2.1 Studio dei recettori attraverso la metodica del binding radioattivo
Il saggio di binding è una tecnica biochimica che permette l’identificazione di siti recettoriali (binding site) su cellule bersaglio o su frazioni cellulari, quali membrana esterna, reticolo sarcoplasmatico o mitocondri.
Tramite l’impiego di radioisotopi affini alla struttura recettoriale in esame è possibile valutare sia l’affinità del radioligando per il recettore che la densità recettoriale.
Il binding site si distingue dal recettore, poiché è solamente un sito accettore, ma ad esso non è necessariamente legata la trasmissione del segnale e una risposta fisiologica.
Perché si possa parlare di recettore, occorre che ci sia competizione con agonisti o antagonisti (che appartengono a classi farmacologiche e chimiche diverse), e che lo stimolo prodotto dal legame dell’agonista provochi una risposta fisiologica.
Soltanto quando sono uguali certi parametri, come l’affinità del composto in vitro, la potenza farmacologia in vivo, stereospecificità, saturabilità e reversibilità, il binding-site si identifica con il receptor-site. La formazione del complesso ligando-binding-site è soggetta alla legge di azione di massa, e risulta pertanto espressa dalla costante di equilibrio Ka , ovvero la costante di associazione o di affinità tra il recettore [X] e il ligando [L]. La costante di dissociazione del complesso [LX], o costante Kd , è il parametro comunemente usato nelle metodiche di binding; essa rappresenta la concentrazione di ligando che occupa, all’equilibrio, il 50% dei recettori. Questa concentrazione risulta inversamente proporzionale all’affinità del ligando per il recettore: un aumento del valore della Kd comporta, infatti, una diminuizione dell’affinità.
L’equilibrio di formazione del complesso ligando-recettore può essere così rappresentato:
[L] + [X]
Kd
Ka
[LX]
All’equilibrio:
Ka ×[L] × [X] = Kd × [LX]
d a
K K ] X [ ] L [
] LX
[ =
×
La densità dei siti recettoriali viene definita come numero massimo di molecole capaci di legarsi nel tessuto, ed è indicata con Bmax; essa viene in genere espressa come fmol/mg di proteine che si ritrovano in un dato tessuto, e risulta correlata al numero di binding-site presenti.
Nella maggior parte dei tessuti la concentrazione dei recettori è dell’ordine delle fentomoli, o picomoli per milligrammo di tessuto umido; a causa di queste bassissime concentrazioni i ligandi impiegati nelle tecniche di binding devono possedere particolari requisiti, quali:
a) alta affinità, ovvero la costante di dissociazione del complesso ligando-recettore deve essere dello stesso ordine di grandezza della concentrazione recettoriale.
b) alta selettività: il ligando deve essere capace di legarsi ad un solo tipo di recettore, e non essere affine a componenti della membrana di tipo non recettoriale.
c) alta attività specifica, che permette di determinare accuratamente concentrazioni anche molto piccole, dell’ordine delle fentomoli.
Il binding assay prevede l’incubazione di una preparazione di membrane biologiche, che contiene il recettore oggetto di indagine, con un ligando marcato o con un isotopo radioattivo per un tempo necessario al raggiungimento dell’equilibrio del complesso [LX], in condizioni di pH e temperatura idonei.
Nel periodo di incubazione una parte del ligando [L] forma, con il recettore [X], il complesso ligando-recettore, mentre la quantità in eccesso di ligando, rimasto libero, verrà allontanato utilizzando la filtrazione sotto vuoto.
Affinché, durante questa procedura, non si abbia dissociazione del complesso, occorre operare velocemente ed impiegare un tampone freddo.
Il complesso [LX] viene trattenuto dal filtro, e la radioattività residua, associata al filtro, può essere misurata mediante uno scintillatore a fase liquida.
La quantità di radioligando che va a legarsi a strutture non specifiche, ovvero di tipo non recettoriale, è denominato legame aspecifico; questo viene determinato incubando la preparazione di membrane con il radioligando con un’alta concentrazione di una sostanza altamente specifica e selettiva per il sito recettoriale in esame.
L’alta concentrazione è necessaria perché si abbia la saturazione dei recettori, dato che la preparazione biologica ne presenta un numero finito. Questo ligando è definito appunto “spiazzante”, in ragione della sua competizione con il radioligando per il medesimo sito recettoriale e della sua capacità di allontanare quest’ultimo dal sito di legame.
