Materiali e Metodi
TER
Tris 10 mM pH 8.0 EDTA 1 mM pH 8.0 RNase A 100 µg/ml
2.2.c Estrazione di DNA plasmidico su media scala
mediante colonne NUCLEOBOND (midi-prep)
Questa tecnica prevede l’utilizzo di colonnine cromatografiche “NUCLEOBOND” (Macherey-Nagel) a scambio ionico, disponibili in commercio insieme alle soluzioni necessarie per il loro impiego. Con questa procedura è possibile estrarre da 80 a 140 µg di DNA altamente purificato, per ogni passaggio di purificazione (abbiamo ripetuto tre passaggi di purificazione). Si procede, similmente alla “mini-prep”, con un inoculo in 100 ml di mezzo selettivo (LB con ampicillina 100 µg/ml). Dopo incubazione a 37°C in agitazione o/n, si procede alla centrifugazione della crescita batterica a 4000 RPM per 20 minuti. Il pellet così ottenuto viene risospeso in 12 ml di soluzione S1; si aggiungono quindi 12 ml di S2, si risospende delicatamente con la pipetta, lasciando a temperatura ambiente per 5 minuti. Dopo aver aggiunto 12 ml di S3 ed aver capovolto delicatamente, si incuba in ghiaccio per 10 minuti; segue una filtrazione su carta per ottenere un lisato limpido.
Si procede, a questo punto, con l’estrazione su colonna: si equilibra una colonna cromatografica AX-100, caricandola con 2 ml di soluzione N2, la cui eluizione avviene per gravità. Si carica poi un’aliquota di lisato filtrato. In
Materiali e Metodi
questo passaggio il DNA si lega alla resina; i due passaggi successivi, effettuati con 4 ml di soluzione N3 servono a purificare il DNA dai sali e dall’RNA residuo. L’eluizione del DNA dalla colonnina viene effettuata tramite un lavaggio con 2 ml di soluzione N5. Il protocollo viene ripetuto tre volte e all’eluato vengono aggiunti, alla fine, 0,7 V di isopropanolo, per favorire la precipitazione del DNA mediante centrifugazione a 4°C per 20 minuti a 12000 RPM. Il pellet viene lavato con EtOH al 70% e risospeso in TE pH 8 (o in H2O mq).
Per stimare la quantità del DNA estratto è possibile sottoporre un’aliquota ad elettroforesi su gel di agarosio, oppure, se si desidera ottenere una stima più precisa, si può ricorrere ad una lettura spettrofotometrica. Con lo spettrofotometro si può ottenere la misura della concentrazione di campioni diluiti della preparazione in esame, ricavata dall’assorbanza A alla lunghezza d’onda λ = 260 nm, secondo la legge di Lambert-Beer:
A = ε . c . l
in cui ε rappresenta il coefficiente di estinzione, caratteristico della molecola in esame, c la concentrazione molare della specie in esame ed l il cammino ottico. E' anche possibile valutare la misura della purezza del DNA estratto, ricavata dal rapporto A260/A280.
Materiali e Metodi Soluzioni: S 1 RNasi A 100 µg/ml Tris-HCI 50 mM EDTA 10 mM pH 8.0 S 2 NaOH 200 mM SDS 1% S 3 CH3COOK 2.80 M pH 5.1 N 2 Tris 100 mM EtOH 15% KCl+H3PO4 900 mM pH 6.3 N 3 Tris/H3PO4 100 mM EtOH 15% KC1 1150 mM pH 6.3 54
Materiali e Metodi
N 5
Tris/H3PO4 100 mM
EtOH 15%
KC1+H3PO4 1000 mM pH 8.5
2.3 Digestione di plasmidi con enzimi di restrizione
(Sambrook et al., 1989)
Le digestioni dei vettori plasmidici sono state generalmente effettuate in un volume finale di 20 µl; la miscela di reazione è costituita dal DNA plasmidico, dall’enzima di restrizione (in concentrazione di 1-2 Unità Internazionali (UI) per µg di plasmide) e dal tampone specifico per il tipo di enzima utilizzato. Occorre che il volume di enzima aggiunto non superi 1/10 del volume della miscela di reazione, poiché un’eccessiva concentrazione di glicerolo, in cui gli enzimi sono conservati, può interferire con l'efficienza di reazione. La reazione di digestione viene fatta procedere, a 37°C, per 1-12 ore, in base alla quantità di DNA che deve essere digerito. Al fine di verificare se la digestione è completa, si carica e si sottopone ad elettroforesi su gel di agarosio all’1%, colorato con bromuro di etidio, 1/20 della reazione, confrontandone la mobilità con un’aliquota di plasmide non digerito. Se la digestione è completa, nella corsia del digesto si ottiene una banda unica (che teoricamente dovrebbe migrare più lentamente rispetto al DNA non digerito) piuttosto che due bande, corrispondenti a due diverse forme di superavvolgimento del plasmide circolare. In questo caso si può procedere con
