Dx CMV Assay Determinazione quantitativa diretta del DNA di citomegalovirus mediante PCR real-time

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Dx CMV Assay

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Determinazione quantitativa diretta del DNA di citomegalovirus mediante PCR real-time

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1-DESTINAZIONE D’USO

Il Kit Dx CMV Assay è finalizzato alla quantificazione in vitro del DNA genomico di Citomegalovirus in campioni di plasma umano con il controllo simultaneo della reazione di estrazione/amplificazione mediante l’utilizzo di un Controllo Interno (IC).

Il saggio Dx CMV Assay è standardizzato rispetto al Primo Standard Internazionale dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO) per il CMV DNA umano (codice NIBSC 09/162) al fine di esprimere la carica virale in Unità Internazionali (IU/ml).

Il Kit Dx CMV Assay è stato validato esclusivamente per l'utilizzo combinato con lo strumento Dx Real-Time System (Bio-Rad) ed il relativo software Dx Real-Time Software.

Grazie alla comune procedura di estrazione e di amplificazione dell'acido nucleico, la quantificazione del CMV DNA con il kit Dx CMV Assay può essere eseguita simultaneamente con gli altri test quantitativi del pannello Dx Assays dedicato alla diagnostica delle infezioni nei soggetti immunocompromessi.

2. INTRODUZIONE E PRINCIPIO DEL TEST

Il Citomegalovirus Umano (HCMV) ha un DNA genomico lineare a doppio filamento >230 kb ed è il principale membro della famiglia Herpesviridae. Almeno il 60% della popolazione umana è stata esposta al CMV, con una prevalenza di oltre il 90% nei gruppi ad alto rischio (ad esempio, feti le cui madri hanno contratto infezioni da CMV durante la gravidanza o persone contagiate dall'HIV).

Dati clinici indicano che l'HCMV infetta vari tipi di tessuti e cellule e, pertanto, è responsabile di molteplici complicanze cliniche.

A seconda del tipo di tessuto e dello stato immunitario dell'ospite, l'HCMV attiva tre diverse modalità d'infezione: infezioni acute con crescita esplosiva, infezioni persistenti con livelli ridotti di replicazione e infezioni latenti in cui non viene prodotta alcuna progenie virale. Il meccanismo di riattivazione è tuttora sconosciuto, tuttavia sembra essere fortemente correlato a un controllo deficitario del virus da parte del sistema immunitario. Per tale ragione, il CMV è uno degli agenti patogeni opportunistici più comuni che complicano il trattamento dei soggetti trapiantati.

Il CMV rappresenta una delle cause principali di morbilità e mortalità, nei soggetti sottoposti a trapianto d'organo solido causando effetti sia "diretti" che "indiretti" tra cui rigetto dell'allotrapianto, ridotta sopravvivenza dell'organo trapiantato e del paziente e predisposizione a infezioni opportunistiche e neoplasie maligne

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L'infezione da CMV si sviluppa generalmente nei primi mesi successivi al trapianto ed è associata a malattie infettive (es., febbre, polmonite, ulcere gastrointestinali, epatite) e lesioni acute e/o croniche e disfunzione dell'organo trapiantato.

Il CMV è presente nelle secrezioni orofaringee, nell'urina, nelle secrezioni cervicali e vaginali, nello sperma, nel latte materno e negli emoderivati. Il CMV viene trasmesso in utero durante i primi 6 mesi di vita dall'esposizione alle secrezioni genitali della madre e al latte materno, e attraverso le secrezioni orali e respiratorie nella fascia di età prescolare. Una volta contratta l'infezione (congenita, perinatale o postnatale precoce), il virus può permanere per anni nei liquidi organici.

Il trattamento della malattia da CMV con farmaci antivirali specifici, come ganciclovir e foscarnet, diminuisce la gravità della patologia e la mortalità dei pazienti. Sono state messe a punto strategie antivirali di profilassi e prevenzione che si prefiggono di evitare il trattamento aggressivo della malattia accertata a carico dell'organo trapiantato.

La determinazione quantitativa della carica virale del CMV definisce specificatamente lo stato di progressione della malattia. I test basati sulla PCR real-time sono in grado di quantificare con accuratezza il DNA virale senza la manipolazione dei campioni nella fase post-PCR, fornendo risultati rapidi ed un rischio realmente ridotto di contaminazione crociata per il campione in esame.

3. PRINCIPI DELLA PROCEDURA

Il test Dx CMV Assay è organizzato in due fasi principali: la preparazione del campione e l'amplificazione/determinazione del DNA target mediante PCR real-time. La fase di PCR real-time consente l'amplificazione e la rilevazione del DNA del CMV, isolato dal campione biologico in esame tramite la fase di estrazione. Durante la PCR real-time, i prodotti di amplificazione vengono rilevati e quantificati rispetto ad una curva standard utilizzando delle molecole fluorescenti.

Per ogni campione viene estratto, amplificato e rilevato in modo sistematico un Controllo Interno (IC), al fine di verificare la procedura di estrazione e l’eventuale presenza nel campione di potenziali inibitori della PCR.

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Grazie al comune Controllo Interno utilizzato in estrazione, lo stesso campione può essere investigato anche con gli altri test quantitativi del pannello Dx Assays dedicato alla diagnostica delle infezioni nei soggetti immunocompromessi.

Preparazione dei campioni

L'estrazione automatica e manuale del DNA viene eseguita su tutti i tipi di campioni elencati nel capitolo "Raccolta e trattamento dei campioni", utilizzando rispettivamente il sistema bioMérieux NucliSens® easyMAG® ed il kit Qiagen QIAamp® DNA mini kit conformemente ai Manuali di istruzioni forniti dai produttori (bioMérieux, QIAGEN).

Un Controllo Negativo (NC) viene processato insieme agli altri campioni.durante l'intera fase di preparazione del campione Il Controllo Interno (IC) viene aggiunto a ciascun campione ed al Controllo Negativo all'inizio della procedura di preparazione del campione.

Amplificazione e rilevamento mediante PCR Real-Time

Il test Dx CMV Assay è stato validato per l'uso in combinazione con lo strumento Dx Real-Time System (Bio-Rad).

