INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE
Bloccanti dei canali BK
CaBK bloccanti di origine sintetica
Questa classe di composti risulta numericamente e qualitativamente molto limitata: ne fanno parte il tetraetilammonio cloruro e la 4-aminopiridina.
Il tetraetilammonio (TEA) è stato il primo bloccante dei canali BK ad essere utilizzato, ed è ancora ampiamente usato nel campo della ricerca, sebbene non presenti un’elevata selettività nei confronti dei canali BK. Il TEA è infatti capace di legarsi e di bloccare, con diversi gradi di affinità, anche altri tipi di canali al K+ (Hermann e Gorman, 1981). N+ H3C H3C CH3 CH3
Struttura TEA (tetraetilammonio)
La 4-amminopiridina è un bloccante più potente del TEA: inibisce in modo reversibile la corrente di ioni K+ attraverso i canali BK e blocca anche molti sottotipi dei canali KATP e KV. Nonostante questo si
preferisce l’uso del TEA, in quanto sembra che i suoi effetti siano dovuti ad una variazione del pH intracellulare piuttosto che ad una
interazione con un sito di legame specifico del canale BK (Petkova-Kirova et al., 2000). N NH2 Struttura 4-amminopiridina
L’attività BK-bloccante è una proprietà farmacologica anche di alcuni farmaci commerciali, tra cui la trifluoperazina dicloridrato (Ikemoto et al., 1992) e il troglitazone (Li et al., 2000). La prima è una nota fenotiazina la cui azione è tutt’altro che selettiva in quanto in grado di bloccare anche le correnti del calcio e del sodio (Ogata et al., 1990). Il secondo è un tiazolidindione, utilizzato come ipoglicemizzante orale, anch’esso non selettivo nell’azione BK-bloccante perché capace di bloccare anche i canali KATP (Wu, 2003).
Infine un indolo (brevettato) è stato descritto come un potente e selettivo BK-blocker (Olesen et al., 1992), la sua struttura chimica è molto interessante e giustifica ulteriori studi. Questa molecola mostra affinità con alcuni noti BK-openers benzimidazolonici, suggerendo un probabile sito d’azione comune sia per attivatori che inibitori.
N
OCH3
Derivato indolico brevettato
BK bloccanti di origine naturale, tossine peptidiche
Alcuni peptidi isolati dal veleno di scorpione sono i BK inibitori più selettivi e potenti che, ad oggi, si conoscano. La più semplice e soddisfacente classificazione delle tossine scorpioniche le raggruppa in tre famiglie sulla base della loro struttura primaria. I componenti più noti di questa classe di bloccanti sono la Caribdotossina (ChTX) e l’Iberiotossina (IbTX)
La prima è un peptide, formato da 37 aminoacidi, isolato dal veleno dello scorpione Leiurus quinquestriatus, rappresenta il primo bloccante con un soddisfacente grado di selettività nei confronti dei canali BK (Miller et al., 1985). Questo peptide ha una complessa struttura terziaria con tre ponti disolfuro, formati da residui di cisteina, ed è in grado di bloccare il canale a livello del vestibolo esterno del poro, a concentrazioni nanomolari (MacKinnon e Miller, 1998). Sfortunatamente la ChTx esibisce proprietà bloccanti anche nei
confronti di alcuni sottotipi di canali al potassio voltaggio-dipendenti e questo rappresenta una condizione limitante per il suo utilizzo nella sperimentazione (Attali et al., 1992).
L’Iberiotossina (IbTx), un altro peptide di 37 aminoacidi isolato dal veleno dello scorpione Buthus tamulus e strettamente analogo alla ChTx, rappresenta il primo esempio di bloccante dei BK ad elevata selettività (Candia et al., 1992). Il suo meccanismo d’azione è simile a quello della ChTx: si lega al vestibolo esterno del poro del canale tramite un residuo di Lys, presente nella sequenza peptidica, e attraverso interazioni idrofobiche ed elettrostatiche. Il legame ostacola l’efflusso degli ioni K+ attraverso il canale (Kaczorowski e Garcia, 1999).
