Capitolo 3 Realizzazione di Scaffold Geliformi Inglobanti Cellule

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Capitolo 3

Realizzazione di Scaffold Geliformi

Inglobanti Cellule

Dopo una valutazione delle tecniche di microfabbricazione attualmente presenti, e la scelta di quella più opportuna per la realizzazione di strutture micrometriche geliformi con topologia definita, è stato condotto uno studio sui diversi idrogel presenti in commercio in grado di essere utilizzati con il sistema di microfabbricazione scelto. L’analisi delle caratteristiche chimico-fisiche, meccaniche e biologiche dei polimeri con proprietà geliformi, in particolare dell’alginato, ha confermato e promosso la possibilità di realizzare scaffold bioispirati con topologia definita. La scelta dell’alginato come idrogel ha indirizzato lo studio di questo lavoro verso la caratterizzazione delle variabili concorrenti alla determinazione delle dimensioni di realizzazione degli scaffold. In questo capitolo saranno trattate tutte le caratteristiche fondamentali per garantire la sopravvivenza di colture cellulari in sospensione all’interno di una struttura in alginato, verificando quali caratteristiche della soluzione polimerica utilizzata risultino migliori per lo scopo. Per verificare che le cellule inglobate nel materiale geliforme prescelto mantenessero una propria attività metabolica sono stati eseguiti dei test in coltura statica. Durante l’esecuzione dei test sono stati prelevati dei campioni di terreno di coltura ad intervalli temporali definiti al fine di ricavare un andamento dell’attività metabolica. In particolare è stata analizzata la variazione del consumo di glucosio e della produzione di urea nel tempo, indicatori del metabolismo e del catabolismo della linea cellulare in coltura. In base ai risultati ottenuti è stato possibile verificare che la

71 concentrazione dell’idrogel inglobante cellule non influenzi significativamente l’attività metabolica.

A questo punto del lavoro è stata rivolta l’attenzione alle grandezze meccaniche presenti con l’utilizzo della tecnica di microfabbricazione scelta. La linea cellulare selezionata per questo lavoro è HepG2, sensibile alla trasmissione delle forze e degli sforzi di taglio, e quindi in grado di fornire indicazioni per una corretta modellazione delle variabili meccaniche in gioco.

In questo capitolo verrà trattata la definizione di un protocollo da utilizzare con la tecnica di microfabbricazione selezionata. La caratterizzazione di alcune variabili e la misurazione di grandezze rilevanti è stata eseguita utilizzando gli stessi modelli trattati nei capitoli precedenti. Combinando il protocollo per la microfabbricazione con quello per la realizzazione di strutture con proprietà meccaniche definite entro un range di valori desiderato, permetterà la definizione di un iter procedurale per la realizzazione di scaffold geliformi topologicamente definiti ed inglobanti cellule. Per la validazione di questo innovativo sistema di fabbricazione saranno condotti ulteriori test cellulari per verificare che siano indotte alterazioni morfologiche e dell’attività cellulare.

3.1

S

Al fine di valutare la resistenza e la variazione della superficie nel tempo di strutture topologicamente definite, è stato condotto un test per la misurazione del coefficiente di swelling delle strutture di alginato realizzate con i protocolli definiti nei capitoli precedenti. Questa prova risulta essere necessaria non soltanto per verificare il comportamento della struttura geliforme nel tempo e nello spazio in specifiche condizioni ambientali, ma anche per verificare se la costante di dissociazione dell’alginato in soluzione acquosa risulti significativa per la stabilità della struttura.

L’utilizzo dell’alginato per l’incapsulamento di linee cellulari particolarmente sensibili è noto in letteratura1,2, e la resistenza del materiale ad eventuali attacchi chimici con le sostanze disciolte in qualsiasi terreno di coltura (DMEM, PBS, etc.)

72 risulta essere escluso3. Pertanto ci si aspetta che le strutture realizzate in alginato risultino stabili e resistenti in condizioni fisiologiche. Tuttavia è stato effettuato questo esperimento per verificare che le concentrazioni di alginato e dello ione calcio come agente reticolante utilizzate nei protocolli precedentemente definiti, risultino immuni a variazioni di forma e di stabilità.

L’esperimento è stato dunque condotto su campioni di alginato reticolato in composizione del 4%, 6% e 8% (peso/volume), ottenute dalla soluzione di un sale di alginato allo stato solido (Alginic acid sodium salt from brown algae A0682 Sigma) in acqua deionizzata e Cloruro di Sodio in composizione percentuale variabile. L’utilizzo del Cloruro di Sodio nella soluzione è stato descritto nei protocolli utilizzati nel capitolo precedente, al fine di ottenere una distribuzione omogenea dei legami di reticolazione. La reazione di reticolazione è stata indotta con soluzioni di Cloruro di Calcio (Calcium chloride dehydrated 06991, Fluka) in concentrazione 0.1M in acqua deionizzata. I campioni da analizzare nel test di swelling sono stati realizzati estrudendo linee di lunghezza pari ad 1 cm da una siringa da insulina, 1 mL con ago di 25 Gauge (BD PlastipackTM, ref 300014), corrispondenti ad un diametro interno di 0.241 mm. Per ogni composizione percentuale di alginato sono stati realizzati 3 campioni deposti sullo stesso vetrino: ogni campione risulta avere un diametro medio di 0.5 mm e una lunghezza di 1 cm, dimensioni che consentono una facile visualizzazione al microscopio. Infatti le linee di 1 cm possono essere riferite con sufficiente precisione rispetto al piatto del microscopio, consentendo la visualizzazione dello stesso punto durante ogni acquisizione. Il diametro di 0.5 mm inoltre permette la visualizzazione di entrambi i contorni, ciò risulta necessario per una migliore analisi statistica dei dati di swelling.

