UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA
FACOLTÀ DI AGRARIA
Dipartimento di Agronomia Ambientale e Produzioni vegetali
TESI DI LAUREA IN BIOTECNOLOGIE AGRARIE
GENOTIPIZZAZIONE DI LINEE MUTANTI PER
EPIREGOLATORI IN MAIS
Relatore: Prof.ssa Serena Varotto
Dipartimento di Agronomia Ambientale e Produzioni Vegetali
Correlatore: Dott. Cristian Forestan
Dipartimento di Agronomia Ambientale e Produzioni Vegetali
Laureando: Diego Cavalli
Matricola n.: 561181
Per mamma e papà, la mia famiglia,
INDICE
1. ABSTRACT……….. 1
2. INTRODUZIONE……… 5
2.1 PATHWAY E MECCANISMI EPIGENETICI………... 5
2.2
LA REGOLAZIONE EPIGENETICA DEI TRANSGENI... 14
2.3 EPIGENETICA E TRASPOSONI……… 15
2.4 EPIGENETICA E SVILUPPO FLC………. 18
3. SCOPO DELLA TESI………... 19
4. MATERIALI E METODI………. 23
4.1 MATERIALE VEGETALE……….. 23
4.2 ESTRAZIONE DNA GENOMICO………... 23
4.3 PCR E DISEGNO DEI PRIMERS……… 24
4.4 MUTANTI INSERZIONALI E PRIMERS……….. 27
4.5 CORSA ELETTROFORETICA……… 29
5. RISULTATI E DISCUSSIONI………. 31
5.1 PRODUZIONE DI MUTANTI PER EPIREGOLATORI……….. 31
5.2 MESSA A PUNTO DI UN PROTOCOLLO DI STRESS TERMICO…... 40
6. CONCLUSIONI E PROSPETTIVE FUTURE………... 49
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1.
ABSTRACT
In the last years, it has been proved that epigenetic modifications such as DNA methylation, production of sRNAs, modification of histone tails and the presence of histone variants may act to alter the level of chromatin condensation, regulating gene expression in spatially and temporally way. These epigenetic mechanisms act together to fine regulate gene expression in plants and mammals, especially in response to environmental factors. Studing the mechanisms and the processes that lead to the formation and propagation of epialleles in maize is the subject of the research project in which this thesis is inserted and of this thesis as well. In particular we are interested in understanding how environmental stresses can alter epigenetic regulation of gene expression, leading to the formation of stable, inheritable epialleles. The final goal of the project would be the use of this stress-induced epigenetic variability in new breeding program in maize. To do this we are producing mutants for different epigenetic regulators (epi-regulators) and we are setting up different stress protocols in maize to identify new epitargets, that are genes induced by stress and regulated epigenetically. Insertional mutant lines used were obtained by crossing a wild-type maize line with pollen derived from a line in which the Mu transposon resulting in a hybrid background. It is therefore necessary to backcross this mutant lines with the B73 wild type inbred line several times (at least five) to introgress the mutations in this reference background. B73 in indeed the maize inbred line for which the genome has been completely sequenced, and only after the completion of the introgression the mutant plants will be selfed twice to obtain homozygous mutants.
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On the other hand, in the thesis second part a temperature shift protocol for maize has been developed based on on the results recently obtained in Arabidopsis thaliana. We showed that in maize a heat-shift stress, in this case the plants were subjected to a period of 8 days of growth at 15 °C and then transferred to 42 °C for 2 days is able to release the epigenetic silencing of an transgenic silenced reporter lines, suggesting that this stress is able to induce epigenetic modification.
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RIASSUNTO
Negli ultimi anni è stato chiaramente dimostrato che modificazioni epigenetiche quali la metilazione del DNA, le modificazioni delle code istoniche e la presenza di varianti istoniche possono agire a livello della cromatina per alterare e regolare spazialmente e temporalmente l’espressione genica e di conseguenza controllare molto finemente lo sviluppo degli organismi superiori, specialmente in risposta a fattori ambientali. Lo studio della formazione e della propagazione di epialleli in mais è l’oggetto del progetto di ricerca all’interno del quale si è inserito questo lavoro di tesi.
Lo scopo di questo lavoro è di identificare nuovi epitarget, ovvero quei geni indotti da stress e regolati epigeneticamente, su piante sottoposte a diversi stress ambientali e su mutanti per epiregolatori.
Le linee mutanti inserzionali utilizzate sono state ottenute attraverso l’incrocio di una linea di mais wild-type con polline derivante da una linea in cui il trasposone Mu ottenendo così un background ibrido. È stato quindi necessario effettuare dei reincroci con la linea B73, in quanto il genoma di questa linea è stato completamente sequenziato, prima di passare all’autofecondazione per ottenere la mutazione in stato di omozigosi. La prima parte della tesi consiste nel seguire il backcross su 4 linee mutanti per diversi epiregolatori procedendo all’estrazione di DNA e all’applicazione della PCR (Polymerase Chain Reaction) per identificare le piante che portano la mutazione inserzionale. Per effettuare la reazione di PCR è stato utilizzato un primer universale disegnato sulle sequenze terminali invertite e ripetute (TIR) del trasposone in combinazione con uno o più primers gene-specifici consentendo di ottenere amplificazione del frammento di interesse solo dalle piante mutanti.
