità Età 1 M 13 71 2 M 13 58 3 F 5 66 4 M 5 68 5 M 5 69 6 M 5 75 7 M 13 45 8 M 8 73 9 M 5 78
Tab 2 Caratteristiche popolazione controllo
Al fine di limitare l’effetto degli ormoni sessuali sui livelli di OT sono stati selezionali prevalentemente soggetti di sesso maschile (7/8 nei pazienti e 8/9 nei controlli) e i soggetti di sesso femminile inclusi erano entrambi in menopausa. Tutti i pazienti hanno sospeso terapia con neurolettici o antidepressivi almeno un settimana prima dello studio e i due soggetti di sesso femminile non praticavano terapia ormonale sostitutiva.
6.1 Valutazione clinica motoria
Al fine di valutare eventuali modificazioni sul piano motorio tutti i pazienti sono stati sottoposti a valutazione clinica mediante scala Unified Huntington’s Disease Rating Scale (UHDRS) con particolare attenzione all’item motorio. Il punteggio varia da 0 a 90 con punteggi più bassi in caso di minor gravità motoria [Huntington study group 1996].
6.2 Valutazione clinica neuropsicologica
I test utilizzati per la valutazione neuropsicologica di screening di ciascun ciascun soggetto sono i seguenti:
- Punteggio Mini Mental State Examination (MMSE) [Folstein MF et al J Psychiatr Res 1975]: test che indaga lo stato cognitivo globale. Punteggio varia da 0-30.
- Punteggio alla Montreal Cognitive Assessment (MoCA) [Nasreddine ZS et al I Am Geriatr Soc 2005]: strumento di screening di rapida somministrazione, indaga 8 diversi domini cognitivi. Punteggio varia da 0-30.
- Punteggio Frontal Assessment Battery (FAB) [Dubois B et al Neurology 2000]: breve test di screening delle funzioni esecutive. Si
mentale, programmazione motoria, sensibilità all’interferenza, controllo dell’inibizione e autonomia ambientale. Il punteggio varia da 0-18.
- Punteggio Test Intelligenza Breve (TIB) [Sartori G et al 1997]: questo test si basa sulla correlazione tra intelligenza generale e abilità di lettura. Esso consiste in un rapida prova di lettura di 54 parole ad accentazione regolare/irregolare la cui lettura permette di stimare il QI. Può essere somministrato in qualsiasi soggetto dai 20 anni in su. Ogni parola viene presentata su un cartoncino con la richiesta di lettura a voce alta.
Per la valutazione della cognizione sociale, in seguito al prelievo ematico per il dosaggio di Ossitocina ciascun soggetto è stato sottoposto ai seguenti test:
- Riconoscimento dell’espressione dei volti secondo la scala Karolinska Directed Emotional Faces (KDEF) [Lundqvist D et al CD ROM from Department of Clinical Neuroscience, Psychology section, Karolinska Institutet, ISBN 91-630-7164-9]: vengono proposte al paziente 28 immagini di volti (14 di sesso femminile e 14 di sesso maschile) raffiguranti 6 possibili espressioni (4 ciascuna tra felicità, rabbia, disgusto, stupore, tristezza, paura) o espressione neutra le rimanenti. Ad ogni soggetto viene chiesto di identificare l’espressione del volto rappresentato, scegliendo tra un elenco di possibili espressioni, e di identificare il sesso del soggetto raffigurato. Il punteggio varia da 0-28. - Punteggio al test “faux pas task” [Stone VE et al J of Cog Neuroscience 1998]: vengono proposte al paziente 10 storie, 5 “faux-pas” FP/FP e 5 neutre N/FP, chiedendo di identificare un eventuale comportamento scorretto da parte di un soggetto A nei confronti del soggetto B, il test prevede anche per ogni storia due domande di controllo
per verificarne la comprensione (FP/C e N/C). Il punteggio viene calcolato FP/FP 0-30, N/FP 0-10, FP/C e N/C 0-10.
- Punteggio al test di attribuzione delle emozioni mediante stimolo Verbale [Prior M et al 2003 versione in italiano]: il test si propone di indagare l’abilità di attribuire stati emotivi ad altre persone. Si compone di 15 brevissime scene che descrivono situazioni emotigene, fanno riferimento a 5 emozioni (3 ciascuna) felicità, tristezza, rabbia e disgusto. Il punteggio varia da 0-15.
- Punteggio al test “Strange Stories” [Happé F et al 1999; Prior M et al 2003 versione in italiano]: test che consente di indagare la capacità del soggetto di immedesimarsi negli altri e comprenderne gli stati mentali. Il test si compone di 13 brevi storie che descrivono situazioni sociali e familiari. Al soggetto viene chiesto, per ogni storia, di dire perché i protagonisti di volta in volta presentati si sono comportati in quel determinato modo. La comprensione di ciascuna storia prevede un’operazione di mentalizzazione ovvero di comprensione degli stati mentali altrui. Il punteggio varia da 0-13.
