Capitolo 5

Capitolo 5

Analisi della variazione del lattato nel cervello

durante stimolazione visiva

La teoria di Magistretti, la A.N.L.S. (4.4), individua negli astrociti il meccanismo principale capace di fornire ai neuroni l’energia necessaria per la loro attivazione, il lattato è stato presentato come il substrato energetico principale, tramite la sua trasformazione nel ciclo di Krebs si crea ATP , il combustibile del mondo cellulare. Per valutare il coinvolgimento del lattato nel metabolismo cerebrale abbiamo monitorato la sua concentrazione nel tempo su di un volontario mentre era sottoposto a stimolazione sensoriale.

La stimolazione scelta è stata quella visiva, che in letteratura è conosciuta come quella che dà una risposta più facilmente individuabile.

Nei nostri esperimenti abbiamo fatto uso della tecnica di risonanza magnetica, che non comporta danni cellulari ai pazienti grazie alla sua non invasività e in particolare abbiamo utilizzato la fMRI ( risonanza magnetica funzionale) per l’individuazione dell’area cerebrale attivata e su di essa abbiamo eseguito una H-MRS (spettroscopia magnetica nucleare dell’idrogeno), che è la tecnica adatta per valutare le concentrazioni dei metaboliti in vivo e quindi del lattato.

5.1 Stimolo visivo

Nel nostro esperimento abbiamo sottoposto un volontario ad un treno di flash a 10 hz caratterizzato da 20 secondi di stimolazione seguiti da altri 20 secondi di non-stimolazione, individuando così le due condizioni di on-off

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Fig 5.1 schematizzazione del treno di flash applicato al volontario

Alcuni esperimenti precedenti a questo lavoro di tesi, effettuati su tempi molto più lunghi e sotto stimolazioni prolungate e continuative hanno messo in evidenza un aumento del lattato.

Questi, non sono in contrasto con i risultati ora raggiunti, perché lo stimolo utilizzato era molto diverso, si trattava per lo più di flash applicati con occhialini ad altissime frequenze, continuativi e prolungati per molti minuti.

Il fenomeno dell’aumento del lattato, poteva essere ricondotto a fenomeni di affaticamento cellulare e non alla normale attivazione fisiologica.

Nel nostro esperimento abbiamo invece usato uno stimolo più naturale, utilizzando un treno di flash che intervalla a 20 secondi di stimolazione, 20secondi di pausa.

Una volta cessata la fase di stimolazione, è stato evidenziato sperimentalmente che il ritorno alla concentrazione basale del lattato, e della risposta emodinamica nel cervello, valutata con il BOLD, è superiore ad alcuni minuti, per cui i 20 secondi di pausa non inficiano le misurazioni.

La retina, tende poi a far persistere la situazione di stimolo, anche se più attenuata per quasi tutti i 20 secondi di pausa..

Stimolazioni prolungate e ad alta frequenza visive, possono invece dar luogo a temporanei fenomeni epilettici e sono quindi ben lontani dal descrivere situazioni di normale attivazione cerebrale, i meccanismi metabolici possono quindi andare incontro a variazioni non riconducibili al normale funzionamento fisiologico.

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5.2 Principi di f MRI

Per focalizzare l’analisi su di un’area del cervello che presentasse un’attivazione cerebrale, e quindi verosimilmente che fosse interessata da un consumo metabolico maggiore rispetto a quello del livello basale, abbiamo in principio utilizzato la tecnica fMRI ( functional magnetic resonance imaging).

Questa tecnica si basa innanzitutto sull’individuare immagini che possono essere anche molto dettagliate del cervello.