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2.
INTRODUZIONE
L’epigenetica viene definita come lo studio dei cambiamenti della regolazione genica e fenotipici che non dipendono da modificazioni nella sequenza primaria del DNA. Negli ultimi anni è infatti stato chiaramente dimostrato che modificazioni epigenetiche quali la metilazione del DNA, le modificazioni delle code istoniche e la presenza di varianti istoniche possono agire a livello della cromatina per alterare e regolare spazialmente e temporalmente l’espressione genica e di conseguenza controllare molto finemente lo sviluppo degli organismi superiori, specialmente in risposta a fattori ambientali. Queste modifiche reversibili possono essere transienti, in risposta a stimoli ambientali o al programma di sviluppo intrinseco di ogni individuo e quindi non avere nessun impatto dal punto di vista evoluzionistico. Al contrario è stato dimostrato che alcune modifiche epigenetiche possono essere ereditate attraverso la mitosi e la meiosi, portando quindi alla creazione di nuova variabilità genetica che può essere trasmessa alla progenie. La formazione di epialleli che rimangono stabili nella progenie per numerose generazioni può rappresentare una fonte importante di variabilità utilizzabile per nuovi programmi di miglioramento genetico delle piante di interesse agrario. Questo, ovvero lo studio della formazione e della ereditabilità di epialleli in mais, una pianta importantissima a livello mondiale, è l’oggetto del progetto di ricerca all’interno del quale si è inserito questo lavoro di tesi. In particolare il progetto si propone di esplorare i meccanismi che portano alla creazione di nuova variabilità epigenetica per poterla utilizzare in programmi di miglioramento genetico volti ad aumentare la resistenza di questa coltura a stress ambientali.
2.1 PATHWAY E MECCANISMI EPIGENETICI
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Il pathway autonomo comprende geni e prodotti genici inizialmente identificati perché coinvolti nella regolazione della fioritura della pianta modello Arabidopsis thaliana (Bob B. Buchanan et al, 2003). In Arabidopsis l’induzione alla fioritura è regolata dal silenziamento epigenetico dell’espressione del gene FLC (flowering locus C) che funge da regolatore negativo dell’induzione a fiore. I geni del pathway autonomo, assieme all’influenza di fattori ambientali (luce e freddo in primis) e ormonali, portano al silenziamento di FLC permettendo l’induzione a fiore (Bob B. Buchanan et al, 2003).
Il pathway di metilazione delle citosine è invece responsabile del silenziamento trascrizionale delle regioni eterocromatiche e degli elementi trasponibili. Mediante l’azione di metiltransferasi vengono legati covalentemente gruppi metilici alle citosine del DNA (Zhang, 2010).La metilazione delle citosine , interferendo con i complessi proteici che effettuano la trascrizione, causa il silenziamento dell’espressione dei geni (Fig.1).
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(Zhang, 2010)
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CLASSIFICAZIONE GENE SPECIE FUNZIONE
MET1 AtMET1 NtMET1 OsMET1-1 OsMET1-2 ZmMet1 A. thaliana Nicotiana tabacum O. sativa O. sativa Zea mays Mantenimento Mantenimento Mantenimento Mantenimento Mantenimento CMT AtCMT3 OsCMTL OsMET2a ZMET2 ZMET5 A. thaliana O. sativa O. sativa Zea mays Zea mays Mantenimento Enzima putativo, funzione sconosciuta Enzima putativo, funzione sconosciuta Probabile mantenimento Probabile mantenimento DRM AtDRM1 AtDRM2 NtDRM1 ZMET3 A. thaliana A. thaliana N tabacum Zea mays De novo, mantenimento De novo, mantenimento De novo Enzima putativo, funzione sconosciuta (Zhang, 2010)
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Fig 2.2: Meccanismo di azione degli siRNA. I dsRNA di partenza vengono tagliati dall’enzima DICER in frammenti più piccoli (20-25 nt) ed il filamento antisenso risultante si lega al complesso RISC. Se l’appaiamento di questo complesso con l’mRNA risulta perfetto viene effettuato un taglio da una componente di RISC ed i frammenti vengono degradati dalle RNAsi.
I meccanismi epigenetici, come il pathway di metilazione ed il pathway autonomo, influenzano l’espressione genica anche agendo direttamente a livello della cromatina, o meglio, sullo stato di condensazione della cromatina, costituita da DNA associato a proteine istoniche e non istoniche e principale componente del nucleo della celluala eucariote..