Una prima serie di dati è stata raccolta su campioni di alginato con agente reticolante CaCl2 0.1 M per un tempo complessivo di reazione di 2 minuti.

Successivamente è stato analizzato lo swelling di un campione di alginato al 6%, reticolato sempre con CaCl2 0.1 M, ma per un tempo complessivo di reazione di 10

minuti e 30 minuti per verificare se il tempo della reazione di reticolazione influenzasse lo swelling della struttura.

I campioni di alginato sono stati immersi in acqua deionizzata mantenuta costante alla temperatura di 37°C per tutta la durata dell’esperimento di swelling. La scelta

73 della temperatura è stata fissata per riprodurre le condizioni tipiche fisiologiche presenti in un incubatore; mentre la scelta di utilizzare acqua deionizzata è stata dettata al fine di valutare direttamente la dissociazione dello ione calcio con le catene polimeriche di alginato, senza subire interferenze dovute alla presenza di altri ioni in soluzione.

Date le dimensioni dei campioni non si è resa possibile una misurazione standard dello swelling, quale variazione percentuale della massa prima e dopo l’immersione in acqua come espresso dalla seguente espressione:

Rௌௐ = ൤൫ௐ೑_ௐିௐ_೔ ೔൯൨ 100;

in cui RSW è il coefficiente di swelling, Wi il peso del campione prima dell’immersione

e Wf il peso del campione all’istante del prelievo. Pertanto si è deciso di analizzare il

comportamento dei campioni da un punto di vista morfologico, cercando di monitorare le variazioni di larghezza del campione rispetto alla lunghezza iniziale. Inoltre in questo modo è possibile visualizzare se l’alginato mostra una dissociazione in acqua relativamente veloce. Tale comportamento indurrebbe una perdita di forma del campione. Il coefficiente di swelling è stato ridefinito come segue:

Lௌௐ = ቈ൫ܮ௙_ܮ− ܮ௜൯ ௜ ቉ 100

In cui Lf è la larghezza del campione all’istante in cui è acquisita l’immagine e Li è la

larghezza del campione all’inizio dell’esperimento, e LSW è in coefficienti di swelling

ridefinito. I campioni sono stati monitorati rispettivamente dopo 1 ora, 2 ore, 4 ore, 24 ore e 48 ore in soluzione acquosa con microscopio ottico (Olympus Provis, AX70), acquisendo le immagini digitali della porzione di campione in analisi.

Con l’utilizzo di un opportuno software4 per l’elaborazione grafica delle immagini è stato possibile eliminare il rumore di fondo che affligge le immagini acquisite, consentendo una analisi dei dati più precisa. Quindi sono stati misurati i contorni dei diversi campioni con una funzione di rilevamento bordi. Partendo da una immagine in bianco e nero precedentemente elaborata, è stata utilizzata una funzione istogramma (già implementata nel software utilizzato) in grado di restituire la distribuzione del valore cromatico dei pixel in funzione della larghezza

74 dell’immagine. È stato così possibile misurare la larghezza, in pixel, del campione di alginato, mediando la distribuzione dei contorni e misurandone la distanza. Queste operazioni di elaborazione delle immagini sono state ripetute per tutte le acquisizioni temporali dei diversi campioni, ricavando l’andamento temporale della variazione dei contorni dei campioni in esame. Dalla analisi della prima serie di campioni è possibile ricavare che la variazione della concentrazione di alginato in soluzione, a parità di tempo di reazione di reticolazione e di concentrazione di agente reticolante, non induce variazioni apprezzabili del coefficiente di swelling. In particolare, ad esclusione di rapide variazioni presenti nelle prime ore, è possibile assumere che il coefficiente sia mantenuto costante nel tempo intorno a valori del 5%. L’andamento del coefficiente di swelling LSW appena descritto è riportato nei

grafici seguenti.