Per visualizzare il cervello abbiamo utilizzato tecniche di MRI (magnetic resonance imaging)

5.2.1 MRI

L’immagine è la rappresentazione di una distribuzione spaziale di un segnale NMR. Essa è ricostruita a partire dalla trasformata di Fourier del raw-data

fig 5.2 viene applicato un gradiente al campo magnetico statico B0

Al campo magnetico B0 viene applicato un gradiente nelle tre direzioni

Z G Y G X G B Bz = 0 + x∗ + y∗ + z ∗

Si hanno così la selezione della slice e le codifiche in fase e frequenza descritte nel capitolo 2.5

Perciò la frequenza d’oscillazione dipenderà dal vettore spaziale

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ω

( )

x

r

=

γ

B

=

ω

+

γ

G

r

∗

x

r

Il segnale sarà proporzionale alla magnetizzazione nel volume m( xr ), al gradiente Gr e al suo tempo d’applicazione τ

(

)

_∫

x

d

e

x

m

e

t

G

S

r

p

r

r

τ

(

)

,

,

e

( )

₌

_∫

x

d

e

x

m

k

S

r

r

r

)

(

Il segnale NMR risulta così la trasformata di Fourier di m( xr )calcolata con la frequenza spaziale kr . Il piano

k

,

k

Fig 5.3 la trasformazione nel k-spazio

Si può così passare dall’immagine alla sua codifica nel k-spazio trasformando e antitrasformando con Fourier

Il numero di righe del k-spazio è pari al numero delle codifiche di fase effettuate, e ogni riga, contiene il campionamento del segnale relativamente alla sua codifica di fase

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5.2.2 Sequenza Gradient echo

Per acquisire i segnali abbiamo fatto uso di una sequenza Gradient echo

Fig 5.4 sequenza gradient echo

Un impulso a RF, che produce una rotazione della magnetizzazione, viene applicato contemporaneamente ad un gradiente di selezione di slice .

Viene poi applicato un gradiente di codifica di fase, che viene fatto variare tra un gradiente massimo positivo e uno negativo.

Il gradiente di codifica in frequenza viene applicato mentre viene acquisito l’eco del segnale.

5.2.3 BOLD

L’idea che i neuroni dell’area celebrale attivata, richiedano un maggior apporto energetico e quindi abbiano bisogno di più ossigeno rispetto alle loro condizioni basali. L’ossigeno è trasportato dall’emoglobina attraverso il sangue verso le zone attivate. La molecola dell’emoglobina si presenta così nelle sue due forme: ossigenata (ossiemoglobina) e non ossigenata (deossiemoglobina).

Questa differenza nelle proprietà magnetiche dell’emoglobina è stata sfruttata nella tecnica chiamata BOLD ( Blood Oxygenation Level Dependent contrast)

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La presenza della molecola paramagnetica della deossiemogloblina distorce il campo magnetico locale, e gli spins che si trovano in questo intorno, non seguono più un moto processionale alla stessa velocità.

Questo causa una più rapida perdita di coerenza di fase e quindi una maggior rapidità nel decadimento del segnale.

Il parametro caratteristico del decadimento del segnale, , porta a cambiamenti di intensità in immagini pesate in

* 2

T

T

La piccola differenza di suscettibilità magnetica è rilevabile come cambiamento di intensità delle immagini acquisite, ma il SNR è così basso che l’unica strada è procedere tramite una sottrazione mediata o un’analisi statistica.

Si identifica una condizione di attivazione sottoponendo il paziente ad un task specifico e si esegue una media tra immagini in condizioni di rest e immagini in condizioni di stimolazione.

Fig 5.5 Il paziente si sottopone al task di stringere una mano. Le immagini vengono sottratte dalle due condizioni di stringere e non stringere e tramite una elaborazione statistica se ne deduce una mappa di attivazione della zona motoria

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5.2.4 Esperimento fMRI

Lo stimolo applicato al volontario è quello descritto in 5.1 il treno di flash a 10 hz caratterizzato da 20 secondi di stimolazione seguiti da altri 20 secondi di non-stimolazione, individuando così le due condizioni di on-off

Abbiamo acquisito le immagini MRI ottenute con una sequenza del tipo gradient echo imaging (5.1.2) e abbiamo elaborato il segnale con il software AFNI.