La percentuale del legame o binding aspecifico deve essere bassa, e, in genere, non superare il 20-40% del legame totale, cioè del legame misurato in assenza dell’agente spiazzante.
Il legame specifico (Ls) del ligando in esame si ottiene dalla differenza tra il binding totale (LT) ed il binding aspecifico, rilevato in presenza dell’agente competitore (LA):
Ls = LT - LA
Fig. 2.1 Grafico dei legami totale, specifico e aspecifico del radioligando in una preparazione di membrane.
Dalla figura 2.1 possiamo notare che il binding specifico aumenta fino a raggiungere un plateau: infatti si tratta di un legame saturabile, poiché legato al numero finito di recettori.
Il legame aspecifico, invece, aumenta inaspettatamente in modo lineare all’aumento della concentrazione del ligando; esso è spesso definito come il binding misurato in presenza di una concentrazione di agente non marcato di 100-1000 volte il valore della Kd, in modo che risulti sempre in eccesso.
Leg.aspec.
Leg.spec.
Leg.tot
Radiolig. “libero”(nM)
2.2 Trasformazione lineare dei dati di binding in saturazione
2.2.1 Scatchard plot
Una delle trasformazioni lineari più usata per l’analisi dello studio di binding è lo Scatchard plot, che permette di calcolare l’affinità del ligando per il recettore dalla pendenza della retta e la densità recettoriale dall’intercetta della retta sull’asse delle ascisse (quando y=0).
Fig. 2.2.1 Scatchard Plot
Lo Scatchard plot viene costruito riportando sulle ordinate il rapporto [LX] / [L] e sulle ascisse la concentrazione del complesso ligando-recettore [LX], oppure, come di solito viene indicato, il Bound/Free, dove:
F = [L] = concentrazione radioligando libero
B = [LX] = complesso ligando-recettore all’equilibrio. L’equazione della retta è:
Se si ha a che fare con un ligando che interagisce con un’unica popolazione di binding sites che presenta un’unica affinità per quel ligando, la pendenza della retta è pari a – 1/Kd oppure a –Ka. La stima del numero massimo di binding-sites (Bmax) si ottiene
Bound(fmoli/mg prot.) Bmax/Kd
Pendenza = -1/Kd
Bmax SCATCHARD PLOT
d
d K
B B K F
B 1 max
× +
−
=
HILL PLOT
log [D]
dall’intercetta sull’asse delle ascisse, mentre l’intercetta sull’asse delle ordinate corrisponde al rapporto Bmax/Kd .
Nel caso in cui, come spesso accade, non sia possibile trasformare i dati di binding in un’equazione lineare, questi vengono trasformati in un plot curvilineo, che può essere concavo o convesso; in questo caso l’affinità del ligando per il recettore aumenta in modo proporzionale all’occupazione dei recettori stessi.
2.2.2 Hill Plot
L’Hill plot è un’altra trasformazione lineare dei dati di binding, spesso usata per stabilire se l’interazione tra recettore e ligando si verifica o meno con una semplice reazione bimolecolare.
In questo caso il grafico viene costruito riportando sull’asse delle ascisse il log[F], ovvero il logaritmo della concentrazione del ligando libero, e in ordinata il
B B log B
max − , dove B rappresenta il complesso ligando-recettore
Fig. 2.2.2 Hill Plot
Dalla pendenza della retta così ottenuta è possibile ricavare il “coefficiente di Hill” (nH ), il cui valore fornisce informazioni sul numero di siti di interazione recettoriale.
L’equazione di Hill può essere scritta in questo modo:
B B log B
max − = nH x log [F] + log K nH = numero di Hill K = costante
Nel grafico (fig. 2.2.2) si riporta sull’asse delle ordinate
B B log B
max − = 0 e sull’asse delle ascisse il log [F], che rappresenta il valore della Kd nel caso in cui nH sia uguale a 1.
Il significato del numero di Hill è il seguente:
se nH = 1 vuol dire che il ligando interagisce con una singola popolazione recettoriale mediante una reazione bimolecolare e reversibile che segue la legge di azione di massa;
oppure con più siti multipli con uguale affinità per L.
se nH < 1 c’è cooperatività negativa; esistono bindig sites multipli per un ligando non interagente; indica stati di affinità multipli.
se nH > 1 c’è cooperatività positiva tra i siti recettoriali
2.3 Determinazione della specificità di legame di radioligandi ai siti recettoriali
Attraverso l’uso di studi di competizione è possibile determinare la specificità attraverso cui il radioligando va ad interagire con i propri siti recettoriali.
