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3. MATERIALI E METODI
I FASE
Data la difficoltà riscontrata nel reperire blastomeri umani nelle giuste condizioni fisiologiche e morfologiche, è stato deciso di mettere innanzitutto a punto la tecnica FISH su amniociti isolati da liquido amniotico. Anche in letteratura prima di eseguire un’analisi dei blastomeri tramite Ibridazione in Situ Fluorescente (FISH) e Reazione Polimerasica a Catena (PCR), queste tecniche vengono messe a punto utilizzando linfociti di sangue periferico oppure amniociti non coltivati.
3.1. FISSAGGIO DELLE CELLULE SUL VETRINO
Con il surnatante di liquido amniotico contenente solo pochi amniociti su millilitro, lasciando il pellet per le culture utilizzate nella diagnosi prenatale, abbiamo ottenuto alcuni vetrini con circa 10 cellule fissate sulle quali è stato possibile mettere a punto la DGP mediante FISH.
Sopra il vetrino sono stati creati due piccoli cerchi con una punta di tungsteno, in modo da consentire di circoscrivere una goccia di liquido amniotico depositata in questo cerchio sfruttando la sua tensione superficiale. Alla goccia di circa 3-5 microlitri, con una micro pipetta, vengono aggiunti 4 µl di una soluzione ipotonica (KCl) mantenuta alla temperatura di 37°C.
La soluzione ipotonica avendo una concentrazione di soluto minore rispetto al citoplasma della cellula consente il passaggio per osmosi del solvente dall’esterno all’interno fino al rigonfiamento o alla lisi della cellula.
Questo passaggio è molto importante per cellule già differenziate, come gli amniociti, che sono provvisti di un citoplasma molto denso, il quale deve essere eliminato prima del fissaggio; a differenza delle cellule embrionali, come i blastomeri, che non sono ancora completamente differenziati, e per il cui fissaggio non è necessario uno shock ipotonico. La dissoluzione parziale del citoplasma o la completa lisi della cellula, con
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liberazione del nucleo, rappresenta una condizione necessaria per l’ingresso della sonda all’interno del nucleo e quindi la riuscita della tecnica FISH.
Il passaggio finale, che permette il fissaggio delle cellule al vetrino, viene effettuato aggiungendo piccole quantità (circa 1,5 µl per 3/4 volte) di fissativo di Carnoy costituito in rapporto di 3:1 Metanolo/Acido acetico.
L'acido acetico è un solvente protico idrofilo (polare), simile all'etanolo e all'acqua. Con una moderata costante dielettrica di 6,2 può sciogliere non solo composti polari come sali inorganici e zuccheri, ma anche composti non-polari come oli ed elementi chimici come zolfo e iodio.
Il metanolo, o alcol metilico, è il più semplice degli alcoli. È completamente solubile in molti solventi organici, quali il cloroformio e l’acqua e consente il vero fissaggio delle cellule.
A questo punto il vetrino con il preparato viene fatto asciugare a temperatura ambiente e colorato per 2 minuti con il colorante Giemsa, che tramite due colori distinti, Blu di metilene e Cosina, permettere una miglior visualizzazione dei nuclei presenti.
La colorazione di Giemsa si basa sulla differenziazione dei costituenti cellulari che hanno reazione basica, i quali fissando l'eosina (acida) si colorano in rosso-arancio. Al contrario i componenti cellulari aventi reazione acida si colorano in blu, con i prodotti di ossidazione del Blu di Metilene-Azzurri (basici). Nella Citogenetica la colorazione di Giemsa è utilizzata per evidenziare alcuni bandeggi cromosomici.
Con una osservazione al microscopio ottico del vetrino è stato quindi possibile osservare la presenza delle cellule fissate in cui è avvenuta una parziale dissoluzione o una lisi completa del citoplasma della cellula con liberazione del nucleo. I vetrini ritenuti migliori (con nuclei maggiormente rigonfiati e più liberi dal citoplasma) sono stati decolorati con il fissativo di Carnoy per 30 minuti, e utilizzati per la FISH.