Al termine dell'estrazione, il DNA estratto e la master mix vengono dispensati manualmente nelle Dx 24-Well PCR Strips. Nella tecnologia PCR real-time, vengono utilizzate specifiche sonde oligonucleotidiche fluorescenti per rilevare, tramite ibridazione degli ampliconi, il DNA bersaglio durante l'amplificazione. Nel test Dx CMV Assay, vengono utilizzate due diverse sonde oligonucleotidiche: [1] La sonda specifica per il CMV per rilevare la sequenza bersaglio del genoma del virus, e [2] la sonda di rilevamento del Controllo Interno per controllare la procedura di estrazione e la presenza di inibitori della PCR. In assenza di DNA target per una determinata sonda oligonucleotidica, la relativa fluorescenza non verrà emessa e quindi non sarà rilevato alcun segnale. Quando il DNA target è presente, l'intensità della fluorescenza aumenta con l'aumentare della quantità di ampliconi nei cicli di amplificazione. Ad ogni fase di allungamento, il modulo ottico dello strumento Dx Real-Time System misura la fluorescenza ottenuta da ciascun fluoroforo e il Dx Real-Time Software associato rileva l'intensità della fluorescenza rispetto al numero di cicli. Al termine del test, il Dx Real-Time Software analizza in modo automatico i risultati per tutti i campioni, gli Standard di Quantificazione (QS) e i controlli.

4. REAGENTI 4.1. Descrizione

Il kit contiene reagenti sufficienti per eseguire 96 test. Tutti i reagenti sono indicati unicamente per uso diagnostico in vitro.

Etichetta Descrizione PRESENTAZIONE

AM Amplification Mix

Miscela di Amplificazione concentrata (blu)

DNA polimerasi in un soluzione tampone contenente primers, sonde fluorescenti specifiche, dNTPs, MgCl2

Conservante: 0,03% ProClin™ 300

2 x 150 µl Da diluire con l'aggiunta di DIL

DIL Amplification Mix Diluent

Diluente per Miscela di Amplificazione (bianco) Soluzione tampone contenente MgCl2

2 x 645 µl Pronto per l'uso

IC Internal Control Controllo Interno (giallo)

DNA non infettivo in una soluzione tampone Tris-HCl-EDTA.

NC Negative Control Controllo Negativo (verde) Soluzione tampone Tris-HCl-EDTA.

PC Positive Control

Controllo positivo (rosso)

DNA non infettivo contenente una sequenza di CMV in una soluzione tampone Tris-HCl-EDTA.

QS1 Quantification Standard

Standard di Quantificazione (marrone)

DNA non infettivo contenente sequenza di CMV in una soluzione tampone Tris-HCl-EDTA.

Concentrazione: 100000 copie/µl Conservante: 0,03% ProClin™ 300

1 x 600 µl

Pronto per l'uso

QS2 Quantification Standard

DNA non infettivo contenente sequenza di CMV in una soluzione tampone Tris-HCl-EDTA.

Standard di Quantificazione e riferimento per la ricalibrazione della curva (arancione)

DNA non infettivo contenente una sequenza di CMV in una soluzione tampone di Tris-HCl-EDTA.

DNA non infettivo contenente una sequenza di CMV in una soluzione tampone Tris-HCl-EDTA.

Concentrazione: 5 copie/µl

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4.2. Requisiti per la conservazione e la manipolazione

Il kit Dx CMV Assay deve essere conservato congelato ad una temperatura di -18°C/-22°C. Se conservati correttamente a questa temperatura, tutti i reagenti possono essere utilizzati fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta.

Identificativo Conservazione dopo l'apertura

Controllo Negativo (NC) 2 mesi a -18°C/-22°C. Ogni provetta può essere utilizzata due volte.

In caso di contaminazione eliminare il reagente.

Controllo Positivo (PC) 4 mesi a -18°C/-22°C. Ogni provetta può essere utilizzata fino a 4 volte.

Controllo Interno (IC) 4 mesi a -18°C/-22°C. Ogni provetta può essere utilizzata fino a 4 volte.

Standard di Quantificazione (QS1, QS2, QS3, QS4)

2 mesi a -18°C/-22°C. Ogni provetta può essere utilizzata due volte.

Miscela ricostituita (AM+DIL) 2 mesi a -18°C/-22°C. Ogni provetta può essere utilizzata due volte.

Se congelata, la miscela ricostituita può essere scongelata una sola volta.

5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI D’USO Esclusivamente per uso diagnostico in vitro.

5.1. Precauzioni per la salute e la sicurezza

• Durante la manipolazione di reagenti e campioni, indossare guanti monouso, camice da laboratorio e protezioni per gli occhi.

• Lavare con cura le mani dopo aver manipolato reagenti e campioni. Non mangiare, bere o fumare nelle zone di lavoro.

• Trattare tutti i campioni come potenzialmente infetti nel rispetto della Buona Pratica di Laboratorio.

• Le sostanze chimiche devono essere manipolate e smaltite nel rispetto della Buona Pratica di Laboratorio.

• La scheda di sicurezza è disponibile su richiesta presso il proprio rappresentante locale Bio-Rad.

5.2. Precauzioni relative alla procedura

• Questo kit è stato validato esclusivamente per l'utilizzo combinato con lo strumento Dx Real-Time System (Bio-Rad Cat. # 94000) ed il relativo software Dx Real-Time Software.

• L'estrazione del DNA deve essere eseguita, utilizzando rispettivamente il sistema bioMérieux NucliSens® easyMAG® o il kit Qiagen QIAamp® DNA mini kit conformemente ai Manuali di istruzioni forniti dai produttori.

• Non utilizzare i reagenti scaduti.

• Eccezione fatta per il controllo interno (IC), non scambiare, mischiare o combinare reagenti appartenenti a kit con numeri di lotto differenti.

• Non modificare la procedura di dosaggio.

• Prestare la massima attenzione al fine di evitare contaminazioni incrociate durante le fasi di trattamento dei campioni:

assicurarsi che i contenitori dei campioni non entrino in contatto tra loro; se i guanti entrano in contatto con il campione, sostituirli immediatamente.

• Utilizzare un nuovo puntale con filtro per ciascun campione.