La metodica prevede l’incubazione della preparazione di membrane con una concentrazione costante di radioligando [L], in presenza di concentrazioni crescenti di competitore non marcato [C]. I valori relativi al legame specifico del radioligando vengono riportati come percentuale di binding specifico in relazione al logaritmo della concentrazione dell’agente competitore (Fig. 2.3.1).
Dalla curva di competizione del ligando (che compete per il legame al sito recettoriale) è possibile determinare la concentrazione di competitore che, effettivamente, è in grado
Specificità del binding
Log. Competitore [C]
100
50
di inibire il 50% di legame specifico del radioligando; in questo modo possiamo quantificare la potenza del ligando.
Fig. 2.3.1 Determinazione della specificità di legame.
Attraverso un’analisi di regressione lineare è possibile calcolare tale concentrazione, che corrisponde all’IC50.
Con l’ausilio di un apposita tabella, le percenuali di inibizione del legame del radioligando sono poi trasformate in probabilità di inibizione, o PROBIT.
I valori ottenuti sono riportati in grafico sull’asse delle ordinate, mentre in ascissa si riportano le concentrazioni corrispondenti del competitore, in scala logaritmica, come mostrato dalla Fig. 2.3.2:
Fig. 2.3.2 Probit
LOG [C]
PROBIT
X = IC 50 5
x
Dall’equazione della retta che ne deriva viene ricavato il valore dell’IC50 , ovvero la concentrazione di competitore che induce una percentuale di inibizione pari al 50%; tale valore è poi trasformato in costante di inibizione del competitore (Ki) attraverso l’equazione di Cheng-Prusoff (1973):
+
=
d i
50 K
] L 1 [ K
IC
d 50 i
K ] L 1 [ K IC
= +
Ki = costante di inibizione L = concentrazione del radioligando
Kd = costante di dissociazione per il radioligando
2.4 Coltura di cellule CHO trasfettate con il cDNA codificante per i recettori adenosinici
Il materiale genetico che codifica per i sottotipi recettoriali dell’adenosina A1, A2A e A3
è ottenuto in quantità sufficienti da consentirne la clonazione, usando tecniche di biologia molecolare come la PCR (Polymerase Chain Reaction), che permette l’amplificazione selettiva di sequenze di DNA bersaglio.
Attualmente ciascuno di questi recettori è disponibile, in quanto trasfettato e stabilmente espresso in cellule CHO (Chinese Hamster Ovary), cioè cellule di ovaio di criceto.
La disponibilità di queste linee cellulari permette anche lo studio di recettori fisiologicamente poco espressi nell’uomo, come per esempio il recettore A3 dell’adenosina, grazie alla trasfezione, si possono ottenere elevati livelli di espressione (nell’ordine di una picomole di recettore per milligrammo di proteine di membrana).
Queste cellule si ottengono inserendo nelle originarie, un vettore plasmidico che, opportunamente modificato permetta, l’espressione del gene in esso contenuto.
I cDNA corrispondenti ai sottotipi recettoriali A1, A2A e A3 sono amplificati utilizzando la reazione polimerasica a catena, che sfrutta oligonucleotidi complementari alle estremità del gene e contenenti le sequenze specifiche riconosciute dagli enzimi di restrizione.
I prodotti di amplificazione così ottenuti vengono opportunamente purificati, e il successivo trattamento con enzimi di restrizione permette il loro inserimento nel vettore plasmidico.
Tale vettore, contenente la porzione di DNA codificante per il recettore di interesse, viene trasfettato stabilmente nelle cellule riceventi, cosicchè il DNA inserito viene integrato nel genoma cellulare determinando una iper-espressione della proteina codificata.
La coltura delle cellule CHO trasfettate è eseguita in piastre Petri, con mezzo di coltura
“Dulbecco’s Modified Eagles Medium” (DMEM/F12), al quale sono aggiunte sostanze nutritive ed antibiotici:
1. Siero fetale al 10% (Fetal Bovine Serum) 2. L-Glutammina (2 mM nel mezzo)
3. Penicillina (100 U/ml) 4. Streptomicina (100 µg/ml) 5. Geneticina (0.2 mg/ml)
Le cellule sono coltivate ad una temperatura di 37 °C, in atmosfera umidificata, contenente il 5% di CO2 .