La figura 5.6 rappresenta il grafico dell’intensità dell’immagine registrata in un voxel particolare del cervello, comparata con l’onda quadra dello stimolo visivo.

Il voxel scelto è quello che presenta un segnale con il maggior grado di correlazione con lo stimolo applicato.

Fig 5.6 Grafico comparativo dello stimolo( in alto) con il segnale dell’intensità d’immagine (in basso) acquisito in uno dei voxel dove c’è maggior grado di correlazione.

Il grado di correlazione viene calcolato per ogni voxel dell’immagine cerebrale e tradotto in una mappa in falsi colori dove maggiore è la correlazione è più l’intensità di colore del voxel tende al rosso.Il voxel appare così acceso.

Viene fissata una soglia minima di correlazione così i voxel che non superano quella soglia appaiono trasparenti.

Alla fine la mappa di correlazione viene sovrapposta all’immagine anatomica precedentemente registrata.

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Fig 5.7 immagine anatomiche da sinistra verso destra: assiale, coronale, sagittale. Le zona di attivazione primaria sono evidenziate con colori rossi.

Le zone di attivazione primaria sono quasi simmetriche, nella nuca vicino al cranio. Piccole zone di attivazione secondaria possono essere degli artefatti da movimenti oppure anche zone di attivazione secondaria che non sono state prese in considerazione.

5.3 Spettroscopia

Una volta trovata una mappa di attivazione cerebrale abbiamo scelto un voxel che presentasse la maggiore attivazione primaria e ci abbiamo eseguito una spettroscopia. Variazioni della concentrazione del lattato, in zone del cervello attivate con periodi di stimolazione prolungata e intensa, sono già stati messi in luce in passato, tuttavia, essi sono stati eseguiti con bassa risoluzione temporale, così che i risultati forniti non prendono in considerazione i primi minuti della stimolazione.

L’aumento di lattato potrebbe essere soltanto indice di affaticamento cerebrale, dovuto alla prolungata e intensa stimolazione e non indice di un suo coinvolgimento dinamico.

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Il lattato tuttavia non è facilmente quantificabile se non tramite l’esposizione del paziente a lunghe serie spettroscopiche, con alti valori di NEX, per ridurre il rapporto segnale rumore. Così facendo però, si perde in risoluzione temporale e non si potrebbe descrivere una variazione dinamica del lattato con una più alta risoluzione temporale. Il problema quindi consiste nell’eseguire sequenze spettroscopiche con un basso numero di Nex per ridurre il campionamento temporale mantenendo una buona leggibilità del lattato.

5.3.1 Prime prove sperimentali e loro limiti

All’inizio abbiamo provato l’utilizzo di una sequenza PRESS riducendo al minimo possibile consentito dalla macchina i parametri temporali in maniera da acquisire sequenze spettroscopiche tali da avere la più alta risoluzione temporale possibile.

I parametri caratteristici sono stati: TR 1140 ms

TE:35ms NEX: 2

I punti del raw data sono 2048.

I FID vengono mediati automaticamente per diminuire gli artefatti e resi disponibili all’utente.

In tali condizioni la macchina è in grado di eseguire una spettroscopia ogni minuto e mezzo.

Lo schema dell’esperimento è il seguente

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Fig 5.8 esperimento di spettroscopia magnetica funzionale

Il treno di flash descritto nel (5.1.4), indicato con frecce azzurre, viene proiettato su di uno schermo e, tramite un sistema di specchi, stimola la retina del volontario.

Nello stesso momento vengono acquisiti i raw-data spettroscopici nella regione cerebrale nella quale sappiamo esserci attivazione.

La macchina medierà i valori e fornirà all’utente un raw-data mediato pronto per l’elaborazione.

Fig 5.9 i FID vengono mediati nel tempo, in verde il FID mediato resodisponibile per l’elaborazione

Una volta acquisita una serie di raw-data, si è passati alla loro elaborazione ( vedi 5.2.4) e all’estrazione del valore che rappresenta la concentrazione del lattato per ognuno di essi.