• Utilizzare microprovette e puntali con filtro privi di DNase e RNase.

• Ricostituire con cura la Miscela di Amplificazione evitando qualsiasi contaminazione.

• Verificare l'esattezza ed il corretto funzionamento di pipette ed altre apparecchiature.

• Evitare la fuoriuscita dei campioni o delle soluzioni che li contengono. Gli eventuali sversamenti devono essere risciacquati con candeggina diluita al 10%. Il materiale utilizzato per la pulizia deve essere smaltito in un contenitore per residui contaminati.

• Le superfici di lavoro, le pipette e le altre apparecchiature devono essere decontaminate regolarmente con candeggina diluita all'1%.

• Aree di lavoro: all'interno del laboratorio, due aree dedicate devono essere utilizzate in modo unidirezionale per eseguire le fasi di preparazione e di amplificazione/rilevamento del campione:

1. L'area di pre-amplificazione è riservata a: (a) la preparazione di campioni e controlli e (b) l'organizzazione della PCR (pipettaggio della Miscela di Amplificazione, controlli e campioni nelle Dx 24-Well PCR Strips). Queste due fasi devono essere svolte in due zone distinte dell'area di pre-amplificazione.

2. L'area di amplificazione è dedicata alla reazione di PCR real-time. Tutti i reagenti, le apparecchiature e i camici da laboratorio utilizzati all'interno dell’area devono rimanere in questa area e non entrare mai nell’area di pre- amplificazione. Mai trasferire i prodotti di amplificazione o le attrezzature dell'area di amplificazione nell'area di pre- amplificazione.

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6. RACCOLTA E TRATTAMENTO DEI CAMPIONI

I campioni devono essere raccolti e trasportati conformemente alle istruzioni del laboratorio di riferimento ed alla legislazione locale sul trasporto di materiale infetto e pericoloso.

I campioni devono essere raccolti e trasportati nel più breve tempo possibile in relazione allo specifico utilizzo finale.

I campioni devono essere chiaramente identificati con codici o nomi al fine di evitare l'errata interpretazione dei risultati.

Campioni di plasma:

Il sangue intero deve essere raccolto in provette contenenti EDTA in base alle linee guida del laboratorio

Conservare il sangue intero raccolto a temperatura ambiente e separare il plasma dalle cellule entro 2 ore dalla raccolta mediante centrifugazione (circa 1200 g per almeno 10 minuti a temperatura ambiente). Il plasma non direttamente trattato all'arrivo deve essere conservato a +2°C/+8°C per massimo una settimana. Per periodi più lunghi, conservare il plasma a - 18°C/-22°C.

Il plasma deve essere inviato al laboratorio preferibilmente a temperatura ambiente (+18°C/+25°C) o a +2°C/+8°C.

In caso di utilizzo di campioni congelati, scongelarli appena prima della fase di estrazione per evitare la degradazione dell'acido nucleico.

7. PROCEDURA

7.1. MATERIALI NECESSARI 7.1.1 Materiali forniti

• Dx CMV Assay (cat. # 37020) 7.1.2. Materiali necessari forniti a parte

• Strumento Dx Real-Time System ed accessori (Bio-Rad, cat.# 94000)

• Strumento Dx Strip Cap Tool (fornito nella confezione dello strumento Dx Real-Time System Bio-Rad cat.#94000)

• Dx 24-Well PCR Strips (cat. # 94020) 7.1.3. Materiali necessari ma non forniti

Per l'estrazione con il sistema NucliSens® easyMAG®

• Strumento NucliSens® easyMAG®, reagenti e materiale di consumo di bioMérieux: tamponi di estrazione easyMAG® 1, 2 e 3 (cat. # 280130, 280131 e 280132), Silice Magnetica easyMAG® (cat. # 280133), Tampone di lisi easyMAG® (cat. # 280134) e Prodotti monouso easyMAG® (cat. # 280135), puntali Biohit (cat. # 280146) e (facoltativo) strip da 8 pozzetti (cat. # 278303).

• Centrifuga da tavolo per microprovette da 1,5 ml e 2 ml

• Miscelatore vortex

• Microprovette da 1,5 o 2 ml con tappo a vite ermetico e fondo di forma tonda

• Pipette regolabili calibrate p10 o p20, p100 o p200 e p1000

• Puntali sterili per pipette con filtro

• Acqua per biologia molecolare

• Opzionale: Tampone fosfato salino (PBS)

• Guanti monouso senza polvere

Per l'estrazione con il kit QIAamp^® DNA mini kit

• QiAamp^® DNA Mini Kit 250 (Cat.# 51306), reagenti supplementari e materiale di consumo di Qiagen: Proteinasi K (2 x 2 ml cat.# 19131 o 1x10 ml cat.# 19133), buffer AL (1 x 216 ml cat.# 19075) e tubi di raccolta da 2 ml (cat.# 19201)

• Centrifuga da tavolo per microprovette da 1,5 ml e 2 ml

• Miscelatore vortex

• Etanolo 96-100%

• Opzionale: Tampone fosfato salino (PBS)

• Blocco termico capace di raggiungere i 56°C

• Pipette regolabili calibrate p10 o p20, p100 o p200 e p1000.

• Puntali sterili per pipette con filtri.

• Microprovette da 1,5 o 2 ml con tappo a vite ermetico e fondo di forma tonda

• Guanti monouso senza polvere

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7.2. PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI 7.2.1 In caso di estrazione con il sistema NucliSens® easyMAG®

La piattaforma NucliSens® easyMAG® è concepita per l'isolamento automatico dell'acido nucleico totale (DNA/RNA) dei campioni biologici.

La conservazione del tampone di lisi a 2-8°C può causare la formazione di cristalli a causa della elevata concentrazione dei Sali contenuti. I cristalli devono essere sciolti prima dell'uso.

Accertarsi che i tamponi 2 e 3 NucliSens® easyMag® siano a temperatura ambiente prima di iniziare la procedura.

Una volta caricati nell'area reagenti dello strumento, tutti i tamponi saranno stabili per massimo 1 mese in condizioni ambiente.

Una volta aperta, la silice magnetica può essere conservata per un massimo di 14 giorni a 2-8°C.