Tutte le fasi della coltura vengono eseguite sotto cappa a flusso laminare, con sistema di sterilizzazione a raggi UV quando il flusso è interrotto e in assenza dell’operatore.
Le cellule CHO crescono aderenti al substrato delle piastre di coltura, fino ad occupare l’intera superficie disponibile: questo stadio viene definito “coltura confluente” (circa 1X105 cellule/cm2). Il tempo necessario per la duplicazione è di circa 24 ore.
Una volta raggiunto lo stadio di confluenza, la crescita cellulare si arresta, quindi si procede all’espansione della coltura mediante il processo di tripsinizzazione.
La tripsinizzazione è effettuata aggiungendo una soluzione di EDTA allo 0.2% e di Tripsina allo 0.5%. Questa soluzione provoca la chelazione di ioni Ca2+ e Mg2+, indispensabili per l’adesione delle cellule, ma anche la degradazione delle proteine della matrice, responsabili dell’adesione cellulare.
Le cellule sono quindi incubate per alcuni minuti a 37 °C, ed una volta ottenuto il distacco, viene aggiunto del terreno di coltura completo, contenente sia un eccesso di Ca2+, sia inibitori della Tripsina per neutralizzare l’azione lisante di quest’ultima.
Successivamente le cellule sono raccolte e centrifugate a 1000 g per 5 minuti a temperatura ambiente, il pellet cellulare ottenuto viene risospeso in una opportuna quantità di mezzo di coltura fresco e la sospensione cellulare seminata in nuove piastre Petri a cui è stata aggiunta una quantità di mezzo di coltura sufficiente a coprire il fondo.
2.5 Preparazione di membrane di cellule CHO trasfettate con i recettori A
1, A
2Ae A
3umani dell’adenosina
Quando le cellule CHO, descritte nel paragrafo precedente, arrivano a confluenza, si aspira il mezzo di coltura da ogni piastra, si fa un lavaggio con 3 ml di PBS (NaH2P4 9.1 mM e NaCl 150 mM a pH 7.4) e successivamente si aggiungono di 3 ml di un tampone ipotonico (Tris-HCl 10 mM e EDTA 2 mM a pH 7.4) per indurre il rigonfiamento e la lisi cellulare.
Le cellule, mantenute in ghiaccio, sono distaccate manualmente dal fondo della piastra mediante l’uso di uno “scraper” (una spatola di teflon); la sospensione cellulare è raccolta ed omogeneizzata usando un potter mantenuto a 4 °C, quindi trasferita in tubi da centrifuga e centrifugata a 48000 g per 20 minuti a 4 °C, in modo da separare attraverso le differenti capacità di precipitazione le membrane dalle altre componenti cellulari.
Dopo la centrifugazione viene allontanato il sovranatante, ed il pellet di membrane è risospeso in un tampone di legame appropriato:
- TA1 e TA2 (Tris-HCl 50 mM e MgCl2 2 mM a pH 7.4) per le cellule esprimenti i cDNA dei recettori adenosinici A1 e A2A;
- TA3 (Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, EDTA 1 mM a pH 7.4) per le cellule esprimenti i cDNA dei recettori adenosinici A3.
La sospensione così ottenuta viene raccolta ed aliquotata in crio-vials, congelate prima in azoto liquido e poi conservata a -80 °C.
2.6 Determinazione del contenuto proteico
Per determinare il contenuto totale di proteine presenti in un dato campione biologico, si usa il “Metodo colorimetrico di Bradford ” (1976), che impiega il reattivo commerciale Bio-Rad.
Piastre di Petri contenenti cellule CHO
Raccolta delle cellule distaccate nel potter
Omogeneizzazione
Raccolta in tubi da centrifuga e centrifugazione a 48000g 20’ a 4°C
Allontanamento del sovranatante
Risospensione del pellet in opportuno tampone
Aspirazione del mezzo Lavaggio con 3-4 ml di PBS
Aspirazione del PBS Aggiunta di 4 ml di tampone di lisi
Rimozione delle cellule con lo scraper
Schema della preparazione di membrane di CHO trasfettate con i recettori
Il saggio si basa sul cambiamento di colore del colorante Comassie Brillant Blue R-250, in risposta a diverse concentrazioni di proteine.