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13 MODIFICAZIONE della CROMATINA TIPOLOGIA della MODIFICAZIONE AZIONE SU: MECCANISMO RISULTATO nella TRASCRIZIONE Modificazioni Istoniche Ubiquitinazione Metilazione Acetilazione Fosforilazione Lisine Lisine, Arginine Lisine Serine, treonine Modifica la distanza degli istoni dal DNA.
Recluta altri regolatori della cromatina Neutralizzazione di carica e reclutamento di regolatori della cromatina Attivazione (H2A) o repressione (H2B) Attivazione (H3K4) o repressione (H3K9) Attivazione Romodellamento della cromatina SWI/SNF SWR1 Nucleosoma Istoni Modificazione dell’ottamero istonico Incorporazione della variante istonica H2A.Z Attivazione o repressione Attivazione Metilazione del DNA CG e non-CG CG Promotori Geni (da 5’ a 3’) Inibizione della trascrizione Modifica la lunghezza del trascritto Repressione Repressione Current Opinion in Plant Biology 2007
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Si è potuto osservare che particolari stress o situazioni ambientali possono portare ad una modifica dello stato condensato di eterocromatina causando la trascrizione dei geni situati in questa regione (M. Tittel-Elmer, 2010). Questo è stato possibile sottoponendo Arabidopsis a vari stress abiotici. Questi stress agiscono principalmente sullo stato di metilazione del DNA e sull’acetilazione degli istoni portando così l’eterocromatina ad uno stato più rilassato e trascrizionalmente attivo. Tuttavia queste modifiche sono prevalentemente transitorie e vengono perdute poco dopo il ritorno alla condizione non stressante.
2.2 LA REGOLAZIONE EPIGENETICA DEI TRANSGENI
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Fig.2.3: Esperimento effettuato su petunia per la sovrapproduzione di pigmento, la presenza del transgene porta ad un fenomeno di cosoppressione in cui non solo vengono silenziati i transgeni ma anche i geni endogeni addetti alla pigmentazione. Questo fenomeno porta strani effetti sulla pigmentazione o ad una totale mancanza di pigmento con la produzione di fiori bianchi.
2.3 EPIGENETICA E TRASPOSONI
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Fig.2.4: Movimento dei trasposoni mediante escissione ed inserzione
Il secondo tipo implica la replicazione del DNA dell’elemento trasponibile. Una proteina, la trasposasi, codificata dall’elemento stesso, funge da mediatore nell’inserzione tra l’elemento e il potenziale sito d’inserzione. Durante questa interazione, l’elemento si replica, una copia di questo si inserisce nel nuovo sito mentre l’altra rimane nel sito originario.
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Il terzo tipo prevede che la trasposizione venga mediata da una trascrittasi inversa. Quest’enzima usa l’RNA dell’elemento come stampo per sintetizzare le molecole di DNA (Fig.1.6) che vengono così inserite in nuovi siti cromosomici (Snustad et al., 2010).
Fig.2.6: Movimento dei trasposoni mediante il meccanismo dell’integrazione mediante cDNA. Mediante la trscrittasi inversa viene sintetizzato un nuovo mRNA che, a sua volta, porta alla formazione di molecole di cDNA che vengono inserite nei nuovi siti cromosomici.
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2.4 EPIGENETICA E SVILUPPO FLC
Come citato precedentemente, l’espressione del gene FLC è particolarmente influenzata dagli stimoli ambientali. Un fattore molto importante per l’entrata in fioritura è la vernalizzazione, ovvero l’esposizione della pianta a periodi di freddo prolungati (Bob B. Buchanan, 2003). Mediante esperimenti effettuati su Arabidopsis si è potuto osservare che un trattamento prolungato a basse temperature comporta un ritardo della fioritura della pianta, poiché questo tipo di trattamento stimola l’espressione di determinati geni che portano ad una sovraespressione di FLC. Nel caso specifico si hanno dei cambiamenti epigenetici che comportano l’espressione di frigida (FRI), questo perché la vernalizzazione porta ad una demetilazione delle citosine rendendo FRI accessibile alla trascrizione. La trascrizione di FRI porta alla conseguente trascrizione di FLC e quindi il ritardo nella fioritura.
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3.
SCOPO DELLA TESI
Nell’ambito del progetto AENEAS, finanziato dall’Unione Europea, il nostro gruppo di ricerca è particolarmente interessato ad analizzare quei meccanismi che portano alla formazione di epialleli che possono rimanere stabili nella progenie poiché rappresentano un’importante fonte di variabilità, utilizzabile nei programmi di miglioramento genetico.