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Si è potuto così descrivere (vedi 5.3) una curva di concentrazione del lattato in rapporto alla creatina nel tempo.(vedi fig.5.10)

Fig. 5.10 interpolazione dei dati elaborati rappresentante la variazione percentuale di concentrazione del lattato in rapporto alla creatina nel tempo

La figura 5.10 è stata elaborato con Matlab ed è riportata in percentuale rispetto al primo spettro, la risoluzione è di 1 minuto e 30.

A causa dell’alto rumore riscontrato in fase di elaborazione è stata ritenuta poco attendibile, inoltre volevamo cercare di aumentare la risoluzione temporale senza peggiorare ulteriormente il rumore, dovuto al basso numero di NEX

5.3.2 Strategie di aumento di risoluzione temporale

Se i FID non fossero stati mediati automaticamente dalla macchina e si fosse potuto accedere a tutti i punti acquisiti, si sarebbe potuto ridurre la risoluzione temporale senza perdere in rapporto segnale rumore.

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Il tempo totale dell’esperimento si sarebbe però allungato e, questo comporterebbe perdita di SNR, dovuto agli inevitabili movimenti del volontario e a causa della maggiore possibilità di variazione di condizioni fisiologiche, rendendo più difficile l’interpretazione.

La acquisizione dei raw data verrebbe eseguita normalmente e la media sarebbe stata fatta in verticale anziché in orizzontale (vedi fig 5.11)

Tempo acquisizione T em p o to ta le es p er im en to

Fig 5.11 i FID vengono registrati in ogni riga che è un sotto-esperimento indipendente, in verde è rappresentato il FID ottenuto mediando tutti i FID della riga.

In rosso sono invece segnati i FID ottenuti mediando i FID sulle colonne, cioè appartenenti a diferenti sotto-esperimenti, ma con la caratteristica di essere stati acquisiti dopo lo stesso intervallo di tempo.

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Si sarebbe dovuto acquisire un raw-data per ogni esperimento e facendo molteplici esperimenti ( nel numero pari a quanti FID vengono mediati per ottenere una acquisizione), si otterrebbero FID con una risoluzione temporale fortemente incrementata.

Tempo totale esperimento = Tempo acquisizione * Numero acquisizioni mediate

Tempo acquisizione è il tempo necessario per acquisire un raw-data mediato dalla

macchina formato da N FIDs.

Il Numero acquisizioni mediate è il numero di raw-data che vengono raccolti, coincide quindi con il numero di esperimenti effettuati.

Prendendo il numero di esperimenti uguale al numero dei FIDs otteniamo una matrice (N+1)x(N+1) ( l’elemento (N+1, N+1) non è utile).

Gli elementi di una stessa riga sono i FIDs acquisiti dalla macchina in una sequenza spettroscopica, mentre gli elementi su una stessa colonna rappresentano i FIDs acquisiti dopo lo stesso intervallo di tempo dall’inizio della sequenza.

Gli elementi sulla riga N+1 indicati in rosso nella figura 5.11 sono FIDs mediati verticalmente, appartenenti alla stessa colonna, la media viene eseguita sullo stesso numero di dati rispetto a quelli in verde, si ottiene così una risoluzione temporale N-volte maggiore rispetto a quelli verdi mediati orizzontalmente sulle righe in automatico dalla macchina.

Nel nostro esperimento, descritto dalla figura 5.8, ripetuto N-volte, dopo aver elaborato ed estratto i valori del lattato dai FIDs rossi come in fig 5.10, si sarebbe ottenuta una curva di concentrazione ad alta risoluzione temporale.

Nella pratica si potrebbe utilizzare una combinazione delle due medie orizzontale e verticale per ottenere una buona risoluzione temporale diminuendo il tempo di esperimento con tutti i problemi che esso comporta, non per ultimo il disagio del volontario a stare immobile per lungo tempo.

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L’impossibilità di accedere ai dati pre-mediati dalla macchina, ha reso necessario di cercare una nuova strategia per l’acquisizione degli spettri per ottenere sia un miglioramento nel SNR sia un aumento nella risoluzione temporale.