Grafico 3.1: coefficiente swelling LSW dell’Alginato 4%

75 Grafico 3.3: coefficiente swelling L_SW dell’Alginato 8%

Risulta evidente in tutti i campioni un breve periodo di tempo (al massimo 2 ore) in cui la struttura di alginato tende ad aumentare la propria dimensione per inglobamento di molecole di acqua all’interno delle struttura tridimensionale polimerica. Questo comportamento si riflette in rapide variazioni del coefficiente di swelling. Tale fenomeno è dovuto all’elevata idrofilicità offerta dai gruppi carbossilici, estremità polari presenti sia nell’acido mannuronico che in quello guluronico dell’alginato e già descritte nel capitolo precedente. Tali estremità libere, non avendo legato con lo ione calcio, presentano comunque elevata affinità verso i composti polari, pertanto l’acqua, molecola piccola ed altamente polare, è in grado di diffondere all’interno della rete tridimensionale polimerica e di legare con interazioni elettrostatiche alle porzioni polari libere delle catene. Da quanto appena descritto risulta il rigonfiamento iniziale delle strutture di alginato. Tale rigonfiamento comunque non risulta essere così rilevante da indurre modificazioni sulla topologia dei campioni. Valori di LSW caratteristici per tutti i campioni analizzati

non superano coefficienti del 5%, pertanto è possibile assumere con approssimazione che la struttura non subisca variazioni rilevanti.

Nelle ore successive, causa la dissociazione dello ione calcio con le catene polimeriche e la continua interazione con le molecole di acqua, non è possibile apprezzare alcuna variazione dei contorni del campione, pertanto si può assumere che la dimensione raggiunta dal campione entro le prime ore di immersione sia mantenuta costante nel tempo. Dopo 48 ore i immersione i campioni mantengono

76 apparentemente la stessa forma di inizio esperimento, consentendo di ipotizzare che la costante di dissociazione dello ione calcio risulti relativamente bassa e quindi le proprietà meccaniche dell’alginato non subiscano variazioni apprezzabili dopo 48 ore di immersione in soluzione acquosa.

Nella seconda parte dell’esperimento è stato analizzato l’andamento temporale (grafici 3.4, 3.5, 3.6) del coefficiente di swelling al variare del tempo della reazione di reticolazione, mantenendo costante la percentuale di alginato in soluzione al 6% e la concentrazione dell’agente reticolante CaCl2 a 1M.

Grafico 3.4: coefficiente swelling L_SW dell’Alginato con tempo di reticolazione 2 minuti

77 Grafico 3.6 coefficiente swelling LSW dell’Alginato con tempo di reticolazione 30 minuti

Dall’analisi dei dati raccolti è possibile evincere che anche il tempo di reazione di reticolazione non modifica significativamente il coefficiente di swelling LSW, che si

mantiene costante intorno a valori del 5%. È possibile comunque evidenziare che per tempi lunghi di reticolazione (30 minuti) il coefficiente di swelling diminuisca di qualche valore percentuale. È possibile concludere da questa analisi che le strutture di alginato non swellano significativamente in soluzione acquosa ad una temperatura di 37°C, ed in particolare è possibile affermare che né la percentuale di alginato né il tempo della reazione di reticolazione hanno influenza rilevante sul coefficiente di swelling.

3.2

C

Dopo l’analisi delle proprietà meccaniche dell’alginato al 4%, 6% e 8% ottenuto con reazioni di reticolazione descritte nei capitoli precedenti per verificare la verosimiglianza del materiale scelto con la matrice extracellulare, è stata eseguita una analisi della stabilità e del mantenimento della forma delle strutture di alginato ottenute con la prova di swelling appena descritta. Dai risultati ottenuti da queste prove l’alginato si propone come materiale appropriato per la realizzazione di strutture micrometriche topologicamente definite e stabili nel tempo. A questo punto del lavoro di tesi è stato necessario verificare che le concentrazioni di

78 alginato suddette e precedentemente analizzate garantissero la diffusione dei nutrienti necessari a mantenere metabolicamente attive le cellule immerse. Per valutare la vitalità cellulare sono pertanto stati condotti dei test in vitro, in particolare questi test sono stati eseguiti su una sospensione di HepG2 (una linea cellulare di epatociti umani) in alginato a concentrazione variabile.

Per l’esecuzione di questi test è necessario disciogliere una frazione di alginato variabile in PBS, per garantire un ambiente asettico alle cellule in coltura la soluzione è stata sterilizzata con autoclave a 120°C per 30 minuti. Dopo aver riportato l’alginato ad una temperatura prossima a 37°C, la linea cellulare è stata inglobata nella soluzione di alginato con il seguente protocollo.