Lo studio dell’ereditabilità di epialleli viene svolto in parallelo in Arabidopsis thaliana e Zea mays mediante particolari tecniche che permettono di trovare geni indotti da stress e regolati epigeneticamente, definiti EPITARGET. Queste tecniche si basano sull’analisi del trascrittoma mediante mRNA-Seq (sequenziamento di RNA messaggero); l’analisi della metilazione del DNA mediante BIS-Seq, ovvero il sequenziamento del DNA in seguito a conversione con Bisolfito; l’analisi delle modificazioni istoniche attraverso ChiP-Seq che consiste nell’identificazioni delle regioni genomiche che portano determinate modificazioni della cromatina attraverso precipitazione della cromatina con specifici anticorpi che riconosco determinate modificazioni e il conseguente sequenziamento; e l’analisi dei miRNA con la tecnica sRNA-Seq che consiste nel sequenziamento degli small-RNA.
Inizialmente questi epitarget verranno individuati in piante sottoposte a stress da freddo, quindi questo progetto di tesi si propone di validare questi epitarget su piante sottoposte a ulteriori differenti stress ambientali e su mutanti per epiregolatori.
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Fig.3.1: Descrizione delle linee con mutanti inserzionali. Una linea wild tipe viene incrociata con una linea contenente il trasposone Mu attivo, la successiva linea F1 viene poi autofecondata per avere una popolazione di partenza uniforme. La linea F2 derivante viene poi incrociata con la linea B73 in modo da poter lavorare con un genoma di riferimento già sequenziato. Ovviamente in tutti questi incroci verranno selezionate le piante che porteranno la mutazione inserzionale. Dopo 5 reincroci con la linea B73 si otterrà una linea BC che verrà auto fecondata per 2 cicli per portare la mutazione ad uno stato di omozigosi.
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omozigosi. Durante tutti questi incroci è necessario seguire la segregazione della mutazione attraverso la genotipizzazione di ogni singolo individuo secondo un protocollo che prevede l’utilizzo della reazione a catena della polimerasi. Seguire il backcross su 4 linee mutanti per diversi epiregolatori è stato uno dei primi obiettivi della tesi, procedendo all’estrazione di DNA e all’applicazione della PCR per identificare tra le piante sorelle quelle che portano l’inserzione del trasposone Mu nel gene di interesse.
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4. MATERIALI E METODI
4.1 MATERIALE VEGETALE
Le estrazioni di DNA sono state eseguite a partire da foglie di piante di mais. Per quanto riguarda i mutanti CHR120, HDA108, FPA, DMT101 e AGO5, la company che ci ha fornito le cariossidi è la Biogemma. Le piante sono state coltivate in campo o in serra con aggiunta di luce artificiale quando necessario.
4.2 ESTRAZIONE DNA GENOMICO
Il DNA genomico dei vari mutanti utilizzato per le reazioni di PCR per il genotyping è stato estratto utilizzando una soluzione di lisi (microLYSIS®-PLUS - Microzone Ltd). Questa soluzione di lisi consente il rilascio di una piccola quantità di DNA genomico (non purificato) da una minima quantità di tessuto vegetale. Il protocollo è il seguente:
• Raccogliere una sezione di 2x1 mm della foglia più giovane della pianta e trasferirla in microamp;
• Aggiungere 20µl di soluzione di microlisi e cercare, per quanto possibile, di distruggere con l’aiuto di un puntale la sezione di foglia; • Porre i campioni in termociclatore dove rimarranno overnight a 65°C; • Il giorno seguente impostare il termociclatore per i seguenti step:
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Attraverso questo ciclo termico il DNA genomico viene rilasciato in soluzione ed è pronto per una eventuale PCR. Data la bassa resa di questa estrazione è inutile controllarlo attraverso elettroforesi.
4.3 PCR E DISEGNO DEI PRIMERS
La Reazione a Catena della Polimerasi o PCR è una tecnica che permette l’amplificazione esponenziale di frammenti di DNA sfruttando la capacità di sintesi del DNA dell’enzima DNA polimerasi che permette una duplicazione di tipo semiconservativa. Questo enzima infatti è in grado di sintetizzare copie multiple di una sequenza specifica di DNA racchiusa tra due brevi tratti di sequenza nota, su cui sono stati disegnati degli inneschi (primers) specifici. La PCR prevede l’alternarsi ciclica di tre fasi:
• Denaturation: fase di denaturazione della doppia elica di DNA a 94/95 °C per 30/60”;
• Annealing: fase in cui i primers si attaccano alle due estremità del frammento da amplificare. Normalmente viene condotta a 55/60° C a seconda del contenuti in G-C deiprimers, per 30/60”;
• Extension: fase in cui la DNA polimerasi sintetizza i nuovi filamenti di DNA.
