che possono essere indotti a differenziarsi in DC, coltivandoli in presenza di granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) e di interleuchina 4 (IL4). Le DC si

Riassunto

1. RIASSUNTO

Le cellule dendritiche (DC) sono le più potenti cellule presentanti l’antigene (APC) che possono dare inizio alla risposta immunitaria, attivando i linfociti T vergini, e polarizzandola verso il tipo Th1 o Th2.

Nell’uomo e in altre specie animali, i progenitori delle DC si ritrovano nel sangue periferico come monociti CD14

che possono essere indotti a differenziarsi in DC, coltivandoli in presenza di granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) e di interleuchina 4 (IL4). Le DC si

trovano nella periferia del sistema immunitario sotto forma di cellule immature, la cui capacità è quella di catturare l’antigene (Ag) mediante fagocitosi e endocitosi mediata da recettore. Catturato l’Ag, le DC risultano attivate e migrano ai linfonodi dove vanno incontro ad un ulteriore maturazione. Dopo la maturazione, le DC presentano una ridotta capacità di catturare l’Ag, ma sono in grado di attivare e polarizzare la risposta immunitaria delle cellule T.

Poiché la risposta immunitaria di tipo Th1 è stata associata all’eradicazione dell’infezione virale, l’ applicazione terapeutica delle DC maturate in vitro e reinoculate in vivo viene studiata al fine di provocare una risposta immunitaria nell’animale infetto.

Sono già stati descritti diversi studi in immunoterapia con DC generate ex vivo allo scopo di migliorare la protezione immunitaria sia contro il virus dell’immunodeficienza della scimmia nei macachi che contro il virus dell’immunodeficienza umana (HIV) nell’uomo; inoltre sono stati fatti studi

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Riassunto

clinici nell’uomo in cui le DC, caricate con Ag tumorali, sono state usate al fine di aumentare la risposta immunitaria contro tumori maligni. Per quello che riguarda il gatto, l’infezione da virus dell’immunodeficienza felina (FIV) è stata per molto tempo studiata come modello per AIDS umano, ma ancora oggi, si conosce molto poco del ruolo svolto dalle DC feline in questo contesto

Per ottenere le DC da monociti provenienti da sangue periferico sono stati valutati tre diversi metodi: purificazione su gradiente di Percoll, purificazione tramite MaCS e infine aderenza su piastra per 24 h.

Il grado di purezza e il numero di cellule ottenute mediante gradiente di Percoll e la difficoltà di far differenziare i monociti purificati mediante MaCS in plasma autologo ci ha indotto ad utilizzare l’aderenza su piastra come metodo ottimale per la generazione di DC da PBMC felini. I monociti, provenienti da sangue periferico, venivano fatti aderire su piastra per 24 ore in terreno con 3%

di plasma autologo, dopo prove sia per testare il miglior tempo di adesione a 3, 6, 12 e 24 h, sia per scegliere il migliore supplemento a base di siero, e la sua concentrazione, al fine di ottenere il maggior numero di DC. Per essere certi che le DC feline entrassero in contatto con il minor numero possibile di Ag esogeni, è stato evitato l’utilizzo, in vitro, di FCS, utilizzando al suo posto il plasma autologo di gatto e sono state utilizzate solo citochine ricombinanti carrier-free di origine felina. I monociti coltivati in presenza di IL4 felina e

GM-CSF felino per cinque giorni sono stati poi maturati lipopolisaccaride (LPS), fattore di necrosi tumorale α umano ricombinante (TNF α ), il poly (I:C), con piastrine feline attivate, CD40 ligand (CD40L) e interferone α umano ricombinante (IFN α), poiché, in altre specie, tali stimoli inducono le DC a

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Riassunto

maturare. Dopo 48 ore dall’aggiunta delle sostanze, le DC sono state analizzate al FACS sia per la loro dimensione e complessità, sia per l’espressione di marker di superficie quali CD1a, MHC di classe II, il CD14 e il B7.1. In

parallelo, è stata analizzata la loro abilità nel catturare l’Ag mediante pinocitosi e endocitosi mediata dal recettore mannosio (MMR), o nell’innescare alloreattività da parte di linfociti felini.

Nel presente lavoro di tesi sono state stabilite le condizioni ottimali per coltivare un numero congruo di DC feline per un futuro uso clinico in immunoterapia e/o immunoprofilassi.

Inoltre, è stato individuato l’LPS come stimolo migliore per indurre un’efficiente maturazione nelle DC feline derivate da monociti.

Infine, sono stati selezionati i parametri che permettono di prevedere l’abilità delle mDC nell’indurre una maggiore risposta immunitaria allo scopo di stabilire un protocollo per l’uso di DC feline, in vivo, in esperimenti d’immunoprofilassi/ immunoterapia; tali parametri sono risultati l’MHC, già espresso sulle iDC e 10 volte maggiore sulle mDC, e il B7.1 espresso solo sulle mDC. In assoluto, tuttavia, la capacità di rendere le DC buone induttrici di allo reattività è risultato il migliore correlato di maturazione.

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