BK bloccanti di origine naturale non peptidici
Tra i composti naturali non peptidici in grado di bloccare i canali BK troviamo dei diterpeni indolici che appartengono alla famiglia degli alcaloidi fungini (Knaus et al., 1994): paxillina e penitrem A. Studi recenti hanno mostrato che questi composti possono produrre un blocco del 50% del canale a concentrazione minori di 0,1 nM; rappresentano perciò i bloccanti non peptidici più potenti dei canali BK (Garcia et al., 1995).
Inoltre sembra che la tetrandina, un alcaloide chinolinico estratto dalla radice della pianta medicinale Stephania tetrandrae, possa essere inclusa tra i bloccanti selettivi dei canali BK (Wang e Lemos, 1992). La chinina e la chinidina, due alcaloidi isolati dalla specie Cinchona, sono bloccanti dei canali BK e IK (Cook, 1990), ma inattivano anche altri canali del K+ e hanno effetti rilevanti sulle correnti di Ca2+ e Na2+. La disponibilità di bloccanti selettivi dei canali BK rappresenta uno strumento fondamentale ai fini della ricerca. Una possibile applicazione terapeutica di alcune di queste molecole sembra però ristretta al campo dei disordini neurologici, come depressione e perdita della memoria (Olesen et al., 1994)
Attivatori dei canali BK
CaBK attivatori di origine naturale
I BK openers di origine naturale appartengono a poche eterogenee classi strutturali: saponine, terpeni, flavonoidi. Uno dei composti più noti appartenenti a questa classe è sicuramente la diidrosoiasaponina I (DHS-I), un glicoside isolato da una specie di pianta usata in Ghana, il
Desmodium adscendens (Papillonaceae), e usato come rimedio contro l’asma ed altri stati patologici associati alle disfunzioni delle risposte contrattili della muscolatura liscia. Questa molecola mostra proprietà
attivanti nei confronti dei canali BK, ma solo quando le subunità α e β sono coespresse (McManus et al., 1993; McManus et al., 1995).
Inoltre le sue proprietà BK attivanti sono evidenti solo quando è somministrata a livello del lato citoplasmatico del canale e, di conseguenza, data la sua scarsa capacità di permeazione della membrana, è estremamente difficile studiare la sua attività farmacologica in vitro.
In vivo, invece, la DHS-I è probabilmente metabolizzata ad altri agenti attivi che penetrano più facilmente all’interno delle cellule. A seguito della scoperta delle proprietà farmacologiche della DHS-I, la ricerca di BK-openers naturali ha fornito un buon numero di prodotti interessanti.
Il diterpene maxikdiolo, ottenuto tramite processo di fermentazione di un fungo, un Coelomycete non ancora identificato e studiato nei miociti dell’aorta di bovino, produce un’attivazione potente dei canali BK se applicato sul versante citoplasmatico del canale, e non richiede la coespressione della subunità β (Singh et al., 1994).
Recentemente sono state studiate ed evidenziate su canali BK umani le proprietà BK-attivanti dell’acido pimarico (PiMA), un diterpene strutturalmente correlato al maxikdiolo ed ampiamente espresso nella resina delle piante del genere Pinus. Il PiMA sembra agire solo sulla
subunità α del canale BK. Altri analoghi terpenici, quali l’acido abietico, lo sclareolo e il metil pimarato, nonostante le modeste differenze strutturali, non mostrano altrettante proprietà farmacodinamiche BK-attivanti, e ciò ha suggerito ad alcuni autori uno studio sulle possibili relazioni struttura-attività (Imaizumi et al., 2002). Altri derivati terpenici, strutturalmente non correlati con quelli discussi sopra, ed isolati dal fungo Trichoderma virens, sono stati descritti come BK-attivatori. Tra questi, il sesquiterpene CAF-603 nonostante non abbia effetti consistenti sulle correnti BK, ha mostrato una potente capacità di spiazzare la ChTX radio marcata in membrane sarcolemmatiche di aorta. L’introduzione di una funzione esterea in posizione 8, per fornire l’estere dell’acido oleico L-735,334, Anch’esso isolato dal Trichoderma virens, determina un incremento della probabilità di apertura dei canali BK, ma solo quando applicato sul lato citoplasmatico del canale.