Il colorante Comassie Brillant Blue è capace di legarsi ai residui amminoacidici basici delle proteine (come arginina, istidina, lisina ecc.), formando un complesso di colorazione tendente al blu, la cui intensità, determinata dall’ assorbimento fotometrico nel visibile alla lunghezza d’onda di 595 nm è direttamente proporzionale alla concentrazione di proteine presente nel campione. Tale valore può essere ricavato in base alla Legge di Lambert e Beer:
A = ε c l
Dove A è l’Assorbanza, cioè la quantità di luce assorbita, c la concentrazione, l il cammino ottico ed ε il coefficiente di estinzione molare, caratteristico per ciascuna sostanza.
Per determinare il contenuto proteico di un campione è necessario determinare il coefficiente di proporzionalità tra assorbanza e concentrazione proteica, il quale si ottiene facendo reagire il reattivo Biorad con soluzioni di γ-globulina a concentrazioni note.
E’ necessario pesare 1 mg di γ-globulina, che viene poi disciolta in 1 ml di H2O (si ottiene così una soluzione 1 µg/µl). La soluzione ottenuta è diluita 1: 10 con H2O.
Si preparano 12 provette che contengono in doppio, rispettivamente il bianco e concentrazioni note crescenti di γ-globulina: 2.5, 5, 10, 15, 20 µg.
Si prosegue secondo lo schema seguente:
γ-globulina H2O Bio-Rad
B
/ 800 µl 200 µl
B’
1
25 µl ( 2.5 µg ) 775 µl 1’
2
50 µl ( 5 µg ) 750 µl 2’
3
100 µl ( 10 µg ) 700 µl 3’
4
150 µl ( 15 µg ) 650 µl 4’
5
200 µl ( 20 µg ) 600 µl 5’
Dopo aver allestito il saggio, si passa alla lettura dell’assorbanza con lo spettrofotometro nel campo del visibile (VIS), ad una lunghezza d’onda (λ) di 595 nm. I valori dell’assorbanza sono ottenuti sottraendo dalla lettura spettrofotometrica di ciascun campione il valore dell’assorbanza della prova in bianco.
L’equazione della retta di taratura per la γ-globulina è:
y = ax
Riportando sull’ asse delle ascisse le concentrazioni di γ-globulina e sulle ordinate i rispettivi valori di assorbanza si ottiene una retta il cui coefficiente angolare, corrisponde al coefficiente di estinzione molare del Reagente Biorad.
Per risalire alla concentrazione proteica di un campione incognito, si esegue il saggio dosando 20 µl di omogenato (diluito 1:5 in tampone di legame) a cui si aggiungono 780 µl di H2O , 200 µl di Bio-Rad, ottenendo un volume totale di 1 ml. In contemporanea si prepara una prova in bianco contenente soltanto una pari quantità di tampone di legame, così da poter determinare il contributo del tampone all’ assorbanza totale.
y = assorbanza
x = concentrazione proteica in µg
a = coefficiente di estinzione molare
Schema del dosaggio del contenuto proteico:
Tampone Membrane H2O Bio-Rad
B 20 µl / 780 µl 200 µl
B’ 20 µl / 780 µl 200 µl
M / 20 µl 780 µl 200 µl
M’ / 20 µl 780 µl 200 µl
L’assorbimento fotometrico misurato alla lunghezza d’onda di 595nm, debitamente sottratto del valore di assorbanza della prova in bianco, e diviso per il coefficiente angolare della retta di taratura e moltiplicato per il fattore di diluizione (nel nostro caso 5) determina la concentrazione delle proteine presenti nel campione di membrane.
2.7 Saggi di Binding su recettori A
1umani su membrane di cellule CHO trasfettate
Le membrane di cellule CHO trasfettate con il recettore A1 vengono scongelate, omogeneizzate con il potter. Il saggio è allestito in provette di plastica e in un volume finale di 500 µl.
25-30 µg di membrane vengono incubate, con:
• il tampone TA1(Tris-HCl 50 mM e MgCl2 2 mM a pH 7.4)
• una soluzione di ADA (Adenosina Deamminasi 0.2 UI/ml) che ha il compito di degradare l’adenosina endogena, così che non interferisca con il dosaggio.
• radioattivo [3H]DPCPX 3 nM nella prova.
• concentrazioni crescenti del composto da testare disciolto in DMSO, in modo da non superare la concentrazione del 2% nella prova.
Per determinare il legame totale, si prepara una prova, analoga alle precedenti, dove il volume del composto da testare è sostituito da una pari quantità di solvente.