L’aumento del NEX, incrementa il SNR, ma diminuisce notevolmente la risoluzione temporale, si doveva quindi cercare una strategia per rendere indipendente l’aumento del NEX dalla risoluzione temporale.

La soluzione può essere quella di aumentare il tempo totale d’esperimento

Indichiamo sempre con le frecce azzurre il treno di flash utilizzato per la stimolazione visiva e con una freccia rossa il valore della concentrazione del lattato estratta dai raw-data elaborati.

Aumentiamo il numero di NEX per incrementare il SNR. Effettuiamo un primo esperimento.

Fig 5.12 con la freccia rossa indichiamo il valore del lattato estratto dai FIDs mediati dalla macchina, con NEX =8 otteniamo ∆T ≈ 2 minuti. Le frecce azzurre indicano

lo stimolo applicato descritto in 5.1.4

La risoluzione temporale dipenderà dal numero di NEX e la indichiamo con ∆T

Se vogliamo ottenere una risoluzione temporale pari a ∆T/K dobbiamo eseguire K esperimenti secondo la modalità in seguito spiegata.

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Effettuiamo successivamente un numero di esperimenti pari a quanto vogliamo migliorare la risoluzione temporale ritardando l’istante iniziale di acquisizione di

T

∆ /K, poi interallacciamo i dati dei k esperimenti tra loro.

Nel nostro esperimento abbiamo ritenuto sufficiente un NEX pari a 8, che comporta un tempo minimo di acquisizione ∆Tdi circa 2 minuti e abbiamo eseguito due esperimenti tali da migliorare la risoluzione temporale ad 1 minuto.

Nella fig 5.13 lo schema del nuovo esperimento.

Fig5.13 (per i simboli usati vedi figura 5.1)1Abbiamo eseguito due esperimenti, interallacciando i dati otteniamo una risoluzione di circa 1 minuto.

In questo caso K=2

Il primo esperimento è sincronizzato con l’inizio del treno di flash e vengono acquisiti 5 spettri di risonanza che poi abbiamo elaborato.

Nel secondo esperimento iniziamo l’acquisizione delle 5 nuove sequenze spettroscopiche con un ritardo di circa 1 minuto.

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5.3.3 Elaborazione degli spettri con SAGE

Per l’elaborazione degli spettri ci siamo serviti del software SAGE.

Ogni FID è stato campionato con 2048 punti a una frequenza tale da rispettare la condizione di Nyquist.

I 2048 punti nel tempo vengono acquisiti in quadratura perciò 1024 sono reali e 1024 sono complessi.

Ad essi è stato applicato lo zero-filling alla successiva potenza di 2 per aumentarne la risoluzione come descritto in 3.1.1

Sui dati nel dominio del tempo è stata eseguita una apodizzazione adoperando una funzione Lorentziana con una line- broadening di di 2,5 Hz per eliminare gli effetti del rumore e mantenere una leggibilità del doppio picco del lattato ( vedi 3.1.2.1)

È stato preso come riferimento il picco dell’acqua per l’eliminazione di artefatti (3.1.3), e per una correzione di fase (vedi 3.2.1).

Per l’eliminazione del picco dell’acqua è stata usata una sequenza CHESS (vedi 3.3.1) e un filtraggio passa alto con filtro FIR di ordine 99 (vedi 3.3.2)

5.4 Risultati sperimentali

Alla fine delle elaborazioni si ricavo uno spettro come quello in fig. 5.14

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Fig 5.14 spettro elaborato con SAGE, la freccia rossa indica il doppio picco del lattato, la verde il picco della creatina

Intorno a 1.33 ppm è visibile il doppio picco del lattato, indicato dalla freccia rossa, mentre a 3.06 ppm il picco della creatina, indicato dalla freccia verde..

La creatina è un metabolita che non varia la sua concentrazione in breve tempo, ed è facilmente identificabile, essendo il suo picco di un’ampiezza sufficientemente grande e isolato dagli altri.