Un’altra classe strutturale chimica di BK-openers è rappresentata dai composti (poli)fenolici, tra questi ricordiamo il trans-resveratrolo. Questa molecola è ritenuta uno dei principi attivi di numerosi rimedi erboristici tra cui il Polygonum cuspidatum, le cui radici, seccate ed infuse, sono usate nella medicina popolare cinese e giapponese per il trattamento di patologie cardiache e vascolari.
Una ulteriore classe di BK-openers naturali è rappresentata dai flavonoidi, come dimostrato dalla possibile equivalenza farmacoforica e sovrapposizione strutturale del nucleo fenil-benzopiranico con il BK-opener prototipo NS-004. Alcuni studi hanno dimostrato l’effettiva attività di BK-opener della apigenina e del kaempferolo. Anche la apigenina, un flavonoide che presenta caratteristiche simili a quelle del resveratrolo, e altri flavonoidi (quali la naringenina, l’esperitina, la luteolina e il 5-idrossiflavone) hanno dimostrato di essere BK-openers iberiotossina-sensibili in oociti di Xenopus iniettati con mSlo e in anelli di aorta di ratto (Calderone et al., 2004).
OH HO OH O HO OH O OH
Struttura Resveratrolo Struttura Naringenina
Altri flavonoidi, quali il 5-metossiflavone e il 7-idrossi flavone, inducono effetti vasorilascianti non iberiotossina-sensibili (e quindi indipendenti dai canali BK), indicano che la presenza del gruppo ossidrilico in posizione 5 del nucleo benzopiranico è un importante requisito strutturale per l’attivazione dei canali BK.
In tale classe chimica, infine, può essere inclusa anche la phloretina le cui proprietà BK-attivanti sono state studiate nelle fibre nervose dello
Xenopus laevis.
Vale la pena di menzionare anche un derivato semisintetico, la vinpocetina, le cui proprità farmacologiche (neuroprotettivo, anticonvulsivante e potente vasodilatatore cerebrale) sono state ampiamente utilizzate in ambito clinico in varie sindromi cerebrovascolari. Tale alcaloide sintetizzato dalla vincaina (a sua volta isolata dalle foglie della Vinca minor) ha mostrato la capacità di attivare i canali BK di alcune linee cellulari di ratto. Resta tuttavia da chiarire se l’azione BK-attivante sia responsabile anche dei suoi effetti terapeutici.
Anche l’acido nordiidroguaiaretico attiva i canali BK nelle cellule del muscolo liscio delle coronarie di maiale (Nagano et al., 1996).
BK attivatori di origine sintetica
Solo negli ultimi dieci anni i canali BK sono stati studiati come bersaglio di farmaci selettivi e dallo sviluppo degli arilbenzimidazoloni sono derivati i primi BK agonisti. Le molecole pioniere che hanno esibito questo meccanismo d’azione e che sono divenute modello di riferimento per la progettazione di nuovi
BK-openers, sono i derivati benzilimidazolonici NS-004 e NS-1619 (Olesen et al., 1992).
Dall’apertura dell’eterociclo del benzoimidazolone NS-004 sono stati sintetizzati alcuni derivati della biarilurea esemplificati da NS-1608, un agonista BK strettamente correlato con NS-004 (Olesen et al., 1994)
L’inserimento di uno spaziatore etilenico tra la porzione arilica e l’anello benzimidazolonico dei composti di riferimento, portò ad ottenere il derivato benzil-benzimidazolone rappresentato da BMS-189269, provvisto anch’esso di effetti stimolanti sul canale BK.