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3.2. IL PROTOCOLLO della FISH
I vetrini su cui deve essere eseguita un’analisi FISH vengono messi ad invecchiare nel tampone 2 x SSC a 37°C per 30 minuti, dopodiché vengono sottoposti ad una disidratazione crescente di alcool:
- 2 min in etanolo al 70% - 2 min in etanolo all’80% - 2 min in etanolo al 95%
Nel frattempo vengono preparate le sonde specifiche.
Quelle utilizzate per un’indagine DGP sono di solito sonde centromeriche.
Il primo esperimento è stato messo a punto con una sonda CEP 14/22 (D14Z1 – D22Z1 AQUARIUS della CYTOCELL).
Nei soggetti con una traslocazione robertsoniana o fusione centrica 14/22 è possibile che la traslocazione venga trasmessa durante la segregazione gametica portando alla comparsa di una trisomia o monosomia del 22 o del 14 nelle cellule embrionali. Questo tipo di trisomia non essendo compatibile con la vita porta necessariamente a morte precoce dell’embrione.
Evidenziare nelle prime fasi di sviluppo di un embrione quelle alterazioni cromosomiche che ne compromettono la crescita, diventa estremamente importante, perché evita di trasferire in utero embrioni destinati all’arresto.
Per questo motivo abbiamo iniziato i nostri tentativi di applicazione della tecnica utilizzando proprio la sonda centromerica per tali cromosomi. Il risultato dell’analisi della cellula sana, al microscopio a fluorescenza, visualizza la presenza di quattro segnali distinti emettenti nel rosso o nel verde (a seconda del fluorocromo con cui è stata marcata la sonda). Al contrario una cellula con trisomia del cromosoma N. 22 o N. 14 presenta 5 segnali, mentre per una cellula con monosomia del cromosoma N. 22 o N. 14 è 3 il numero dei segnali visibili.
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La mix utilizzata per la preparazione della sonda centromerica 14/22 contiene:
- 7 µl di Buffer - 2 µl di H2O - 1 µl di sonda
Tale mix deve essere quindi centrifugata e riscaldata insieme ai vetrini per 4 min a 37°C.
Vengono prelevati 10 µl di mix e depositati all’interno dei due cerchi creati sul vetrino in cui erano stati fissati circa 2/3 nuclei interfasici in ognuno.
Il vetrino viene denaturato ad una temperatura di 75°C ± 1°C per 2 min e incubato a 37°C per tutta la notte.
Il giorno dopo per eliminare la sonda rimasta in eccesso i vetrini vengono lavati a 70°C per 2 min con una soluzione di 49 ml di acqua, 1 ml di tampone 20 x SSC, 150 µl di Tween 20; e per 2 min a temperatura ambiente con una soluzione di 45 ml di acqua, 5 ml di tampone 20 x SSC, 50 µl di Tween 20 e fatti asciugare a temperatura ambiente.
Successivamente vengono colorati con 15 µl di colorante di contrasto DAPI e lasciati in frigorifero per circa 10 minuti prima di analizzarli al microscopio a fluorescenza (NIKON ECLIPSE 80i) per mezzo dei filtri DAPI ( λ da 350 a 425 nm circa ), TRITC ( λ da 540 a 625 nm circa ) e FITC( λ da 425 a 525 nm circa) (Vedi figure 9 e 10, cap.4).
I risultati ottenuti qualitativamente buoni ci hanno suggerito di provare a mettere a punto un protocollo di FISH con modifiche, per rendere l’analisi più veloce e quindi applicabile anche ai blastomeri (Munnè et al., 1998), dove il tempo utile per acquisire un risultato è determinante per il successo del trasferimento dell’embrione.
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3.2.1. Il protocollo della FISH perfezionato
In questo protocollo modificato viene escluso il passaggio iniziale in 2 x SSC ed il periodo di incubazione a 37°C è ridotto da 24 ore a 4 ore. I vetrini per questo esperimento, utilizzando un protocollo di FISH modificato, sono stati ibridati con le sonde CEP 14/22, lavati e ibridati con le sonde CEP 13/21 (D13Z1 – D21Z1 AQUARIUS della CYTOCELL), lavati e ibridati con le sonde CEP 15 (D15Z1 AQUARIUS della CYTOCELL).