Per l'estrazione dei campioni di plasma, la silice magnetica deve essere diluita con acqua per biologia molecolare, come indicato nel paragrafo 7.3.2 al punto 9 ed utilizzata immediatamente.

Per ulteriori informazioni, fare riferimento al manuale d'uso del sistemaNucliSens® easyMAG®.

7.2.2 In caso di estrazione con il kit Qiagen®

Il kit QIAamp® DNA Mini Kit è concepito per la purificazione del DNA totale dal liquido biologico mediante una centrifugazione.

Buffer AW1: Prima di utilizzarlo per la prima volta, aggiungere etanolo (96-100%) come indicato sul flacone. Il Buffer AW1 preparato è stabile per 1 anno se conservato chiuso a temperatura ambiente.

Buffer AW2: Prima di utilizzarlo per la prima volta, aggiungere etanolo (96-100%) come indicato sul flacone. Il Buffer AW2 preparato è stabile per 1 anno se conservato chiuso a temperatura ambiente.

Per ulteriori informazioni, fare riferimento al manuale d'uso del kit Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit.

7.2.3 Ricostituzione della Miscela di Amplificazione (AM)

Prima della ricostituzione, le provette AM (Miscela di Amplificazione) e DIL (diluente per Miscela di Amplificazione) devono essere scongelate, miscelate sul vortex per 5 secondi, quindi centrifugate per 15 secondi.

Aggiungere 645 µl di Diluente per Miscela di Amplificazione (DIL) in una provetta di Miscela di Amplificazione (AM) concentrata.

Miscelare nel vortex per 10 secondi quindi centrifugare brevemente.

Una provetta di Miscela di Amplificazione Ricostituita (AM+DIL) è sufficiente per 48 reazioni PCR real-time. Preparare il numero necessario di provette di Miscela di Amplificazione Ricostituita (AM+DIL) (ad esempio, 2 provette se è necessario eseguire 96 test).

La Miscela di Amplificazione Ricostituita (AM+DIL) può essere utilizzata immediatamente o conservata a –20°C per un massimo di 2 mesi. Ogni provetta può essere utilizzata due volte. Se congelata, la miscela ricostituita può essere scongelata una sola volta.

La Miscela di Amplificazione (AM) e la Miscela di Amplificazione Ricostituita (AM+DIL) sono sensibili alla luce. Proteggerle da forti fonti di luce.

7.3. ISTRUZIONI PER L'USO

Attenersi scrupolosamente alle presenti istruzioni e osservare la buona pratica di laboratorio.

7.3.1. Estrazione automatica del DNA con il sistema NucliSENS^® easyMAG® (bioMérieux)

Prima dell'uso per la prima volta, attenersi alle istruzioni riportate nel manuale del produttore per la preparazione dei reagenti e della strumentazione.

Procedura per i campioni di plasma

1. Impostare lo strumento come protocollo “Generic”

2. Volume campioni di plasma = 500 µl 3. Volume di eluizione = 55 µl

4. Tipo di campione = “Primary”, con incubazione per la lisi

5. Aggiungere 500 µl di campione nel rack monouso idoneo (8 campioni/ciascuno).

6. Inserire il rack monouso nella posizione corretta dello strumento.

7. Iniziare la fase di lisi con dispensazione automatica e incubazione all’interno dello strumento (10 min).

8. Durante la fase di lisi procedere alla preparazione della Pre-miscela come indicato di seguito:

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Reagente 1 test 12 test 24 test

Silice magnetica 50 µl 600 µl 1200 µl

Acqua per biologia molecolare 50 µl 600 µl 1200 µl

Controllo Interno (IC) 6 µl 72 µl 144 µl

La Pre-miscela deve essere utilizzata immediatamente. La Pre-miscela rimanente deve essere eliminata.

9. Aggiungere 100 µl di Pre-miscela a ciascun campione. Miscelare il campione con la pipetta elettronica Biohit utilizzando il programma 3.

10. Riavviare lo strumento con la fase di estrazione automatica (40 min).

Trasferire con cautela il campione purificato in una microprovetta pulita da 1,5 ml con tappo a vite evitando durante il prelievo il contatto del puntale con la silice entro 30 minuti dal termine dell’estrazione automatica.

Il DNA estratto e trasferito può essere tenuto a temperatura ambiente per 2 ore o conservato a 2-8°C per un tempo massimo di 4 giorni. Per periodi più lunghi di conservazione, il DNA estratto deve essere conservato a -20°C fino ad un tempo massimo di 6 mesi.

7.3.2. Estrazione manuale del DNA con il kit QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen)

1. Prima dell'uso per la prima volta, attenersi alle istruzioni riportate nel manuale del produttore per la preparazione dei reagenti.

2. Determinare il numero di campioni da esaminare e utilizzare una microprovetta con tappo a vite per ciascun campione ed una per il Controllo Negativo (NC). Identificare ciascuna microprovetta.

3. Equilibrare a temperatura ambiente i campioni.

4. Riscaldare il blocco termico a 56°C.

5. Se si forma un precipitato nel buffer AL, scioglierlo mediante incubazione a 56°C.

Procedura per i campioni di plasma

6. Aggiungere 40 µl di proteinasi K (PK) sul fondo di ciascuna microprovetta da 1,5 ml con tappo a vite.

Nota: Non aggiungere la proteinasi K direttamente nel buffer AL

7. Aggiungere 400 µl di campione nella microprovetta da 1,5 ml con tappo a vite.

8. Aggiungere 400 µl di buffer AL nel campione. Miscelare brevemente nel vortex per 15 sec.

9. Aggiungere 6 µl di Controllo Interno (IC) fornito con il kit Dx CMV Assay nel campione.

10. Incubare a 56°C per 10 min.

11. Centrifugare per eliminare le gocce dall'interno del coperchio.

12. Aggiungere 400 µl di etanolo 96-100% nel campione e miscelare brevemente nel vortex per 15 secondi. Centrifugare brevemente per eliminare le gocce dall'interno del coperchio.