• Le cellule sono state tripsinizzate dalla piastra con 1/3 di tripsina e 2/3 di terreno di coltura (DMEM);

• La sospensione di cellule in terreno e tripsina è stata centrifugata a 900rpm; • Le cellule deposte sul fondo della provetta sono state prelevate e depositate

in una falcon da 5mL contenente Alginato sterile in percentuale variabile; • Dopo aver chiuso la falcon, la sospensione di cellule e alginato è stata agitata

con il Vortex per circa 5 minuti (il tempo è variabile in funzione della percentuale di alginato utilizzata);

• Dopo aver immerso omogeneamente le cellule nell’alginato, la sospensione è stata prelevata dalla falcon e deposta nei pozzetti di una piastra multiwell (pozzetti di diametro 1 cm);

• La reazione di reticolazione è stata promossa da una soluzione sterile di DMEM con lo 0.1 M di Cloruro di Calcio per 2 minuti, successivamente il terreno con CaCl2 è stato aspirato;

• Lo strato geliforme di cellule immerse in alginato è stato ricoperto con 0.5 mL di terreno di coltura DMEM e la piastra è stata inserita nell’incubatore. Sono stati eseguiti prelievi di terreno ogni 6, 24, 48 e 72 ore per analizzare l’andamento temporale della concentrazione di glucosio e urea, metaboliti primari di qualsiasi linea cellulare epatica. In particolare il glucosio è necessario per evidenziare il consumo metabolico delle cellule, mentre l’urea serve per evidenziare il catabolismo epatico.

79

3.3

A

R E ALIZZATIVI

Dopo i test eseguiti per valutare lo stato metabolico della linea cellulare HepG2, è possibile verificare se esiste qualche discriminante in grado di favorire la scelta di una concentrazione di alginato piuttosto di un’altra. In particolare si suppone che la diversa concentrazione di alginato possa influire sulla diffusione dei nutrienti principali quali glucosio ed ossigeno, una carenza di questi nutrienti infatti può indurre la morte per mancanza energetica nel regolamento del normale funzionamento del ciclo cellulare. Un altro fattore discriminante per la scelta della concentrazione ottimale dell’alginato può essere determinato dall’azione dello ione calcio sul ciclo cellulare. Come noto in letteratura lo ione calcio può promuovere, in relazione alle variazione del gradiente di concentrazione nel tempo e nello spazio, diversi processi cellulari; tali processi dipendono soprattutto dai recettori di membrana della cellula in esame e dalla sua attività6. Di fatto le linee cellulari epatiche non manifestano particolari interazioni con lo ione calcio, se non ad elevate concentrazioni. La scelta di utilizzare la soluzione di agente reticolante allo 0.1 M pertanto si propone di non influenzare significativamente l’attività delle cellule inglobate in coltura.

Dopo aver inglobato circa 3·105 cellule HepG2 in 1 mL di alginato a concentrazione del 4%, 6% e 8% con il protocollo descritto precedentemente, il mix è stato mantenuto il coltura standard statica in incubatore a 37°C con apporto di ossigeno ed anidride carbonica controllato. Contemporaneamente alle cellule inglobate nelle diverse concentrazioni di alginato è stata monitorata una coltura statica standard con 3·105 cellule HepG2 di partenza da utilizzare come controllo per l’analisi metabolica; inoltre è stato mantenuto un campione di solo terreno, da utilizzare come bianco per le analisi.

Le cellule in coltura sono state monitorate per una durata complessiva di 3 giorni, prelevando campioni dal terreno di coltura ogni 6, 24, 48 e 72 ore. Sui campioni prelevati sono state condotte analisi spettrofotometriche per la determinazione della concentrazione di glucosio ed urea, il primo indicatore del metabolismo cellulare ed il secondo del catabolismo epatico. Come è possibile notare dai grafici

80 seguenti tutti i campioni analizzati presentano un comportamento metabolico e catabolico standard e confrontabile con il controllo, manifestando un incremento sia del consumo di glucosio che della produzione di urea nel tempo.

Grafico 3.7: consumo di glucosio delle cellule HepG2 in sospensione nell’alginato

Grafico 3.8: produzione di urea delle cellule HepG2 in sospensione nell’alginato

Dall’analisi dei dati ottenuti è possibile evidenziare una differenza di concentrazione di glucosio ed urea del controllo rispetto alle cellule inglobate nell’alginato. Tale differenza è da ricondursi a due motivi principali. Il primo riguarda il diverso tipo di coltura cellulare, infatti le cellule in coltura aderente manifestano una spiccata tendenza riproduttiva rispetto alle cellule in coltura in sospensione. Un’attività proliferativa maggiore è quindi presente nel controllo piuttosto che nei campioni in esame, e pertanto nel terreno di coltura sarà consumato più glucosio e prodotta più

81 urea. Il secondo motivo è da attribuire alla struttura geliforme ed all’idrofilia dell’alginato che contribuisce a trattenere all’interno della rete polimerica tridimensionale sia il glucosio che l’urea, molecole idrofili che molto piccole. Tuttavia, anche se presente una differenza di concentrazione di glucosio ed urea tra campioni e controllo, è possibile apprezzare un trend comune di consumo e produzione dei composti suddetti. In particolare è possibile affermare che la concentrazione di alginato utilizzata nella sospensione di cellule non costituisca un fattore limitante per lo svolgimento di una normale attività cellulare. Pertanto la concentrazione di alginato da utilizzare per la realizzazione di scaffolds non risulta essere una discriminante per la vita cellulare.