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9700 Applied Biosystems) in cui impostare tempi e temperature che devono essere applicati alla miscela la cui composizione può variare a seconda delle diverse applicazioni specifiche. Il termociclatore solitamente viene impostato nella seguente maniera:
1. 95°C per 5’ 2. 95°C per 1’
3. 58-60°C per 30” I cicli vengono ripetuti circa 35-40 volte 4. 72°C per 1’-3’
5. 72°C per 12’ 6. 4°C
Solitamente la PCR viene condotta per circa 35-40 cicli, alla fine dei quali normalmente si ottengono più di un miliardo di copie del tratto di DNA di interesse compreso tra i due primer forward e reverse. Il mix tipico di una reazione di PCR è composto da:
• Buffer di reazione: specifico per ogni enzima e un mix di sali e ha la funzione di mantenere il pH ideale per il funzionamento della Taq. • MgCl2 o MgSO4 : lo ione Mg2+ è un cofattore necessario per il
corretto funzionamento della polimerasi, inoltre influenza la specificità dei primers e favorisce l’inserimento dei dNTPs. È importante dosare correttamente la quantità di Mg2+ in quanto un eccesso di questo cofattore rende molto aspecifica l’attività della polimerasi.
• dNTPs: sono i mattoni da costruzione per la sintesi del filamento di DNA.
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• Additivi per PCR: sono sostanze eterogenee per natura (DMSO, Betaine, etc) con la comune capacità di destabilizzare i filamenti del DNA rendendo più facile la denaturazione di regioni ricche in GC che tendono a formare strutture secondarie molto stabili o rendendo più specifico l’attacco dei primers.
CONCENTRAZIONE NEL MIX: CONCENTRAZIONE NEL MIX Buffer 10X (Invitrogen) 1X 5 µL MgCl2 25 mM 1,5/2,5 mM 3/5 µL Primer Fw 10µM 0,4µM 2 µL Primer Rev 10µM 0,4µM 2 µL dNTPs mix 10mM 200 µM 1 µL
DNA stampo 50/100ng Variabile
Taq polimerasi (5U/µl) 2,5 unità 0,5 µL
H2O sterile / A volume
Le dimensioni dei frammenti amplificati vengono controllate tramite elettroforesi su gel d’agarosio come descritto successivamente. Qualora la PCR non avesse dato i risultati attesi, sono state modificate le condizioni standard cercando di aumentare la resa o la specificità della reazione a seconda delle necessità. In particolare per ottimizzare i risultati siamo andati ad agire sulle seguenti variabili:
• la concentrazione di MgCl2 che può rendere più o meno specifica l’ amplificazione;
• la quantità di DNA di partenza;
• la temperatura di annealing che influenza la specificità di attacco dei primers;
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• il numero di cicli per aumentare o ridurre il numero di frammenti sintetizzati;
• il tipo di DNA polimerasi che può essere più adatta a templati difficili o lunghi.
Nella maggior parte delle reazioni di PCR è stata usata la Taq DNA Polymerase (Invitrogen).
4.4 MUTANTI INSERZIONALI E PRIMERS
Come accennato nel capitolo introduttivo, il tipo di trasposizione molto diffusa nei vegetali è la trasposizione mediante l’escissione dell’elemento e la sua successiva inserzione in un’altra posizione. Successivamente alla scoperta di Barbara McClintock sono stati scoperti ed identificati molti trasposoni in mais e uno di questi è il trasposone Mu (Mutator). Questo trasposone, identificato nel 1978, codifica per una trasposasi che riconoscono l’elemento Mu a livello delle due estremità terminali ripetute ed invertite (TIR) di circa 220bp (Fig4.1).
Fig.4.1: struttura generale di un trasposone dove a fianco si trovano le sequenze TIR (estremità invertite e ripetute).
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causate da questo elemento trasponibile sono ereditabili (Lisch D et al., 1995; China F. Lunde et al., 2003).
Fig 4.2: Inserzione del gene Mu all’interno di sequenze codificanti, causando così mutagenesi casuale.
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Fig.4.3: Il primer forward (Fw) ed il primer reverse (Rev) sono quei primer gene-specifici che servono per individuare eventuali inserzio
Questo approccio è limitato dalla conoscenza delle sequenze del trasposone, ma è molto più veloce e attendibile del primo. Diverse organizzazioni e aziende private hanno sviluppato negli anni vaste collezioni di mutanti Mu e queste sono uno strumento molto utile per studi sulla funzione dei geni e per progetti di genomica. Tra queste anche l’azienda BIOGEMMA, partner del progetto AENEAS ha prodotto una serie di mutanti inserzionali per diversi epiregolatori in mais. L’inserzione all’interno dei geni di interesse è stata verificata dalla company stessa che ha poi provveduto al primo re-incrocio della pianta mutante con la linea inbreed B73 per l’introgressione della mutazione in questo background genetico. Questa introgressione deve essere condotta per almeno 5 cicli di re-incrocio ed a ogni incrocio nella progenie bisogna identificare le piante che portano la mutazione da quelle invece wt. A questo scopo sono state condotte delle PCR utilizzando un primer specifico sulla sequenza del gene epiregolatore e un primer sulla sequenza delle regioni TIR del trasposone. Le sequenze dei suddetti primers non possono essere riportate in quanto di proprietà dell’azienda (BIOGEMMA) che ha prodotto i mutanti stessi.
