MATERIALI E METODI

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Materiali e Metodi

2.1 Soggetti sani

Il BNP è stato dosato in 188 neonati sani, entro la prima settimana di vita extra uterina. Inoltre, il BNP è stato dosato da campioni di plasma appartenenti ad un gruppo di 245 bambini sani con età compresa da sette giorni di vita a dodici anni. Il 57% di neonati e lattanti, arruolati in questo studio, sono maschi.

Tutti i neonati sono nati a termine (da 35 a 42 settimane di gestazione) e presentavano un peso alla nascita che variava da 2,5 a 4,1 Kg, con un punteggio Apgar alla nascita ≥ 8. I campioni di sangue sono stati raccolti da controlli sani che sono stati sottoposti a screening di routine per la ricerca di disordini genetici (per i neonati) o durante controlli endocrinologici (per i bambini).

Successivamente, un gruppo di 222 soggetti composto da neonati e bambini appartenenti al gruppo dei soggetti sani, appaiato per età ai pazienti con difetti cardiaci congeniti, è stato arruolato come gruppo di controllo durante la seconda parte del mio elaborato.

Il consenso informato è stato ottenuto dai genitori di tutti i partecipanti e il protocollo dello studio è stato approvato dal Comitato Etico locale.

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2.2 Pazienti con difetti cardici congeniti

Il BNP è stato dosato in 218 neonati e bambini nel primo mese di vita (129 maschi e 87 femmine di cui 10 prematuri) affetti da difetti cadiaci congeniti non trattati, ricoverati presso l'Unità di Pediatria Cardiovascolare dell'Ospedale del Cuore di Massa, in un periodo di quattro anni (Gennaio 2008–Maggio 2012). Eventuali pazienti con difetti cadiaci congeniti, precedentemente trattati con cure palliative o correttive, sono stati esclusi dallo studio. Tutti i pazienti sono stati sottoposti ad esame obiettivo, elettrocardiogramma standard a 12 derivazioni, radiografia del torace. La diagnosi finale di difetto cardiaco congenito è stata confermata per mezzo di un esame ecocardiografico transtoracico, in accordo con le Linee Guida Internazionali (Lopez et al. 2010). Quando clinicamente necessario, sono state condotte ulteriori indagini, come: cateterismo cardiaco, risonanza magnetica cardiaca o tomografia computerizzata. In accordo con le caratteristiche emodinamiche e patogenetiche, i pazienti sono stati raggruppati in sei sottogruppi (Tabella. 2.2.1):

a) Gruppo 1 (26 pazienti): patologie caratterizzate da sovraccarico di volume ventricolare sinistro (Left Ventricular Volume Overload, LVVO), quali il ventricolo destro a doppia uscita, il dotto di Botallo con shunt emodinamicamente significativo, il difetto interventricolare, il truncus arterioso.

b) Gruppo 2 (49 pazienti): costituito da cardiopatie congenite caratterizzate da sovraccarico di pressione ventricolare sinistro (Left Ventricular Pressure Overload, LVPO), quali la coartazione aortica e la stenosi aortica.

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pressione ventricolare destra (Right Ventricular Pressure Overload, RVPO), tra cui il ventricolo destro a doppia uscita con stenosi polmonare, la stenosi polmonare e la tetralogia di Fallot.

d) Gruppo 4 (4 pazienti): costituito da patologie con sovraccarico volumetrico ventricolare destro (Right Ventricular Volume Overload, RVVO), tra cui il ritorno polmonare venoso anomalo e l’insufficienza congenita della tricuspide.

e) Gruppo 5 (65 pazienti): costituito da bambini con trasposizione delle grandi arterie (TGA).

f) Gruppo 6 (53 pazienti): costituto da bambini con cuore univentricolare (Univentricular Heart, UH).

Al momento dell'ingresso in ospedale è stato raccolto un campione di sangue (prelievo in condizioni basali) da tutti i 218 pazienti considerati (Tabella. 2.2.1). Per stabilire l'andamento temporale dei valori di BNP nelle prime settimane di vita, da alcuni pazienti sono stati raccolti più di un campione di sangue prima dell'intervento chirurgico. In particolare, per 24 pazienti sono stati ottenuti da 4 a 8 campioni, mentre da 16 pazienti 2 o 3 campioni; infine, per 178 pazienti è stato raccolto un solo un campione in condizione basale.

Il consenso informato è stato ottenuto dai genitori di tutti i partecipanti e il protocollo dello studio e stato approvato dal Comitato Etico locale.

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Materiali e Metodi 53 Gruppo Numero di soggetti studiati Media ng/L Mediana ng/L Intervallo ng/L p rispetto ai Controlli * Pazienti con CHD 218 2720,0 1029,8 25-20152 p<0,0001 Controlli 222 186,8 149,5 9-866 LVVO con CHD 26 2670,9 1263,0 110-18618 p<0,0001 LVPO con CHD 49 4206,3 1511,0 69-19872 p<0,0001 RVPO con CHD 21 492,0 166,0 25-3076 p=0,0001 RVVO con CHD 4 1441,5 821,5 132,4000 p=0,0001 TGA con CHD 65 1842,5 1167,0 25-10668 p<0,0001 UH con CHD 53 3425,4 1821,0 35-20152 p<0,0001

Tabella 2.2.1 Valori di BNP riscontrati in neonati con difetti cardiaci congeniti (CHD),

divisi per differenti gruppi di patologie, ed in neonati sani (controlli).