N H N F3C O Cl OH N H N F3C O F3C OH Struttura NS-004 Struttura NS-1619 HN H N F3C O Cl OH N H N F3C O Cl OH Struttura NS-1608 Struttura BMS-189269
Oltre al ponte etilenico, lo studio delle relazioni struttura-attività ha portato a desumere la fondamentale importanza della presenza di gruppi elettron-attrattori e donatori di legami a H.
N H N O OH F3C Modifiche strutturali di NS-004
Infatti l’introduzione di uno spaziatore etilenico fra i due nuclei, così come la rimozione dell’atomo di cloro in posizione 5 dell’anello fenolico di NS-004, la sostituzione del gruppo trifluorometilenico del nucleo benzimidazolonico con l’isosterico, ma elettron-donatore, gruppo etilenico, o l’eliminazione di un potenziale donatore di legami a idrogeno, determinano una notevole diminuzione dell’attività farmacologica (circa 1000 volte per il composto sopra raffigurato). Probabilmente i gruppi elettron-attrattori sono fondamentali per incrementare l’acidità delle funzioni NH ammidica e OH fenolica e/o per modularne la capacità di formazione di legami a idrogeno. Tali considerazioni hanno portato alcuni autori a postulare che l’idrogeno e l’ossigeno ammidico così come l’ossigeno ammidico e l’idrogeno
fenolico, possono essere considerati un surrogato di una funzione carbossilica di un ligando endogeno, quali l’L-dopa.
Altri autori invece suggeriscono che il nucleo imidazolonico possa mimare un gruppo fosfato e coinvolgere così altri tipi di ligandi. In ogni caso la comparazione delle strutture chimiche dei BK-openers con potenziali ligandi endogeni è oggi troppo prematura.
La presenza del nucleo benzilimidazolonico non sembra comunque essere indispensabile per l’attività BK-openers, e questo risulta dalla valutazione di una serie di arilindoloni, BK-attivatori che possiedono analogie strutturali con NS-004 (Wu et al., 1999). La sostituzione del gruppo idrossilico nella posizione 3 di questi derivati con un gruppo triflato ha dato vita ad un nuovo gruppo di BK-openers (per esempio BMS-204352), studiati come agenti neuroprotettivi (Hewawasam et al., 2000). Un modello originale, che ha alcune caratteristiche strutturali simili alle molecole indoliche e ureiche precedentemente viste, è il BK-openers N-aril-N’indolil-urea CGS-7181, con molti altri composti correlati (Hu et al., 1997).
H N F3C O Cl OH HO N F3C COOH OH O NH CH3
Struttura composto arilindolonico Struttura CGS-7181
L’eterociclo chinolonico rappresenta una ulteriore alternativa di scelta per rimpiazzare l’anello benzilimidazolonico. Il derivato nella figura seguente (ancora un analogo di NS-004) e altre molecole simili rappresentano nuovi potenziali attivatori dei canali BK (Hewawasam et al., 1999). H N F3C NH2 Cl OH O
Struttura der. chinolonico
N H N Et O N N Et O Et
Alcuni recenti composti mantengono l’anello benzimidazolonico, ma mostrano, comunque, grandi differenze strutturali rispetto agli etero cicli precedentemente descritti. I due composti precedentemente raffigurati sono rappresentativi di tale classe, possiedono proprietà attivanti nei confronti dei canali BK, ma anche di altri sottotipi di canali del potassio calcio-attivati (Teuber et al., 2000).
Negli ultimi anni le ricerche della Bristol-Meyer Sqibb Company hanno portato all’individuazione di un gran numero di attivatori BK, con originali caratteristiche strutturali (Gribkoff et al., 1998; Hewawasam et al., 1999). Queste molecole, rappresentate dalla formula generale in basso, possono essere relazionate alla struttura di riferimento NS-004, benché private dell’anello benzimidazolonico e altri nuclei biciclici. Il triazolone e l’ossadiazolone sono due molecole rappresentative di questa serie.
(CH2)n Het (CH2)m OH
R2 R1
Het: porzione eterociclica variabile R1 e R2: sostituenti variabili
n e m: possono essere uguali a 0 o 1