4.5 CORSA ELETTROFORETICA
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5.
RISULTATI E DISCUSSIONI
5.1
PRODUZIONE DI MUTANTI PER EPIREGOLATORI
In questo progetto di tesi si è lavorato alla produzione di diverse linee si mais contenenti ciascuna una specifica mutazione inserzionale causata dall’inserzione del trasposone Mu. Nel caso specifico vi sono 5 linee di piante mutanti inserzionali per i seguenti geni:
• DMT101 (DNA metiltransferasi), responsabile dell’attivazione del pathway di metilazione (Garcia-Aguilar, 2010);
• CHR120, gene indirettamente responsabile del mantenimento del silenziamento delle sequenze metilate;
• HDA108, il quale codifica una deacetilasi istonica (Pfluger, 2007);
• AGO5 coinvolto nel silenziamento genico mediante sRNA (Zhang, 2010); • FPA appartenente al il pathway autonomo e coinvolto nel processamento degli
RNA messaggeri di molti geni target (Greenup, 2009 ).
Queste linee mutanti prodotte attraverso mutagenesi inserzionale sfruttando le capacità inserzionali del traspone Mu devono essere introgredite più volte nel background genetico della linea B73 prima di poter iniziare una caratterizzazione fenotipica e molecolare dei diversi mutanti. Ad ogni ciclo di introgressione attraverso backcross sulla linea B73 è quindi necessario procedere all’identificazione delle piante che portano la mutazione in stato di eterozigosi. A questo scopo si è proceduto ad un genotyping molecolare sulle piante di ciascuna linea sfruttando la tecnica della PCR. Un primer universale disegnato sulle sequenze terminali invertite e ripetute del trasposone è stato utilizzato in combinazione con uno o più primers gene-specifici consentendo di ottenere amplificazione del frammento di interesse solo dalle piante mutanti. Queste piante sono state selezionate e successivamente re-incrociate con la linea B73.
32 DMT101
Fig.5.1: Rappresentazione dei gene DMT101 di mais. Due loci codificanti per l’ortologo di MET1 di Arabidopsis si trovano invertiti e ripetuti a distanza di circa 20kb. Il trasposone si è inserito circa a metà della regione intergenica e potrebbe essere in grado di silenziare entrambe le copie del gene (o nessuna delle due).
Fig.5.2: Fotografia del gel risultante della corsa elettroforetica. Nel cerchio viene evidenziata la banda che conferma l’inserzione della mutazione.
33 CHR120
34
35
36 HDA108
37
Fig.5.6: Foto del gel elettroforetico in cui vengono indicate le bande che indicano la presenza del trasposone. Con i punti di domanda sono indicate le bande di difficile lettura.
38 AGO5
Fig.5.7: Schema rappresentante il gene AGO5 coinvolto nel meccanismo di
silenziamento genico mediante sRNA. L’inserzione del trasposone avviene all’interno del primo esone del gene vicino all’ATG.
Fig.5.8: Gel risultante dalla corsa elettroforetica. Nell’immagine sono evidenziate le bande che rappresentano l’inserzione della mutazione. Come nei casi precedenti i punti di domanda si riferiscono a delle bande di cui non si è certi della presenza a causa della difficile lettura.
I campioni sono stati numerati in ordine progressivo da 1 a 20 di cui 3 (il numero 6, 8 e 13) risultano positivi, come rappresentato in figura 5.8.
AGO5-like H1283
20880 bp
ATG
STOP
39 FPA
Fig.5.9: schema del gene FPA implicato nella fioritura della pianta. L’inserzione del trasposone è avvenuta nel primo introne del gene.
Fig.5.10: Foto del gel elettroforetico riguardante il gene FPA. Nei cerchi rossi sono evidenziate le bande di amplificazione che determinano la positività dell’inserzione del trasposone.
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5.2 MESSA A PUNTO DI UN PROTOCOLLO DI STRESS
TERMICO
Nella seconda parte della tesi abbiamo lavorato alla messa a punto di un protocollo di stress termico sulla base delle indicazioni derivanti da Arabidopsis thaliana da altri gruppi partecipanti al progetto AENEAS. In questa parte di progetto infatti diversi stress ambientali vengono utilizzati per indurre la formazione di epialleli e per la successiva analisi della loro propagazione nella progenie. Questi stress verranno applicati sia alla linea wild type B73 sia alle piante mutanti per i diversi epiregolatori che saranno ottenute alla fine del programma di backcross. Un recente lavoro pubblicato da un gruppo svizzero partecipante al progetto AENEAS ha dimostrato che in Arabidopsis thaliana uno shift termico provoca una destabilizzazione nel silenziamento genico portando all’espressione dei geni presenti nelle regioni eterocromatiche (Tittel-Elmer et al, 2010). Nell’esperimento effettuato su Arabidopsis le piantine sono state sottoposte ad un periodo di freddo (4°C) per una settimana e poi trasferite a 37°C per 15 ore: questo stress si è dimostrato essere in grado di indurre la trascrizione di regioni eterocromatiche, di sbloccare il silenziamento genico di una linea transgenica silenziata epigeneticamente e soprattutto di indurre la trascrizione di alcune classi di retrotrasposoni con la formazione di copie extra-cromosomali. È stato inoltre dimostrato che alla trascrizione degli elementi trasponibili e alla formazione delle copie extra-cromosomali ne segue una integrazione nel genoma solo in mutanti per epiregolatori appartenenti al pathway degli sRNA. Non vi è integrazione invece nella progenie di piante di Arabidopsis wild type.