3.4

E

Gli epatociti sono una specie cellulare molto sensibile alla trasmissione delle forze. Tale sensibilità è manifestata dalla presenza di numerosi meccanorecettori, distribuiti con concentrazioni elevate su tutta la membrana cellulare. Tali recettori servono per comunicare al nucleo cellulare quando e come esprimere il proprio fenotipo e le attività cellulari epatiche. Al fine di ottenere una caratterizzazione dell’influenza delle forze esterne e degli sforzi di taglio sul comportamento cellulare, è necessario considerare le proprietà meccaniche della cellula. Tale caratterizzazione risulta necessaria in quanto recenti studi hanno evidenziato che l’organizzazione spaziale ed i meccanismi di comunicazione intercellulare sono dovuti non soltanto alla diffusioni di particolari composti chimici3, ma soprattutto alla trasmissione di stimoli meccanici. La trasmissione dei segnali tra l’ambiente esterno con la cellula in esame, e tra la stessa cellula con quelle vicine, concorre al mantenimento del fenotipo caratteristico e delle specifiche proprietà fisiologiche. L’intrappolamento di epatociti ad elevata concentrazione in strutture tridimensionali di alginato sembra favorire lo sviluppo di una organizzazione spaziale responsabile di una spiccata espressione del fenotipo epatico. In particolare la trasmissione delle forze attraverso la matrice di alginato risulta promuovere fenomeni quali la riorganizzazione tridimensionale del citoscheletro e le giunzioni intercellulari6. Partendo da questi presupposti lo studio è stato rivolto alla

82 realizzazione di scaffolds con una struttura topologicamente definita ed in grado di trasmettere opportunamente le forze di interazione intercellulare, definiti aspetti sempre più importanti per la modulazione del comportamento cellulare. Tali aspetti risultano fondamentali per il mantenimento differenziato delle cellule in vitro in modo verosimigliante a quello in vivo. Occorre però considerare che una trasmissione eccessiva di forze meccaniche esterne sui meccanorecettori può indurre l’attività cellulare verso fenomeni apoptotici. L’utilizzo di linee cellulari epatiche si propone quindi da un lato di favorire una riorganizzazione spaziale tridimensionale per il mantenimento della funzionalità, e dall’altro di dimostrare come il sistema di microfabbricazione in uso sia correttamente dimensionato e non favorisca in alcun modo fenomeni di morte cellulare.

3.4.1

M

C

M

La membrana cellulare, costituita da un doppio strato fosfolipidico, costituisce un elemento fondamentale per l’espressione morfologica delle cellule. Per descrivere le proprietà meccaniche delle strutture biologiche, e quindi della membrana cellulare, è necessario combinare due elementi con diverse proprietà meccaniche. La necessità di questa combinazione è dovuta alla elevata complessità delle strutture biologiche, nonché alla loro organizzazione spaziale: per questo motivo quasi tutte le strutture biologiche vengono modellate come elementi visco-elastici. I modelli visco-elastici sono costituiti da una combinazione variabile in struttura e proporzione di elementi viscosi ed elastici. Gli elementi viscosi sono caratterizzati da deformazione irreversibile, dovuta al fatto che le molecole costituenti tali elementi non hanno memoria dello stato iniziale. Gli elementi elastici invece presentano una memoria di forma che consente un recupero dello stato iniziale in seguito ad una deformazione; tale comportamento è dovuto a fenomeni energetici, infatti l’energia di deformazione è conservata nel materiale ed è richiamata per indurre il recupero della forma di partenza. È possibile attribuire un comportamento puramente viscoso ai materiali liquidi, mentre un comportamento puramente elastico è tipico dei materiali solidi.

83 In base a quanto affermato è possibile modellare la membrana cellulare come un sistema visco-elastico, distinguendo tre modalità di deformazione risultato di diverse forze meccaniche esterne applicate; gli effetti indotti da tali forze possono essere dilatazione superficiale, sforzi di taglio su una superficie costante e flessione. Per ogni meccanismo di deformazione è possibile identificare tre parametri che caratterizzano il modello visco-elastico: il modulo di compressibilità elastica K, il modulo di sforzo di taglio elastico μ ed il modulo elastico flettente B7.

Queste tre variabili possono essere definite dalle seguenti relazioni, funzione della deformazione applicata alla membrana cellulare:

߬ = ܭߙ ߬௦ =1_{2 ߤ ቈ൬}ߣ_ߣଵ ଶ൰ ଶ − ൬ߣ_ߣଶ ଵ൰ ଶ ቉ ܯ = ܤ∆ ൬_ܴ1 ଵ+ 1 ܴଶ൰

In cui τ è la tensione isotropica, τs è lo sforzo di taglio risultante sulla superficie ed

M il momento flettente. Il rapporto delle dimensioni istantanee di un elemento infinitesimo della membrana deformata rispetto allo stato iniziale è dato da λ1 e λ2,

per i due lati di ogni elemento infinitesimo. Il parametro adimensionale α rappresenta il cambiamento frazionale della superficie, fornito da (λ1· λ2 -1). R1 e R2

sono i raggi di curvatura dell’elemento deformato, calcolati rispetto alle due superfici, mentre ∆ serve per valutare il cambiamento della quantità (1/ R1 + 1/ R2).