- Punteggio alla Vignetta Wilhelm Bush [Ioue Y et al 2004], famoso caricaturista Tedesco del diciannovesimo secolo. Il test prevede “false-belief” di primo e secondo ordine, comprensione del testo e deduzione tattica. Vengono presentate al soggetto 4 immagini raffiguranti una storia, il soggetto deve ordinare le vignette in senso logico e successivamente rispondere a domande inerenti sia mirate ad indagare la ToM che la comprensione della storia. Il punteggio varia da 0-4.
p<0.01. Successivamente sono state condotte indagini di correlazione non parametrica mediante Test di Spearman (p<0.05 e p<0.01) e indagini di regressione lineare multipla (p<0.05).
6.3 Valutazione livelli ematici ossitocina
Il dosaggio basale di OT è stato effettuato in tutti i soggetti tra le 08:00-09:00 di mattina dopo una notte di digiuno. La terapia farmacologica con neurolettici ed antidepressivi è stata sospesa nei 7 giorni prima dello studio.
Campioni biologici
Il prelievo di sangue venoso, di circa 15 ml, raccolto in provette contenenti EDTA (1mg/ml) e Aprotinina (1 mg/12 ml), è stato centrifugato a 2000-2500 x g per 15-20 minuti a temperatura ambiente. Il plasma così ottenuto è stato acidificato mediante diluizione 1:1 (v:v) in 0.1M HCl e centrifugato a 48,000 x g. Il sovranatante è stato recuperato e caricato, per la procedura di estrazione in fase solida, su colonnine Sep-pak C-18 (Waters), precedentemente attivate mediante trattamento con 10 ml di metanolo e 20 ml di H2O. Il caricamento della colonna C18 di estrazione determina
l’eliminazione di molte componenti aspecifiche plasmatiche mentre trattiene l’OT, peptide di natura lipofila, contenuta nel campione; la colonna C18 è stata lavata con 10 ml di acido acetico al 4% per eliminare ulteriori contaminanti e l’OT recuperata successivamente dalla C18 facendo passare 2 ml di metanolo. Questo eluato finale in metanolo è stato portato a secco in un concentratore a centrifuga tipo SpeedVac collegato a trappola di condensazione vapori a -80° (Savant).
L’essiccato ottenuto seguendo questa procedura è stato poi conservato a -80°C fino al momento del dosaggio.
Dosaggio dell’ossitocina
Al momento del dosaggio i campioni essiccati e conservati a -80° sono stati portati a temperatura ambiente e ripresi in 150 µl di tampone, permettendo così di concentrare notevolmente la quantità di OT presente nel plasma. Per la misura dei livelli plasmatici di OT è stato utilizzato un kit EIA (Enzyme ImmunoAssay) colorimetrico di tipo competitivo per la determinazione quantitativa del nonapeptide in campioni biologici (Oxytocin Enzyme Immunoassay kit, Enzo Life Sciences). Il kit comprende una micro piastra a 96 pozzetti il cui fondo è rivestito di Anticorpo anti-IgG di capra anti-coniglio, ai quali si lega un Anticorpo specifico per OT provvisto nel kit (Fig 3).
Fig. 3 Dosaggio EIA competitivo per la determinazione dell’OT plasmatica
- Micropiasta - pozzetto
-Anticorpo adeso di capra anti-IgG coniglio -Anticorpo di coniglio IgG anti-OT
-OT, ossitocina coniugata con E (enzima, fosfatasi alcalina)
-S, pNpp, substrato incolore e P, prodotto,
pNp, giallo (lettura a 405 nm)
P
P
-OT, ossitocina non marcata del campione o degli STD
Il kit, oltre a tutte le altre soluzioni e tamponi necessari, fornisce l’OT standard (10,000 pg/ml) da diluire per la retta di calibrazione (15.6-1000 pg/ml) e l’OT coniugata covalentemente all’enzima fosfatasi alcalina il quale, in presenza del substrato p-Nitrofenilfosfato (pNpp), catalizza la reazione di formazione del prodotto colorato p-Nitrofenolo. Successivamente, in pozzetti separati, sono stati aggiunti 100 µl delle varie diluizioni della retta di calibrazione e dei campioni concentrati assieme a 50 µl di OT coniugata e 50 µl di anticorpo policlonale di coniglio anti-OT. In questo modo si realizza una competizione, per il legame al secondo anticorpo anti-OT, tra: a) l’OT endogena non marcata a contenuto incognito nel campione o b) l’OT a contenuto noto (retta di taratura), e l’OT coniugata con l’enzima fosfatasi alcalina. Dopo opportuna incubazione e lavaggi, è stato aggiunto il substrato della fosfatasi alcalina: la colorazione finale dovuta alla formazione del prodotto risulta quindi proporzionalmente inversa alla quantità di OT non marcata presente in ogni pozzetto, misurata a 405 nm mediante spettrofotometro Victor Wallac (Perkin Elmer). Dall’analisi della retta di calibrazione sono state estrapolate le concentrazioni incognite di OT nei campioni. Il kit è fornito di controlli di qualità interni per la valutazione di accuratezza e precisione del metodo; il metodo possiede una massima selettività (assenza di cross-reazioni con la vasopressina) ed è molto sensibile, potendo dosare quantità di OT pari a circa 12 pg/ml (Fig 4).
10 100 1000 0 20 40 60 80 100 log conc % A b s /A b s T
Fig. 4 Curva di calibrazione per la determinazione dell’OT plasmatica (%Abs/Abs T: %
Abs 405 nm nel campione vs. Abs totale (100%)