LVPO = gruppo con sovraccarico pressorio del ventricolo sinistro (Left Ventricular Pressure Overload); LVVO = gruppo con sovraccarico volumetrico del ventricolo sinistro (Left Ventricular Volume Overload); RVPO = gruppo con sovraccarico pressorio del ventricolo destro (Right Ventricular Pressure Overload); RVVO = gruppo con sovraccarico volumetrico del ventricolo destro (Right Ventricular Volume Overload); TGA = trasposizione delle grandi arterie; UH = cuore univentricolare (Univentricular Heart).

Intervallo: minimo e massimo valore; *valore p calcolato con ANOVA e test post hoc di Scheffe.

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2.3 Campioni di plasma

Il BNP plasmatico è stato dosato nel plasma residuo di campioni di sangue sia dei 218 neonati con difetti cardiaci congeniti che dei 433 bambini sani (188 neonati e 245 bambini di età compresa da 0 a 12 anni).

In condizioni basali, per tutti i 218 pazienti con difetti cardiaci congeniti, il BNP e stato dosato sia all'ingresso su plasma raccolto in EDTA, che nel plasma residuato dopo gli esami di routine (circa 0,2-0,4 mL). Inoltre, in alcuni pazienti con difetti cardiaci congeniti, il BNP è stato misurato diverse volte prima dell'intervento cardiochirurgico, per un totale di 369 dosaggi. I campioni di sangue sono stati prelevati da vasi venosi periferici. Il sangue è stato posto in provette di polipropilene con EDTA (1 mg/mL di sangue), immediatamente dopo il prelievo, per minimizzare la degradazione del BNP (Prontera et al., 2005). Il plasma è stato separato rapidamente mediante centrifugazione a 2500 g per 15 minuti a 4°C. Il dosaggio del BNP è stato effettuato non oltre le quattro ore dopo il prelievo.

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2.4 Metodo di dosaggio del BNP

Il dosaggio del BNP è stato eseguito con una tecnica immunochimica su analizzatore automatico Access® (Triage BNP, Access® Immunoassay Systems, REF 98200, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Si tratta di un dosaggio immunoenzimatico non competitivo a singola fase impiegante particelle paramagnetiche e tracciante chemiluminescente. Il campione viene aggiunto alla cuvetta di reazione insieme al coniugato formato da anticorpi monoclonali di topo anti-BNP umano legato a fosfatasi alcalina ed a particelle paramagnetiche rivestite di anticorpo monoclonale di topo anti-BNP umano. Il anti-BNP si lega all’anticorpo sulla fase solida, mentre il coniugato reagisce con un sito antigenico diverso sulla stessa molecola del peptide. Dopo l’incubazione nella cuvetta di reazione, la separazione in un campo magnetico e il successivo lavaggio rimuovono i componenti non legati alla fase solida. Un substrato chemiluminescente (Lumi-Phos 530), viene aggiunto alla cuvetta e la luce generata dalla reazione è misurata con un luminometro. La produzione di luce è direttamente proporzionale alla concentrazione di BNP presente nel campione. La quantità di analita nel campione viene determinata mediante una curva di calibrazione a sei punti determinata sperimentalmente e memorizzata nel sistema.

Le caratteristiche analitiche e l’accuratezza diagnostica del test sono state valutate precedentemente nello stesso laboratorio in cui si è svolto il presente studio (Prontera et al., 2005). Il limite di rilevazione del metodo Access è stato determinato tramite misure ripetute (n = 20) del calibratore del BNP a concentrazione pari a 0 ng/L in tre diverse sessioni, ottenendo un valore medio (±SD) di 0,3 ± 0,08 ng/L (intervallo 0,25-0,36

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ng/L) (Prontera et al., 2005). Il profilo di imprecisione inter ed intra saggo è stato valutato in accordo con il protocollo EP5-A NCCLS utilizzando misure ripetute di due campioni plasmatici in 20 giorni consecutivi, in doppio, con concentrazioni di BNP rispettivamente di 52,6 ng/L e 1095 ng/L. Per i due campioni, l'imprecisione intrasaggio era risultata essere rispettivamente di 3,39% e 1,56%, mentre l'imprecisione totale rispettivamente di 8,44% e 5,92% (Prontera et al., 2005).

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2.5 Analisi statistica

L'analisi statistica è stata condotta utilizzando un Macintosh PowerPC G5 con il programma Stat-View 5.0.1 (1992-98, SAS Institute Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC, USA). Dato che i livelli circolanti di BNP non sono distribuiti normalmente, per l'analisi sono stati utilizzati sia i dati originali che quelli trasformati logaritmicamente. Per lo stesso motivo è stato preferito l'utilizzo di test non parametrici e i valori della mediana e dei percentili sono stati riportati insieme o al posto dei valori di media e deviazione standard. L'analisi delle curve ROC è stata condotta come precedentemente descritto (Robin et al., 2011). Nell'analisi ROC la presenza di difetti cardiaci congeniti è stata valutata come variabile dicotomica, indicando i pazienti con difetti cardiaci congeniti come positivi e i controlli come negativi. Il confronto fra i valori delle aree sotto la curva ROC è stata eseguita con il metodo non parametrico descritto da De Long ed altri, utilizzando la procedura del bootstrap con almeno 2000 replicazioni (De Long et al., 1988).