Questi risultati ottenuti nella pianta modello Arabidopsis thaliana sono molto interessanti e potrebbero rappresentare un punto di partenza per indurre la creazione di nuovi epialleli stabili, ereditabili dalla progenie anche in mais per cui si è deciso di provare questo tipo di approccio anche nel nostro laboratorio.
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diverse. È stato quindi effettuato un primo esperimento con condizioni diverse di temperatura (illustrate in figura 5.11) per trovare le condizioni stressanti che fossero in grado di preservare la capacità riproduttiva delle piante.
Fig.5.11: esperimento preliminare per verificare il tipo di stress che possa mantenere la vitalità della pianta.
42
Fig.5.12: Rappresentazione schematica del gene della YFP. La metilazione, quindi il conseguente silenziamento, del transgene ∆KAN provoca a sua volta il silenziamento dell’espressione del gene della YFP e quindi la mancata fluorescenza.
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Durante il periodo in cui le piante sono state sottoposte allo stress sono stati prelevati dei campioni a varie temperature ed effettuate delle fotografie mediante microscopio con focale, in modo da poter verificarel’eventuale attivazione dell’espressione della della YFP. Nelle fotografie risultanti, riportate nelle figure 5.15, 5.16 e 5.17, si può notare chiaramente la presenza della YFP mediante l’emissione della fluorescenza di colore giallo a livello dei nuclei delle piante dopo un solo giorno dallo shift termico.
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Fig.5.17: Foto dei nuclei della pianta numero 20 (YFP+) dopo 24h a 42°C, la pianta di riferimento è stata sottoposta al trattamento tre.
49
6.
CONCLUSIONI E PROSPETTIVE FUTURE
Fin dai tempi antichi l’uomo ha effettuato una selezione sulle piante coltivate di tipo fenotipico, in base ai caratteri ritenuti vantaggiosi. Questo tipo di selezione era basta principalmente sulla selezione naturale stessa e la comparsa di mutazioni spontanee che apportavano dei miglioramenti alle piante. Oggi come oggi si ha la certezza che sono dei cambiamenti nella sequenza di un gene a creare nuovi caratteri e fenotipi. Con questa certezza si sono potute creare nuove e specifiche mutazioni da utilizzare sia per scopi di ricerca sia per accelerare il miglioramento genetico delle piante coltivate. La creazione di questi mutanti infatti è di fondamentale importanza per capire e studiare la funzione dei vari geni. Grazie a questi studi si potuto effettuare una selezione di tipo genotipico delle piante coltivate, ovvero una selezione di piante che portano quei geni legati a caratteri considerati vantaggiosi, oltre alla selezione di tipo fenotipico.
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crescere e incrociate con piante della linea B73, all’interno del programma di reincroci successivi per introgredire la mutazione nel background omozigote B73.
La seconda parte invece si è focalizzata sulla messa a punto di un protocollo di stress termico per indurre la formazione di epialleli, in quanto uno stress di questo tipo porta all’espressione di geni presenti nelle regioni eterocromatiche e alla trascrizione e inserzione di alcuni retrotrasposoni. Questo lavoro è stato applicato in base ai risultati ottenuti in Arabidopsis thaliana da un gruppo di ricerca svizzero partecipante al progetto AENEAS. Uno shift termico da 4°C a 37°C è infatti in grado di indurre l’attivazione di una linea transgenica silenziata epigeneticamente e la trasposizione di una particolare classe di retrotrasposoni. Queste condizioni di stress non è applicabile alla pianta di mais, in quanto la temperatura di 4°C sarebbe letale per le piante mentre i 37°C rappresentano una temperatura quasi ottimale di crescita. A questo scopo è stato condotto un esperimento preliminare atto a trovare le condizioni di stress ottimali che inducano condizioni di stress senza intaccare la vitalità e la capacità riproduttiva della pianta. Questo stress è stato applicato in parallelo con la linea B73 (linea di riferimento) e la linea reporter silenziata epigeneticamente. Questa linea porta infatti un transgene esprimente la YFP, la yellow fluorescent protein, una proteina che emette una fluorescenza gialla se osservata al microscopio a fluorescenza o con focale, ma in questa linea il transgene non si esprime. Il transgene infatti si è inserito in una sequenza intergenica, immediatamente a valle di un trasposone che risulta essere metilato e quindi silenziato. L’effetto di questa metilazione si estende anche al transgene che quindi risulta essere normalmente silenziato epigeneticamente. Questa linea, analogamente a quella utilizzata in Arabidopsi, risulta essere particolarmente utile per identificare condizioni di stress che inducano modificazioni epigenetiche in grado di sbloccare questo silenziamento e che quindi possono portare alla formazione di epialleli. Infatti lo stress termico da noi messo a punto, che prevede una settimana a 15°C e il successivo trasferimento delle piante ad una temperatura di 42°C per due giorni, si è rivelato essere in grado di attivare l’espressione della YFP, rilassando probabilmente il meccanismo di silenziamento epigenetico.