Qualitativamente è possibile affermare che piccoli valori dei moduli elastici K, µ, e B implicano che piccole forze esterne sono in grado di indurre sugli elementi della membrana grandi variazioni di superficie e flessioni significative. Per una membrana che presenta anche caratteristiche viscose le proprietà del materiale che manifestano una resistenza al flusso esterno risultano essere l’aumento della superficie esterna, sforzi di taglio e viscosità flettenti.

La complessità e l’evoluzione temporale delle caratteristiche della membrana cellulare non è oggetto di una trattazione esaustiva, ma risulta necessaria per introdurre le interazioni indotte dall’ambiente esterno alla cellula. Per semplificare i modelli visco-elastici cellulari e comprendere i fenomeni di resistenza alle forze

84 esterne, è sufficiente evidenziare l’andamento qualitativo dei moduli meccanici caratteristici della membrana cellulare. In particolare è necessario focalizzare l’attenzione sulle variazioni indotte sui moduli visco-elastici dalla morfologia della cellula e dalla disposizione interna del citoscheletro. Pertanto, nella trattazione che segue, sarà considerato soltanto che la morfologia sferica delle cellule in sospensione nella soluzione di alginato consente una variazione delle proprietà meccaniche della membrana cellulare in un intervallo di valori relativamente ampio. Tali modificazioni permettono alla cellula di modificare la propria forma con il fine di sopportare sollecitazioni esterne elevate.

I meccanorecettori sono composti di natura proteica che svolgono la funzione di modulare segnali meccanici presenti nella matrice extracellulare all’interno della cellula, in particolare questa classe di recettori mostra elevata sensibilità alle variazioni di pressioni meccaniche ed agli sforzi di taglio. Questi corpi proteici sono immersi nella membrana cellulare, ed a seconda del loro grado di interazione con essa si distinguono in transmembranosi, intramembranosi e proteine con ancore lipidiche in funzione. Le linee cellulari epatiche presentano una elevata concentrazione di meccanocettori, risultando per questo motivo molto sensibili ad ambienti con elevate pressioni e sforzi di taglio significativi.

3.5

A

S

Al fine della definizione di un protocollo di microfabbricazione di scaffold geliformi inglobanti la linea cellulare epatica HepG2, risulta necessaria una caratterizzazione degli sforzi di taglio presenti durante il processo realizzativo al fine di non indurre danni rilevanti sulla membrana cellulare delle cellule estruse. Un recente studio, condotto sulla stessa linea cellulare utilizzata in questo lavoro di tesi, è stato possibile valutare i valori critici degli sforzi di taglio trasmessi sulla membrana cellulare in grado di provocare alterazioni del comportamento cellulare. Lo sforzo di taglio τ è una grandezza meccanica generata dal moto di fluidi rispetto a superfici, come espresso dalla legge:

85 Anche in prossimità di una superficie fissa rispetto al moto del fluido, oppure in presenza di moto laminare, è possibile misurare un minimo sforzo di taglio nel mezzo dovuto al gradiente di velocità. Per determinare i valori critici è necessario utilizzare un sistema in grado di generare sforzi di taglio controllabili, consentendo la quantificazione di tali sforzi per la linea cellulare HepG2 da una valutazione degli effetti prodotti su una coltura standard bidimensionale8. Dalla valutazione condotta nello studio in esame risulta che sforzi di taglio inferiori a 0.5 Pa (valore fisiologicamente presente nelle sinusoidi epatiche) non inducono alterazioni morfologiche significative. Per sforzi di taglio compresi tra 0.6 Pa e 1.2 Pa le cellule rimangono adese alla piastra di coltura ma presentano una forma allungata rispetto alla direzione di flusso, mentre per sforzi di taglio superiori a 2 Pa le cellule in coltura si staccano dalla piastra e rimangono in sospensione nel mezzo di coltura senza presentare danni significativi sulla membrana cellulare. Contemporaneamente a questa quantificazione lo studio ha inoltre evidenziato come la funzionalità epatica diminuisca all’aumentare degli sforzi di taglio, in particolare valori dello sforzo di taglio prossimi a 6 Pa inducono segnali sui meccanocettori presenti nella membrana cellulare tali da provocare una diminuzione della sintesi di albumina. A partire da queste considerazioni è stata condotta un’analisi per quantificare la distribuzione degli sforzi di taglio all’interno dell’ago della siringa utilizzata nel sistema di microfabbricazione, considerando che i valori ricavati da questo studio sono applicati a cellule adese. Come dimostrato nei modelli visco-elastici della membrana cellulare, i coefficienti meccanici caratteristi della cellula variano in funzione della morfologia. In particolare è possibile riscontrare un loro aumento significativo quando la cellula incrementa i punti di adesione focale5: pertanto una cellula adesa alla piastra di coltura possiede coefficienti meccanici maggiori di una fattore 10 rispetto ad una cellula in sospensione. La variazione dei moduli elastici di compressibilità, di taglio e flettenti tra una cellula adesa ed una in sospensione dipende dal tipo cellulare in questione. Per questo motivo è necessario considerare i valori critici degli sforzi di taglio che inducono danni alle cellule adese risultano essere minori rispetto a quelli provocati sulle cellule in sospensione (forma sferica e moduli elastici inferiori). La quantificazione dei valori critici effettuata su cellule adese dovrà essere maggiorata