13. Trasferire con cautela 620 µl della miscela nella colonnina QIAamp senza bagnare il bordo. Chiudere il tappo e centrifugare a 6000g (8000 giri/min.) per 1 min. Mettere la colonnina QIAamp in un tubo di raccolta pulito e gettare il tubo contenente il filtrato.

14. Ripetere il punto 13 trasferendo il volume rimanente della miscela.

15. Aggiungere con cautela 500 µl di buffer AW1 nella colonnina senza bagnare il bordo. Chiudere il tappo e centrifugare a 6000g (8000 giri/min.) per 1 min. Mettere la colonnina QIAamp in un tubo di raccolta pulito e gettare il tubo contenente il filtrato.

16. Aggiungere con cautela 500 µl di buffer AW2 nella colonnina senza bagnare il bordo. Chiudere il tappo e centrifugare a 20000g (14000 giri/min.) per 3 min.

17. Mettere la colonnina QIAamp in un tubo di raccolta pulito e gettare il tubo contenente il filtrato. Centrifugare a massima velocità per 1 min.

18. Mettere la colonnina QIAamp in una microprovetta da 1,5 ml pulita con tappo a vite e gettare il tubo contenente il filtrato.

19. Aprire la colonnina QIAamp e aggiungere 50 µl di buffer AE. Incubare a temperatura ambiente (18-25°C) per 1 minuto e centrifugare a 6000g (8000 giri/min.) per 1 min.

20. Gettare la colonnina QIAamp.

Il DNA estratto può essere conservato a 2-8°C per un massimo di 4 giorni o a -20°C per un massimo di 6 mesi.

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7.3.3 Curva standard

Gli Standard di Quantificazione (QS1- QS4), forniti nel kit Dx CMV Assay, devono essere inclusi nella corsa di PCR ogni volta che si usa un nuovo lotto del kit Dx CMV Assay per generare una curva standard nel software Dx Real-Time Software.

La curva standard memorizzata (Pendenza o Slope, R2) è valida per un massimo di 6 mesi e uno Standard di Quantificazione (QS3), proveniente dallo stesso lotto di kit, deve essere utilizzato nelle PCR successive come calibratore.

NOTA: Accertarsi di osservare scrupolosamente le condizioni di conservazione di QS3 come descritto al paragrafo 4.2.

Se il valore di Ct di QS3 rientra nei criteri di accettabilità, la curva standard memorizzata verrà traslata in modo da corrispondere al valore QS3.

7.3.4. Amplificazione/rilevamento mediante PCR real-time

Per informazioni più dettagliate, fare riferimento al manuale d'istruzioni dello strumento Dx Real-Time System.

Ciascun test di quantificazione deve contenere un Controllo Negativo ed un controllo Positivo ed i necessari Standard di Quantificazione.

Nell'area di pre-amplificazione:

1. Ricostituire le provette di Miscela di Amplificazione in base alla necessità seguendo la procedura riportata al paragrafo 7.2.3 (numero di test = n campioni + 1 Controllo Positivo + 1 Controllo Negativo + i necessari Standard di Quantificazione).

2. Prendere il numero necessario di Dx 24-Well PCR Strips, posizionarle su un supporto e dispensare con attenzione, mediante un pipettatore a ripetizione, 15 µl di Miscela di Amplificazione Ricostituita (AM+DIL) in ciascun pozzetto.

3. Aggiungere 10 µl di DNA estratto oppure di Controllo Negativo (NC) estratto oppure di Controllo Positivo (PC) non estratto e il necessario Standard di Quantificazione (QS1-QS4, o solo QS3) nei pozzetti corrispondenti, seguendo la mappa definita della piastra.

4. Posizionare le Dx 8-Cap Strips sulle Dx 24-Well PCR Strips e chiuderle fermamente.

5. Centrifugare le Dx 24-Well PCR Strips per 30 secondi a 400 g per evitare la formazione di bolle nei pozzetti.

Nell'area di amplificazione:

6. Accendere il computer, quindi lo strumento Dx Real-Time System. Aprire il software Dx Real-Time Software. Inserire il proprio nome utente e login e fare clic su "Setup".

7. Fare clic su "create a new plate" e selezionare il nome del kit PCR in "PCR kit". Per ulteriori informazioni sul nome del kit PCR, contattare il proprio centro di assistenza locale.

8. Fare clic sul pulsante "Run", quindi su "Open Lid".

9. Caricare le Dx 24-Well PCR Strips nello strumento Dx Real-Time System e utilizzare lo strumento Dx Strip Cap Tool per l'alloggiamento delle Dx 8-Cap Strips.

10. Fare clic sul pulsante "Close lid", quindi sul pulsante "Start run".

11. Fare clic su "Results" per visualizzare i risultati.

Dopo aver completato la reazione PCR real-time, rimuovere le Dx 24-Well PCR Strips utilizzate dallo strumento Dx Real-Time System, metterle in una busta di plastica a chiusura ermetica e smaltirle in base alla buona pratica di laboratorio.

8. CALIBRAZIONE

Durante ogni ciclo di PCR, nella fase di allungamento, il modulo ottico dello strumento Dx Real-Time System misura la fluorescenza ottenuta da ciascun fluoroforo e il Dx Real-Time Software associato rileva l'intensità della fluorescenza rispetto al numero di cicli.

A fine corsa, il software Dx Real-Time analizza automaticamente i dati della fluorescenza raccolti e decifra i risultati in base ai criteri di validazione del test. L'analisi dei risultati del test Dx CMV Assay è basata sul valore di Ct.

Il Ct è definito come numero frazionario del ciclo di PCR in cui la fluorescenza di fondo sottratta supera una soglia definita empiricamente per ciascuna sequenza di acido nucleico rilevata dal saggio. Entro il range di quantificazione del test, il Ct è teoricamente inversamente proporzionale al logaritmo del numero di copie della sequenza target nel campione prima dell'amplificazione: più è alto il valore Ct, più basso sarà il numero di copie iniziali.

Per ogni campione, i valori del parametro matematico di interesse vengono calcolati per le rispettive curve di amplificazione e visualizzati accanto al risultato e al/ai flag. Se una curva PCR non mostra alcuna amplificazione significativa, viene visualizzato un "*" al posto del valore numerico.