Per consentire più ibridazioni sulla stessa cellula nel più breve tempo possibile abbiamo lavato i vetrini con acqua distillata a 70°C per 2 minuti. La riuscita di questo passaggio diventa importante quando operiamo sui blastomeri.
La sonda centromerica 13/21 riconosce le regioni alfa omologhe dei cromosomi 13 e 21. Il risultato dell’analisi della cellula sana, al microscopio a fluorescenza, visualizza la presenza di quattro segnali distinti emettenti nel rosso o nel verde (a seconda del fluorocromo con cui è stata marcata la sonda). Al contrario una cellula con trisomia del cromosoma N. 13 o N. 21 presenta 5 segnali, mentre per una cellula con monosomia del cromosoma N. 13 o N. 21 è 3 il numero dei segnali visibili.
La sonda centromerica del cromosoma N. 15 permette l’identificazione di monosomie e trisomie del 15, entrambe non compatibili con la vita. Il risultato dell’analisi della cellula sana, al microscopio a fluorescenza, visualizza la presenza di due segnali distinti emettenti nel rosso o nel verde (a seconda del fluorocromo con cui è stata marcata la sonda). Al contrario una cellula con trisomia del cromosoma N. 15 presenta 3 segnali, mentre per una cellula con monosomia del cromosoma N. 15 il numero di segnali visibili è 1.
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II FASE
3.3. PROVA SU UN BLASTOMERO PROVENIENTE DA UN
EMBRIONE IN ARRESTO MITOTICO
La seconda fase del nostro lavoro prevedeva la biopsia di un blastomero da embrioni in arresto mitotico spontaneo conservati all’interno di una capsula con un Cleavage Medium (Cook) e mantenuti in termostato a 37°C con una percentuale di CO2 del5,5 %. Su tre embrioni disponibili solo
uno di essi, all’osservazione microscopica, è risultato idoneo alla biopsia. L’embrione è stato aspirato per mezzo di una micropipetta di vetro al microscopio invertito e inserito all’interno di una goccia di Gamete HEPES Buffer (Cook) ricoperta completamente da olio di paraffina così da impedire l’evaporazione del buffer e la variazione di pH.
A questo punto per mezzo di un microscopio invertito dotato di un micromanipolatore (OLIMPUS IXS1) l’embrione è stato immobilizzato mediante una pipetta Holding e sulla zona pellucida è stato creato per mezzo di un coltello microchirurgico un foro di circa 20 µm. Con una micropippetta di vetro (35-40 µm di diametro) è stato aspirato un blastomero e fissato su un vetrino con il fissativo di Carnoy.
Sul vetrino sono state effettuate tre differenti e successive ibridazioni in situ fluorescente con altrettante sonde con incubazione della prima sonda per tutta la notte, e per 4 h per le altre due, al fine di ottenere più risultati diagnostici da una sola cellula.
1) sonda CEP 14/22(LSI D14Z1 – D22Z1 AQUARIUS della CYTOCELL) 2) le sonde centromeriche per il cromosoma sessuale X e per il
cromosoma Y (LSI CEP X DXZ1-CEP Y DYZ3 della CYTOCELL) 3) le sonde centromeriche per il cromosoma N. 8 e per il cromosoma N.
9 LSI D8Z2-D9Z3 della CYTOCELL ).
Anche le sonde centromeriche per i cromosomi sessuali X e Y, e per i cromosomi N.8 e N.9 permettono l’identificazione di aneuploidie numeriche; importanti ai fini diagnostici sono soprattutto le ultime due.
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Alterazioni di tipo numerico dei cromosomi sessuali possono comportare differenti patologie: Sindrome di Turner (monosomia X), Sindrome di Klinefelter (XXY), Sindrome della trisomia X (XXX). La trisomia dell’8 comporta la sindrome di Warkany 2. Invece la monosomia dell’8 e del 9, e la trisomia del 9 sono incompatibili con la vita.