86 di un fattore 102 per cellule in sospensione in studio in questo lavoro di tesi. Per la quantificazione degli sforzi di taglio agenti sulla membrana delle cellule epatiche HepG2 estruse, è necessario quantificare la pressione applicata all’interno della siringa. Noto da costruttore che la coppia esercitata dal motore stepper (RS 440-420) sia di 70·10-3 Nm ed il passo della vite di 23 mm, è possibile ricavare la forza esercitata dal motore sul pistone della siringa sterile. Calcolata la forza costante applicata dal motore durante il processo di estrusione, pari a circa 7 N è possibile ricavare la pressione di applicata al materiale caricato nella siringa, in base alla definizione di pressione:

p =_ߨݎF_ଶ

con raggio del pistone r di 9 mm, si ottengono valori di pressione di 27 kPa. Considerate eventuali perdite di carico all’interno della siringa, è possibile approssimare che la pressione all’imbocco dell’ago sia circa 2·104 Pa. Per ricavare il valore massimo dello sforzo di taglio τ presente sulla membrana cellulare durante il processo di estrusione è stato quindi utilizzato un software9 in grado di risolvere agli elementi finiti, con le equazioni della fluidodinamica di Navier-Stokes, il modello del sistema in studio. Il modello CAD realizzato con il modulo di disegno di Comsol include dei corpi sferici rigidi per approssimare le cellule inglobate nell’alginato, come mostrato in figura 2.1.

87 Per risolvere il modello è stato imposto il valore di pressione ricavato come condizione al contorno sulla superficie d’ingresso dell’ago. Il campo di velocità risolto durante la simulazione è riportato in figura 2.2.

Figura 2.2: Distribuzione del campo di velocità all’interno dell’ago

Dal grafico è possibile ricavare i valori della velocità sulla sezione dell’ago, come mostrato in figura 2.3.

88 Pertanto per ricavare i valori degli sforzi di taglio agenti sulla membrana cellulare occorre applicare la seguente equazione:

߬ = ߤ݀ݒ_{݀ݎ ≈ ߤ(r} ΔݒMAX

AGO− rCELLULA)

Ricavato Δݒ_MAX = 0.05 m/s, (r_AGO− r_CELLULA) = 0.05·10-3 m e μ=2.19 Pa·s (dell’alginato al 6%) si ottengono valori ߬MAX intorno a 2 kPa.

Considerato che le cellule percorrono l’ago in un tempo sufficientemente piccolo (circa 5ms), che la morfologia sferica della cellula imponga moduli elastici tali sopportare elevati sforzi di taglio, e che i tempi di risposta dei recettori di membrana non sono inferiori a qualche secondo5, è possibile ipotizzare che durante l’estrusione le cellule non subiscano danni permanenti sulla membrana cellulare.

3.6

D

Per la realizzazione di scaffold geliformi topologicamente definiti inglobanti cellule è stato scelto di utilizzare una tecnica di microfabbricazione che integra al sistema di movimentazione della Pressure Activated Microsiringe, un sistema di estrusione con una siringa sterile attuato da un motore stepper. Il sistema, come già descritto nei capitoli precedenti, è stato sviluppato per alloggiare una siringa commerciale sterile. Per la definizione della topologia più opportuna sono state analizzate strutture a griglia e ad esagoni (figura 2.4), le strutture sono realizzate con una soluzione di Alginato con water blue (Water Blue, FLUKA) e rosso congo (Carlo Erbe Reagenti), coloranti che non alterano apprezzabilmente la viscosità dell’alginato.

89 Come si può notare la struttura a griglia risulta maggiormente definita nei contorni, e pertanto si è deciso di procedere per la realizzazione di tale topologia. L’impossibilità di realizzare strutture a esagoni ben definite nei contorni è dovuto al sistema di movimentazione della Pressure Activated Microsiringe, tali limiti saranno discussi nel capitolo seguente. Al fine di ottenere delle strutture micrometriche è stata utilizzata una siringa sterile da 10 mL (BD PlastipackTM) dotata di un ago sterile di calibro 29 Gauge (BD PlastipackTM), pari ad un diametro interno di 0.165 mm. Tale diametro garantisce l’estrusione di cellule epatiche senza imporre alcuna deformazione sulla membrana cellulare, infatti il diametro di una cellula epatica in forma sferica (ovvero senza punti di adesione focale) può variare tra 0.05 e 0.1 mm. Per la realizzazione degli scaffold sono stati utilizzati tutti i materiali menzionati nel protocollo definito nel capitolo precedente. In particolare è stato utilizzato il sale di alginato (Alginic acid sodium salt from brown algae, A0682 Sigma), in soluzione con PBS e Cloruro di Sodio 2.7% peso/volume, la soluzione polimerica è stata sterilizzata in autoclave prima di fare la sospensione cellulare e promuovere la reazione di reticolazione. L’agente reticolante utilizzato è ottenuto da Cloruro di Calcio (Calcium chloride dehydrated 06991, Fluka) 0.1 M in soluzione sterile con DMEM.