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9. CONTROLLO DI QUALITÀ Controlli positivi e negativi

In ogni corsa è necessario includere un Controllo Negativo ed uno positivo, al fine di rilevare potenziali errori nelle fasi di elaborazione, amplificazione e rilevamento del campione. Se i valori di Ct dei controlli non rientrano nel range previsto, il software Dx Real-Time Software invalida l'intero test e visualizza uno dei seguenti flag:

* Controllo Negativo:

Flag Significato

Invalid_IC Controllo Interno non valido

CMV_conta contaminazione da CMV DNA

* Controllo positivo:

Flag Significato

CMV_out Valore CMV fuori range

Se viene visualizzato uno di questi flag, il test deve essere ripetuto.

Curva standard

Per la quantificazione dei campioni, è necessario includere nella corsa tutti gli Standard di Quantificazione (QS) forniti nel kit Dx CMV Assay, al fine di creare una curva standard di calibrazione (prima corsa).

* Curva standard (QS1-QS4):

Criteri di accettabilità Pendenza (Slope) -3.9 < pendenza < -3.1

Correlazione (R2) R2 > 0.98

Se i valori non rientrano nei criteri di accettabilità, dovrà essere ripetuto l'intero test facendo una nuova corsa di PCR.

* Standard di Quantificazione (QS3) :

Nei test seguenti, deve essere incluso solo lo Standard di Quantificazione (QS3) per validare la curva standard definita precedentemente. Se il valore di Ct dello Standard di Quantificazione (QS3) non rientra nel range previsto, il software Dx Real- Time Software invalida l'intero test e visualizza il seguente flag:

Flag Significato

QS_out Valore dello Standard di Quantificazione fuori range Se il valore è fuori range, dovrà essere ripetuto l'intero test facendo una nuova corsa di PCR.

Rilevamento dell'inibizione: Controllo Interno

Il Controllo Interno (IC) viene aggiunto a ciascun campione ed al Controllo Negativo all'inizio della fase di estrazione del DNA, e viene rilevato mediante una sonda specifica durante la reazione di PCR real-time.

I campioni il cui valore di Ct del Controllo Interno supera il valore previsto (quindi potenzialmente inibiti) vengono interpretati dal software Dx Real-Time software nel modo seguente:

• Qualsiasi campione negativo viene indicato come " Failed" per questo determinato target.

•

Qualsiasi campione con un target rilevabile (< LLOQ o entro il range di quantificazione del target) viene indicato per questo determinato target come "CMV_POS" ma non quantificabile (Invalid_IC).

• Qualsiasi campione con una carica virale al di sopra del limite superiore di quantificazione (ULOQ) del target viene indicato come "CMV_POS" con il flag "> ULOQ".

Se il valore di Ct del Controllo Interno non rientra nei criteri di accettabilità e viene pertanto dichiarato "Non valido", ripetere l'analisi estraendo ed analizzando il campione in esame adeguatamente diluito in PBS, seguendo la comune pratica di laboratorio per la diagnostica molecolare mediante PCR real-time.

Il fattore di diluizione del campione (ad es.: 1/2, 1/10, 1/100) deve essere scelto accuratamente sulla base del valore di Ct del campione visualizzato nel software Dx e deve essere inversamente proporzionale al valore Ct del campione.

(9)

10. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 10.1. Criteri di validazione del test Il test è valido se:

• Il valore Ct del Controllo Positivo rientra nel range previsto per il target.

• Il Controllo Negativo è privo di valoreCt per il target ed il valore di Ct del Controllo Interno rientra nel range previsto

• I valori della curva standard soddisfano i criteri di accettabilità oppure

• Il valore dello Standard di Quantificazione 3 (QS3) rientra nel range previsto per il target.

Se il test è valido, il software Real-Time Dx Software riporta la corsa come "Passed". In caso contrario, il software Dx Real-Time Software riporta la corsa come "Failed".

Se la corsa è "Failed", tutti i risultati dei test di quel test vengono riportati come "Invalid" e tutti i relativi campioni e controlli devono essere rielaborati come indicato al capitolo 9.

10.2. Calcolo/ interpretazione dei risultati

Il dosaggio Dx CMV Assay è stato standardizzato rispetto al 1° standard internazionale WHO per l'HCMV (codice NIBSC 09/162) al fine di esprimere la concentrazione dei campioni anche in unità internazionali (IU/ml).

Il calcolo dei risultati viene eseguito dal software Dx Real-Time Software, che determina automaticamente i valori Ct per il CMV e per il Controllo Interno nei campioni e nei controlli.

Se il test è valido, ogni campione (inibito oppure no) con un CMV DNA rilevabile viene indicato dal software Dx Real-Time Software come "CMV_POS" per questo determinato target. Tuttavia, un campione positivo con il flag "Invalid_IC" non può essere quantificato. Il campione corrispondente deve quindi essere rianalizzato a partire dalla fase di estrazione del DNA del campione adeguatamente diluito in PBS come descritto al capitolo 9.

La tabella seguente riepiloga le differenti situazioni possibili per l'interpretazione del test del CMV, con i messaggi associati ed il relativo significato:

Criteri Interpretazione

"Risultato" Significato Messaggio

"Flag"

VALIDO Controllo Interno

Campione negativo

"CMV_neg" CMV DNA non rilevato Nessuno

Campione positivo senza titolo

"CMV_POS"

CMV DNA inferiore al limite inferiore di

quantificazione (LLOQ) < LLOQ Campione positivo

Titolo in copie/ml o UI/ml

"CMV_POS"

CMV DNA pari o superiore al limite inferiore di quantificazione (LLOQ) e inferiore o pari al limite

superiore di quantificazione (ULOQ)

Nessuno

"CMV_POS"

CMV DNA superiore al limite superiore di

quantificazione (ULOQ) > ULOQ

NON VALIDO Controllo Interno

"Failed" CMV DNA non rilevato Invalid_IC

"CMV_POS"

CMV DNA rilevabile ma non quantificabile Invalid_IC CMV DNA superiore al limite superiore di

quantificazione (ULOQ) > ULOQ

(10)

11. LIMITAZIONI DEL TEST

• Le prestazioni ottimali di questo test dipendono direttamente dalla qualità dei campioni. Pertanto è importante attenersi alle indicazioni riportate nel capitolo "Raccolta e trattamento di campioni".