Abbiamo perciò monitorato le variazioni della creatina nel tempo, e non essendoci teorie metaboliche che ne spiegano la variazione, abbiamo ricondotto il suo cambiamento a rumore termico, artefatti da movimento o da campo magnetico, errori nel campionamento del segnale.

Per eliminare queste interferenze, abbiamo elaborato la curva del lattato in rapporto con la creatina con il programma Matlab

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Fig 5.15in viola è indicato l’inizio della stimolazione visiva, in giallo il valore di rest del rapporto lattato su creatina, in rosso i valori del primo esperimento, in verde quelli del secondo

La stimolazione visiva con il treno di flash descritto in 5.1.4 inizia al quinto minuto. Indichiamo in rosso i valori del rapporto lattato su creatina ottenuti dall’elaborazione degli spettri del primo esperimento, i dati sono distanziati di 2 minuti., l’acquisizione degli spettri è contemporanea all’inizio della stimolazione visiva, per cui il primo spettro si ha intorno al settimo minuto.

In verde indichiamo il rapporto calcolato dall’elebarazione degli spettri del secondo esperimento, con l’istante d’inizio dell’acquisizione del primo spettro spostato di 1 minuto rispetto all’inizio della stimolazione.

In giallo indichiamo il valore di rest.

Nella figura 5.16 ipotizziamo lo stesso valore di rest subito prima dell’inizio dell’esperimento per avere i dati distribuiti più uniformemente e li interpoliamo parabolicamente con il metodo dei minimi quadrati

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Fig 5.16 interpolazione parabolica dei dati, si nota un minimo della concentrazione nei primi minuti e la tendenza successiva a risalire, in viola l’inizio della stimolazione che coincide con il valore teorico di rest ipotizzato costante per tutto il periodo antecedente l’esperimento.

5.5 Interpretazione dell’andamento della concentrazione del

lattato alla luce dei modelli metabolici

Dalla figura 5.15 e 5.16 è evidente come nei primi minuti dall’inizio della stimolazione, la concentrazione del lattato diminuisce, e questo potrebbe essere un indizio del suo utilizzo, concordando con la teoria di Magistretti, esso viene utilizzato come substrato principale metabolico.

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Dopo aver raggiunto un minimo abbastanza velocemente, la concentrazione risale e sembra ritornare a valori prossimi a quelli di regime.

I risultati sperimentali non sono in accordo con chi in passato ha trovano un aumento della concentrazione del lattato, tra l’altro eseguendo esperimenti che appaiono approssimativi, in quanto applicati in zone del cervello che si suppone soltanto siano attivate, ma senza utilizzare la tecnica fMRI o accorgimenti di aumento di risoluzione temporale.

In caso di stimolazioni prolungate e continuative ad alta frequenza (vedi 5.1),

il modello di Shulman (4.5) potrebbe essere valido, ma necessita di studi accurati su stimoli diversi per vedere quali di essi possono far cambiare il tipo di metabolismo. In particolare si dovrebbe trovare la frequenza limite e la potenza dello stimolo visivo che provoca un passaggio di funzionamento dal metabolismo descritto da Magistretti a quello dell’utilizzo del glicogeno, di Shulman, che appare più una fase temporanea di emergenza, che un normale funzionamento fisiologico.

Pertanto, la diminuizione del lattato, descritta nei primi minuti di normale attivazione cerebrale, è in accordo con il modello di Magistretti sull’utilizzo del lattato.

Suggerisce che negli astrociti sia presente un buffer di lattato, che esso venga utilizzato nei primi minuti, e che successivamente se ne formi altro che vada a riempire di nuovo il buffer.

La fase successiva rimane però ancora non spiegabile, le possibilità sono due, o si continua ad utilizzare il lattato, con un equilibrio dinamico di formazione ed utilizzo, o la produzione del lattato cessa una volta riempito il buffer, e il glucosio torna ad essere utilizzato come il substrato principale.

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