Dopo aver immesso circa 10 milioni di cellule in 1 mL di alginato al 6% ed aver promosso la formazione di una sospensione omogenea, utilizzando il Vortex, la sospensione è stata caricata nella siringa sterile da 10 mL con ago da 29 Gauge. La siringa è stata fissata sull’apposito sostegno, ed il sistema è stato azionato. Nella figura 2.5 è mostrata la topologia a griglia appositamente dimensionata per la realizzazione degli scaffold in studio.

90 Figura 2.5: Interfaccia grafica del sistema CAD/CAM

Dalla caratterizzazione del sistema di estrusione descritta nei capitoli precedenti si è deciso di controllare il motore stepper con un intervallo di ritardo tra step successivi con DL=2000, tale controllo consente una portata della siringa di 0.1 mL/s e una velocità di uscita della sospensione di alginato e cellule di 4.43 mm/s. Per la realizzazione di tale topologia il sistema di movimentazione funziona ad una velocità di 4.5 mm/s.

Dopo la realizzazione della struttura a griglia in alginato inglobante cellule è stata promossa la reazione di reticolazione con l’agente reticolante CaCl2 per un tempo di

reazione pari a 2 minuti. Al termine della reazione di reticolazione è stato aspirato l’agente reticolante ed sono stati aggiunti 2 mL di terreno di coltura DMEM, successivamente lo scaffold è stato posto in incubatore. Dopo 6 ore e 24 ore sono stati prelevati dei campioni di terreno per l’analisi dei metaboliti, inoltre i campioni di scaffolds realizzati sono stati fissati con formaldeide al 4%.

3.7

T

Dopo la deposizione della sospensione di alginato e la realizzazione degli scaffold tridimensionali con cellule inglobate è stato necessario condurre delle analisi che permettessero la validazione del protocollo di microfabbricazione utilizzato. In particolare sono state condotte delle analisi che permettessero la verifica

91 dell’attività metabolica e della vitalità cellulare, nonché dell’organizzazione spaziale delle cellule inglobate. Tali analisi risultano necessarie per dimostrare che gli sforzi di taglio cui sono soggette le cellule durante la fabbricazione degli scaffolds né danneggiano la membrana cellulare, né inducono segnali per la promozione di fenomeni apoptotici.

Dopo aver fissato i campioni dopo 6 e 24 ore di coltura con formaldeide al 4%, è stato possibile analizzare la morfologia cellulare e nucleica, nonché l’organizzazione spaziale. Con una osservazione al microscopio (Olympus IX81) è possibile notare come i contorni cellulari siano definiti, non indicando necrosi cellulare. Per evidenziare la morfologia del nucleo cellulare è necessario utilizzare il DAPI, un colorante fluorescente in grado di intercalare nelle eliche di DNA. Come evidenziano le immagini seguenti, sia dopo 6 ore dalla deposizione che dopo 24 le cellule inglobate presentano nuclei definiti, indice di un buono stato delle cellule in coltura che non evidenziano tendenze apoptotiche.

Figura 2.6: immagini dei nuclei delle cellule estruse dopo 6 ore (a) e dopo 24 ore (b)

Inoltre con questa colorazione è possibile apprezzare la distribuzione tridimensionale delle cellule, caratteristica peculiare per promuovere una organizzazione spaziale tale da mantenere il fenotipo della linea cellulare utilizzata.

92 Figura 2.7: disposizione spaziale delle cellule su più piani, visualizzata con diverse messe a fuoco

Al fine di verificare il livello di attività metabolica delle cellule inglobate, sono stati eseguiti dei prelievi del terreno di coltura dei campioni realizzati. In particolare, per evidenziare l’andamento temporale della concentrazione dei metaboliti e cataboliti, sono stati prelevati campioni di terreno dopo 6 ore, tempo necessario per una adesione stabile delle cellule all’ambiente circostante, e dopo 24 ore.

I risultati ottenuti sono stati riferiti ad una coltura standard, statica e bidimensionale (grafici 3.8, 3.9).

Grafico 3.8: concentrazione di glucosio nei campioni di terreno prelevati a 6 e 24 ore

93 Come evidenziato le cellule manifestano un consumo di glucosio ed una produzione di urea similare alla coltura standard di riferimento.

Ciò indica che le cellule sono metabolicamente attive, e che gli stress meccanici subiti durante il processo di microfabbricazione non inducono alterazioni particolari. Inoltre l’alginato che circonda e cellule, nonostante la sua elevata concentrazione, consente una diffusione degli elementi nutritivi sufficiente a garantirne la vita.

94

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