Per determinare il legame aspecifico, viene impiegata come spiazzante , una soluzione di R-PIA in tampone TA1, 100 µM nella prova.
Ogni prova è condotta in doppio, secondo il seguente schema di dosaggio:
Tampone DMSO o composto
R-PIA (1mM)
ADA (2UI/ml)
Membrane (25-40µg)
[3H]DPCPX (30 nM)
M 400 µl 10 µl 20 µl 20 µl 50 µl
M’ 400 µl 10 µl 20 µl 20 µl 50 µl
MF 350 µl 10 µl 50 µl 20 µl 20 µl 50 µl
MF’ 350 µl 10 µl 50 µl 20 µl 20 µl 50 µl
C 400 µl 10 µl 20 µl 20 µl 50 µl
C’ 400 µl 10 µl 20 µl 20 µl 50 µl
Una volta allestito, il dosaggio viene lasciato in incubazione 3 ore a temperatura ambiente, in modo da raggiungere lo stato di equilibrio; si passa poi alla filtrazione, che prevede tre lavaggi con 4 ml di tampone TA1,
attraverso filtri Whatman GF/c di 2.5 cm di diametro, con apparato di filtrazione Millipore sottovuoto. Quest’ ultimi sono successivamente recuperati e trasferiti sul fondo vials a cui vengono aggiunti 4 ml di liquido di scintillazione Ultra Gold MW.
Per determinare la concentrazione esatta di radioattivo utilizzata nella prova, viene preparato un controllo, mettendo in una vial un volume di radioattivo uguale a quello usato nel saggio stesso.
Le vials sono quindi inserite in uno scintillatore di fase liquida, per il conteggio della radioattività dei campioni.
2.8 Saggi di Binding su recettori A
2Aumani su membrane di cellule CHO trasfettate
Le membrane di cellule CHO trasfettate con il recettore A2A vengono scongelate e omogeneizzate con il potter. Il saggio è allestito in provette di plastica e in un volume totale di 500 µl.
25-30 µg di membrane vengono incubate con :
• il tampone TA2 (Tris-HCl 50 mM e MgCl2 2 mM a pH 7.4)
• una soluzione di ADA (Adenosina Deamminasi 0.2 UI/ml)
• radioattivo [3H]NECA, 30 nM nella prova
• concentrazioni crescenti del composto da testare disciolto in DMSO, in modo da non superare la concentrazione del 2% nella prova.
Per determinare il legame aspecifico, viene impiegata come spiazzante, una soluzione di R-PIA in tampone TA2, 100 µM nella prova.
Ogni prova è condotta in doppio, secondo il seguente schema di dosaggio:
Tampone DMSO o composto
R-PIA (1 mM)
ADA (2UI/ml)
Membrane (25-40µg)
[3H]NECA (0.3 µM)
M 400 µl 10 µl 20 µl 20 µl 50 µl
M’ 400 µl 10 µl 20 µl 20 µl 50 µl
MF 350 µl 10 µl 50 µl 20 µl 20 µl 50 µl
MF’ 350 µl 10 µl 50 µl 20 µl 20 µl 50 µl
C 400 µl 10 µl 20 µl 20 µl 50 µl
C’ 400 µl 10 µl 20 µl 20 µl 50 µl
Una volta allestito, il dosaggio viene lasciato in incubazione 3 ore a temperatura ambiente, in modo da raggiungere lo stato di equilibrio; si passa poi alla filtrazione, che prevede tre lavaggi con 4 ml di tampone TA2. A questo punto,calcoliamo la radioattivita’ legata allo spettrofotometro, procedendo come descritto nel paragrafo precedente.
2.9 Saggi di Binding su recettori A
3umani su membrane di cellule CHO trasfettate
Le membrane di cellule CHO trasfettate con il recettore A3 vengono scongelate e omogeneizzate con il potter. Il saggio è allestito in provette di plastica e in un volume totale di 100 µl.
Circa 20 µg di membrane vengono incubate, con:
• il tampone TA3 (Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM e EDTA 1 mM a pH 7.4)
• una soluzione di ADA
• radioattivo [125I]AB-MECA 0.14 nM nella prova
• concentrazioni crescenti del composto
Per determinare il legame aspecifico, viene impiegata come spiazzante, una soluzione di R-PIA in tampone TA3, 100 µM nella prova.