• Il dosaggio dovrebbe essere eseguito unicamente sui tipi di campione indicati. Altre tipologie di campione non sono state validate.

• L'uso di questo dosaggio è riservato al personale addestrato all'impiego del dosaggio Dx CMV Assay, dello strumento Dx Real-Time System e del software Dx Real-Time Software.

• Un risultato negativo non esclude la possibilità di infezione poiché i risultati dipendono da molte variabili. La raccolta o il trattamento non adeguato del campione, la presenza di inibitori o un errore tecnico può portare a un risultato errato.

• Come per qualsiasi test diagnostico, i risultati del test Dx CMV Assay vanno interpretati insieme agli altri esami clinici e di laboratorio.

• I campioni contenenti residui di fibrina o grosse particelle o filamenti e strutture microbiologiche devono essere scartati perché potrebbero dare origine a falsi risultati.

• I campioni di plasma emolizzati (rossi) e iperlipemici ("lattiginosi") devono essere scartati perché potrebbero generare risultati falsi.

• I campioni di plasma raccolti in tubi contenenti eparina come anticoagulante non devono essere utilizzati perché l'eparina (>10 IU/ml) influisce sulle reazioni PCR.

• Le prestazioni descritte del kit possono essere garantite unicamente per i sistemi di estrazione e lo strumento PCR raccomandati.

12. PRESTAZIONI DEL SAGGIO

12.1. DETERMINAZIONE DELLA PRECISIONE 12.1.1 Riproducibilità e misurazione della ripetibilità

Un pannello di campioni costituito da campioni negativi e campioni positivi per CMV in concentrazioni diverse (basso, medio e alto) è stato creato ed analizzato ai fini di uno studio di precisione effettuando 3 repliche del processo di estrazione.

Questo studio è stato eseguito con 2 diversi lotti Dx CMV Assay (Lotto1, Lotto2) utilizzando 2 diversi Dx Real-Time System in un periodo di 10 giorni con 3 ripetizioni del ciclo di lavoro.

CMV target: Risultati di precisione totali – Valore Ct dei campioni positivi

*Riproducibilità

Pannello CMV Totale Nella singola corsa

Campione

Lotto CMV N Ct

medio DS CV% N Ct

medio DS CV%

Basso (3xLOD) Lotto 1 e Lotto 2 64 37.35 0.87 2.34 20 37.83 0.66 1.73 Medio Lotto 1 e Lotto 2 66 30.04 0.44 1.45 22 30.14 0.43 1.43 Alto Lotto 1 e Lotto 2 66 19.99 0.48 2.38 22 20.09 0.38 1.90

*Ripetibilità

Pannello CMV Totale Nella singola corsa

Campione Lotto CMV N Ct

medio DS CV% N Ct

medio DS CV%

Basso (3xLOD) Lotto 1 32 37.93 0.70 1.84 22 37.77 0.71 1.87

Lotto 2 32 36.78 0.62 1.69 22 36.50 0.49 1.35

Medio Lotto 1 33 30.42 0.17 0.55 22 30.37 0.16 0.52

Lotto 2 33 29.65 0.24 0.82 22 29.59 0.21 0.70

Alto Lotto 1 33 20.40 0.22 1.08 22 20.39 0.26 1.25

Lotto 2 33 19.57 0.22 1.14 22 19.47 0.162 0.83

(11)

12.2. PRESTAZIONI ANALITICHE 12.2.1 Limite di Detection (LOD)

Il Limite di rilevamento (LOD) è stato determinato. in considerazione del metodo di estrazione. analizzando diluizioni seriali del 1^° Standard Internazionale WHO per HCMV (codice NIBSC 09/162) fino alla concentrazione limite ed utilizzando un'analisi Probit per determinare la diluzione corrispondente ad una probabilità di positività del 95%.

L'analisi statistica (Probit) è stata applicata utilizzando i risultati ottenuti da 24 repliche di 6 punti di diluizione analizzati in tre diverse sedute di PCR (8 repliche x 3 corse).

Estrazione automatica con NucliSens® easyMAG® Estrazione manuale con QIAamp® DNA Mini Kit

LOD (95%) = 50 IU/ml = 27.50 copie/ml LOD (95%) = 146 IU/ml = 110 copie/ml

12.2.2 Specificità analitica

La specificità analitica del test Dx CMV Assay è stata valutata su un pannello di campioni di pazienti affetti da infezioni causate da potenziali organismi interferenti ottenuto da un centro clinico di riferimento.

Agenti patogeni di reattività crociata

Non è stata osservata alcuna reazione crociata sul pannello analizzato.

Famiglia Target Concentrazione (copie/ml) Risultato

Herpes virus

EBV 10000 Nessuna amplificazione crociata VZV 10000 Nessuna amplificazione crociata

HHV6 10000 Nessuna amplificazione crociata

HHV8 1000 Nessuna amplificazione crociata HSV1 100000 Nessuna amplificazione crociata HSV2 100000 Nessuna amplificazione crociata

Poliomavirus JCV 10000 Nessuna amplificazione crociata BKV 100000 Nessuna amplificazione crociata

Virus dell'epatite

HBV 1000000 Nessuna amplificazione crociata HCV 1000000 Nessuna amplificazione crociata

(12)

12.3. PRESTAZIONI CLINICHE

12.3.1 Risultati espressi in Unità Internazionali

Un fattore di conversione (copie/unità internazionali) è stato determinato per il test Dx CMV Assay analizzando le diluizioni seriali del 1^° Standard Internazionale WHO per HCMV (NIBSC code 09/162) in un pool di plasma EDTA negativo. I risultati ottenuti in copie/ml possono essere convertiti in Unità Internazionali/ml WHO con il fattore di conversione (CF), specificatamente determinato per ciascun metodo di estrazione utilizzato in combinazione con il kit, come descritto qui di seguito:

Estrazione con NucliSens® easyMag® Estrazione con Qiagen®

Fattore di conversione (CF) 0.55 0.75

La formula per convertire le copie/ml in unità internazionali/ml è la seguente:

Risultati (IU/ml) = valore copie/ml / fattore di conversione

12.3.2 Range dinamico

Il range dinamico diagnostico è stato determinato per il test Dx CMV Assay analizzando le diluizioni seriali del 1° Standard internazionale WHO per HCMV (codice NIBSC 09/162) e di un plasmide, recante la sequenza target di CMV, in un pool di plasma EDTA negativo. Sulla base dei risultati ottenuti da questo studio utilizzando diversi metodi di estrazione, il range dinamico per Dx CMV Assay è il seguente:

Metodo di estrazione Range dinamico

NucliSENS® easyMAG® 200 IU/ml < range dinamico < 20 000 000 IU/ml 110 copie/ml < range dinamico < 11 000 000 copie/ml

QIAamp® DNA mini kit

150 IU/ml < range dinamico < 16 666 667 IU/ml 113 copie/ml < range dinamico < 12 500 000 copie/ml

12.3.3 Sensibilità diagnostica

La sensibilità diagnostica del test Dx CMV Assay è stata valutata in base al pannello QCMD 2012 utilizzato inoltre per confermare la carica virale in IU/ml.

Tutti i campioni sono stati estratti mediante estrazione automatica con il sistema NucliSens® easyMAG® (bioMérieux) e manualmente con il kit QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN).

QCMD 2012 Estrazione conQiagen® Estrazione con NucliSens®

easyMag® Risultati di riferimento (Copie/ml)

Campione n° Risultati

(copie/ml) Risultati log Risultati (copie/ml) Risultati log Risultati log Range log riportato

CMV12-01 12697 4.104 11173 4.048 _4.303 3.977 4.629

CMV12-02 2046 3.311* 2525 3.402 _3.741 3.381 4.101

CMV12-03 POS (<LLOQ) POS (<LLOQ)

2.242 1.755 2.729

CMV12-04 NEG POS (<LLOQ)

2.075 1.553 2.597

CMV12-05 1041 3.017 856 2.932 _2.906 2.469 3.343

CMV12-06 1364 3.135 1200 3.079 _3.302 2.956 3.648

CMV12-07 1459 3.164 980 2.991 _3.329 2.981 3.677

CMV12-08 NEG NEG _NEG

CMV12-09 3285 3.516 3093 3.490 _3.674 3.312 4.036

CMV12-10 495 2.694 290 2.463 _2.733 2.351 3.115

(13)

QCMD 2012 Estrazione con Qiagen® Estrazione con NucliSens®

easyMag® Risultati di riferimento (IU/ml) Campione n° Risultati (IU/ml) Risultati log Risultati (IU/ml) Risultati log Risultati log Range log riportato

CMV12-01 16929 4.229 20315 4.308 _4.389 4.034 4.744

CMV12-02 2728 3.436* 4591 3.662 _3.879 3.578 4.180

CMV12-03 POS (<LLOQ) POS (<LLOQ) _2.253 1.764 2.742

CMV12-04 NEG POS (<LLOQ) _2.031 1.507 2.555

CMV12-05 1388 3.142 1556 3.192 _3.150 2.577 3.723

CMV12-06 1819 3.260 2182 3.339 _3.441 3.072 3.810

CMV12-07 1946 3.289 1782 3.251 _3.438 3.062 3.814

CMV12-08 NEG NEG _NEG

CMV12-09 4379 3.641 5623 3.750 _3.753 3.341 4.165

CMV12-10 660 2.819 528 2.722 _2.783 2.333 3.233

Il campione CMV12-02 estratto con Qiagen DNA mini kit ha mostrato un risultato al di sotto del limite inferiore di accettabilità ma tale variazione non è quantitativamente rilevante ai fini della gestione clinica.

12.3.4 Studio clinico

Uno studio clinico retrospettivo è stato condotto su campioni di plasma di pazienti sottoposti a trapianto e caratterizzati da un kit commerciale per PCR real-time marcato CE. Gli stessi campioni di plasma estratti (estrazione automatica mediante il sistema NucliSens® easyMAG®) sono stati analizzati con il kit Dx CMV Assay e con un altro kit per PCR real-time marcato CE disponibile in commercio.

Analisi qualitativa:

Kit commerciale marcato CE di riferimento

NucliSens® easyMAG® Pos Neg

Dx CMV Assay

Pos 34 1 35

Neg 2 23 25

Totale 36 24 60

Concordanza = 95%

Kit commerciale marcato CE

NucliSens® easyMAG® Pos Neg

Dx CMV Assay Pos 33 2 35

Neg 4 21 25

Totale 37 23 60

Concordanza = 90%

Tutti i campioni con risultati discordanti presentavano cariche virali inferiori al limite di rilevamento (LOD).

(14)

Gli stessi campioni di plasma sono inoltre stati estratti con il sistema di estrazione manuale e analizzati con il kit Dx CMV Assay e il kit commerciale per PCR real-time marcato CE validato per la stessa estrazione.

Kit commerciale marcato CE

Qiagen® DNA mini kit Pos Neg

Dx CMV Assay

Pos 34 1 35

Neg 2 23 25

Totale 36 24 60

Concordanza = 95%

Tutti i campioni con risultati discordanti presentavano cariche virali inferiori al limite di rilevamento (LOD).

Analisi quantitativa:

Sugli stessi campioni sono state eseguite analisi di correlazione per confrontare la carica virale (copie/ml) ottenuta con il kit Dx CMV Assay e con due kit marcati CE. in considerazione anche del metodo di estrazione utilizzato.

La correlazione è stata sempre > 0.95%

Δlog > 0,5

(15)

13. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI

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Osterhaus A.D.M.E.. Niesters H.G.M.. J. Clin. Microbiol.. 2003; 41:576-580.

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3.Functional profiling of a human cytomegalovirus genome. Dunn W..Chou C.. Li H.. Hai R.. Patterson D.. Stolc V.. Zhu H.. Liu F. PNAS. 2003;100:14223-14228.

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7.Comparative analysis of human cytomegalovirus a-sequence in multiple clinical isolates by using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism assays. Zaia J.A.. Gallez-Hawkins G.. Churchill M.A.. Morton-Blackshere A..

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