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7.
BIBLIOGRAFIA
Aaron Greenup, W. James Peacock, Elizabeth S. Dennis and Ben Trevaskis (2009)
The molecular biology of seasonal flowering-responses in Arabidopsis and the cereals. Annals of Botany 103: 1165–1172
Bensen RJ, Johal GS, Crane VC, Tossberg JT, Schnable PS (1995) Cloning and
characterization of
the maize An1 gene. Plant Cell 7: 75–84
Bob B. Buchanan , Wilhelm Gruissem, Russell L. Jones (2003) Biochimica e Biologia molecolare delle Piante. Zanichelli 325-333; 914-915
Carlos M. Vicient (2010) Transcriptional activity of transposable elements in maize. Vicient BMC Genomics, 11:601
China F. Lunde, Darren J. Morrow, Laura M. Roy (2003) Progress in maize gene
discovery: a
project update Funct Integr Genomics 3 : 25–32
Damon Lisch (2009) Epigenetic Regulation of Transposable Elements in Plants. Annu. Rev. Plant Biol. 60:43–66
Daniel H. Chitwood & Marja C. P. Timmermans (2010) Small RNAs are on the move.
54
Das L., Martienssen R (1995) Site-selected transposon mutagenesis at the hcf106
locus in maize. Plant Cell 7:287–294
Francois Roudier, Felipe Karam Teixeir* and Vincent Colot (2009) Chromatin indexing in Arabidopsis: an epigenomic tale of tails and more. Trends in Genetics Vol.25 No.11
Frank Johannes, Emmanuelle Porcher, Felipe K. Teixeira, Vera Saliba-Colombani, Matthieu Simon, Nicolas Agier1, Agne` s Bulski, Juliette Albuisson, Fabiana Heredia, Pascal Audigier, David Bouchez, Christine Dillmann, Philippe Guerche, Fre´de´ ric Hospital, Vincent Colot (2009) Assessing the Impact of Transgenerational Epigenetic Variation on Complex Traits. PLoS Genetics Volume 5 | Issue 6 | e1000530
Jennifer Pfluger and Doris Wagner (2007) Histone modifications and dynamic regulation of genome accessibility in plants. Current Opinion in Plant Biology 10: 645–652
Hanley S., Edwards D, Stevenson D, Haines S, Hegarty M, Schuch W, Edwards KJ
(2000)
55
Hidetaka Ito, Herve´ Gaubert, Etienne Bucher, Marie Mirouze, Isabelle Vaillant &
Jerzy Paszkowski () An siRNA pathway prevents transgenerational retrotransposition in plants subjected to stress. Letter Research VOL 000 | NATUR E | 1-5
Lisch D, Chomet P, Freeling M (1995) Genetic characterization of the Mutator system
in maize: behavior and regulation of Mu transposons in a minimal line. Genetics 139: 1777–179
Marcelina Garcia-Aguilar, Caroline Michaud, Olivier Leblanc, and Daniel Grimanelli (2010) Inactivation of a DNA Methylation Pathway in Maize Reproductive Organs Results in Apomixis- ike Phenotypes. The Plant Cell, Vol. 22: 3249–3267
Mary Gehring, Steven Henikoff (2007) DNA methylation dynamics in plant genomes. Biochimica et Biophysica Acta 1769: 276–286
McClintock B. (1950) The Origin and Behavior of Mutable Loci in Maize. Proc Natl Acad Sci U S 36 : 344 – 355
Meishan Zhang, Josphert N. Kimatua, Kezhang Xu, Bao Liu (2010) DNA cytosine methylation in plant development. journal of genetics and genomics 37: 1-12
56
Miho M. Suzuki and Adrian Bird (2008) DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews | genetics volume 9: 465-476
Snustad D. P., M. J. Simmons (2010) Principi di Genetica. Elementi genetici trasponibili, ed. Edises 535-557
Rebecca A. Mosher and Charles W. Melnyk (2010) siRNAs and DNA methylation: seedy epigenetics. Trends in Plant Science Vol.15 No.4