Ogni prova è condotta in doppio, secondo il seguente schema di dosaggio:
Tampone DMSO o composto
R-PIA 500 µM
ADA (2UI/ml)
Membrane (20µg)
[125I]AB- MECA (1.4 nM)
M 40 µl 10 µl 20 µl 20 µl 10 µl
M’ 40 µl 10 µl 20 µl 20 µl 10 µl
MF 20 µl 10 µl 20 µl 20 µl 20 µl 10 µl
MF’ 20 µl 10 µl 20 µl 20 µl 20 µl 10 µl
C 40 µl 10 µl 20 µl 20 µl 10 µl
C’ 40 µl 10 µl
20 µl 20 µl 10 µl
Una volta allestito, il dosaggio viene lasciato in incubazione 90 minuti a temperatura ambiente, in modo da raggiungere lo stato di equilibrio; si passa poi alla filtrazione, che prevede tre lavaggi con 4 ml di tampone TA3.
I filtri sono successivamente recuperati e trasferiti sul fondo di provette di plastica da 5 ml.
Le provette sono quindi inserite in uno scintillatore γ-counter, per il conteggio della radioattività dei campioni
2.10 Saggio di valutazione della quantità di AMPc in cellule CHO
I livelli intracellulari di cAMP in cellule CHO esprimenti i sottotipi recettoriali A3 e A2B
sono misurati utilizzando il metodo competitivo della binding protein secondo quanto descritto da Nordstedt and Fredholm, 1990.
Per l’esecuzione del saggio, le cellule CHO che esprimono i recettori A3 e A2B sono staccate con tripsina, poi centrifugate e risospese nel mezzo di coltura, per poi essere seminate in multi-well da 24 pozzetti (circa 60.000 cellule/pozzetto), in 500 µl di mezzo completo.
Dopo 24 ore, il mezzo viene aspirato e le cellule vengono incubate a 37°C per 15 minuti con 400 µl di mezzo DMEM High Glucose privo di FBS, in presenza di un inibitore delle fosfodiesterasi, il Ro 20-1724 (20 µM), e adenosina deaminasi (1U/ml). Poichè il recettore adenosinico A3 è accoppiato a proteine Gi , per evidenziare l’ inibizione della produzione di cAMP da parte di un agonista (come standard viene utilizzata la Neca 100 nM) l’enzima adenilato ciclasi viene stimolato con un attivatore aspecifico, quale la Forskolina 10 µM; un composto avrà quindi un profilo antagonista nei confronti di tali recettori se sarà in grado di contrastare l’azione della Neca, ovvero la diminuzione della produzione di cAMP mediata dall’ agonista.
Il profilo antagonistico sui recettori A2B adenosinici, essendo accoppiati a Gs , è valutato andando a misurare la loro capacità di inibire l’ accumulo di cAMP, prodotto dall’ agonista Neca 100nM. Dal momento che non esiste radioligando per quest’ ultimi recettori, questo è l’ unico saggio che ci permette di valutarne l’ attività di un dato composto nei confronti del recettore A2B.
2.10.1 Schema dei pre-trattamenti e trattamenti per il recettoreA2B
Pozzetti
Pretrincub 15' a 37°C
Trattam
Basale
392µl + 8µl DMSO 100%
NECA da
sola
382µl +8µl DMSO 100% + 10µl
NECA
Compostoda solo
392µl + 8µl Comp
Composto
vs NECA
382µl
+8µl Comp + 10ul NECA
2.10.2 Schema dei pre-trattamenti e trattamenti per il recettore A3
Differenti concentrazioni di composto (1nM-10 µM) vengono incubate per 15 minuti a 37°C.
La reazione viene interrotta aspirando il mezzo ed aggiungendo HCl 0.4N.
Dopo 30 minuti, i lisati vengono neutralizzati con KOH 4N e le rispettive sospensioni centrifugate a 3000 rpm per 5 minuti.
Per determinare la produzione di cAMP, viene allestito un saggio di binding con la binding protein, isolata dal surrene bovino, diluita in tampone High Salt Buffer (Trizma base 100mM, NaCl 100mM, EDTA 10mM e B-mercaptoetanolo 7.5 mM pH 7.4), [3H]cAMP (2nM) e 50 µl del lisato per un totale di 300 µl e incubato a 4°C per 150 minuti.
L’cAMP, contenuto nei lisati cellulari, andrà a competere con il radioattivo triziato per il legame alla binding protein.
Pozzetti
Pretrincub 15' a 37°C
Trattam
Basale
382µl + 8µl DMSO 100%
FK
382µl + 8µl DMSO 100% + 10µl FK
Composto
da solo
382µl 10µl FK + 8µl Comp
NECA
372µl +8µl DMSO 100% + 10µl FK
+ 10µl NECA
Compostovs NECA
372µl 10µl FK + 8µl Comp + 10µl
NECA
SCHEMA DEL SAGGIO DI BINDING
Acqua Lisato Binding
protein 1:80
(3H)cAMP
1) M
50µl
---200µl 50µl
2) M'
50µl
---200µl 50µl
3) MF
250µl
--- ---50µl
4) MF'
250µl
--- ---50µl
5) Basale ---
50µl 200µl 50µl
6) Basale' ---
50µl 200µl 50µl
7) FK ---
50µl 200µl 50µl
8) FK' ---
50µl 200µl 50µl
9) cAMP --- ---
200µl 50µl
10) --- ---
200µl 50µl
11) --- ---
200µl 50µl
12) --- ---
200µl 50µl
Al termine del periodo di incubazione si procede con la filtrazione, effettuando due lavaggi con 4 ml di tampone (Tris/HCL 50 mM pH 7.4) sui filtri Whatman GF/c di 2.5 cm di diametro, opportunamente posizionati sull’apparato di filtrazione Millipore sottovuoto.
I filtri sono successivamente recuperati e trasferiti sul fondo di vials a cui vengono aggiunti 4 ml di liquido di scintillazione Ultra Gold MW.
Le vials sono quindi inserite in uno scintillatore di fase liquida, per il conteggio della radioattività dei campioni: le percentuali di legame ottenute dal saggio di binding sono utilizzate per risalire alle pmoli di cAMP prodotte utilizzando una curva standard; tale curva è stata precedentemente ottenuta incubando concentrazioni note e crescenti di cAMP freddo (0.625nM;1.25nM; 2.5nM; 5nM; 10nM; 20nM; 40nM; 80nM; 160nM) con il radioligando triziato (Fig. 2.10.1)
-16 -15 -14 -13 -12 -11 -10 0
25 50 75 100
log [mol cAMP]
% legame
Fig. 2.10.1 Curva standard dell’ AMPc
2.11 Saggio di valutazione della proliferazione cellulare
Le cellule di glioblastoma umano (U87MG) vengono impiegate in questo saggio in vitro, per valutare l’attività farmacologica degli antagonisti A3 sulla proliferazione cellulare.
Le cellule vengono fatte crescere in fiasche, mantenute con il mezzo di coltura completo (RPMI 1640 con aggiunta di siero fetale al 10% Fetal Bovine Serum, L-Glutammina 2 mM, Penicillina 100 U/ml, Streptomicina 100 µg/ml), e successivamente seminate in multi-well da 24 (circa 5000 cellule per pozzetto).
Le cellule vengono lasciate in incubazione a 37°C per 24 ore, dopodiché viene cambiato il mezzo, questa volta addizionato con FBS allo 0.5%, concentrazione tale da bloccare le cellule in fase G1.
Dopo 48 ore il mezzo viene aspirato, e le cellule vengono trattate con l’agonista A3 Cl IB-MECA (in grado da sola di stimolare la proliferazione cellulare) in assenza o in presenza dell’ agonista.
Passate 48 h, viene fatta una conta delle cellule totali (vive e morte) utilizzando il saggio del Trypan blue.
Il Trypan blue è un colorante che permea all’ interno delle cellule necrotiche attraverso la loro membrana cellulare danneggiata, conferendo loro una caratteristica colorazione blu; le cellule vive, al contrario, avendo membrana integra, rimangono inalterate al microscopio.
Per l’esecuzione del saggio, il mezzo in cui sono stati eseguiti i trattamenti viene raccolto e messo in eppendorf da 2 ml insieme alle cellule precedentemente staccate con la Tripsina.
La sospensione viene centrifugata a circa 3.000 g per 5 minuti, il sovranatante viene scartato, ed il pellet rimasto, sospeso in 1 ml di mezzo; 100µl di tale sospensione vengono addizionati a 20µl di Trypan Blue allo 0.4%; una aliquota di questa sospensione, pari a 10µl, viene inserita nella camera di Burcker per la conta al microscopio delle cellule vive, che non avranno assunto la colorazione, e di quelle morte, colorate in blu.
