CAPITOLO III STUDIO SPERIMENTALE

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CAPITOLO III

STUDIO SPERIMENTALE

Osteogenesi, osteo-induzione e osteo-conduzione rappresentano i tre elementi essenziali per la rigenerazione ossea insieme alla completa osteo-integrazione tra innesto osseo e osso lesionato.

Un ampia gamma di “impianti ossei alternativi” diversi per composizione, meccanismo d'azione e caratteristiche peculiari, è attualmente disponibile in commercio (Giannoudis et al., 2005). Un impianto osseo ideale dovrebbe essere: osteo-conduttivo, osteo-induttivo, biocompatibile, biodegradabile, strutturalmente simile all'osso, facile da utilizzare e relativamente economico (Giannoudis et al., 2005).

Tra i biomateriali testati nella rigenerazione ossea, trovano attualmente impiego la matrice ossea demineralizzata, il collagene o sostituti di sintesi a base di calcio, silicone o alluminio, come le ceramiche a base di fosfato di calcio o i derivati dell’idrossiapatite (HA) (Giannoudis et al., 2005). Entrambi questi due ultimi materiali si sono dimostrati altamente biocompatibili ma, l’idrossiapatite permane per lungo tempo dopo la riparazione ossea determinando uno stress meccanico locale. Attualmente viene utilizzata in associazione a fattori di crescita e proteine morfogenetiche dell’osso (BMPs) (Holmes, 1979; Elsinger & Leal, 1996).

Altri materiali studiati sono i “vetri bioattivi”, con proprietà sia osteo-conduttive che osteo-integrative, che presentano una maggior resistenza meccanica rispetto agli scaffold di fosfato di calcio o di HA anche se difficili da fissare all’osso, in quanto possono resistere alla perforazione e al rimodellamento, rompendosi durante l’applicazione, per cui attualmente sono impiegati come graft expander (Kinnunen et al., 2000; Peltola et al., 2000).

Una delle opzioni chirurgiche emergenti è rappresentata dall’uso di impianti compositi con fattori di crescita osteo-genetici e osteo-induttivi, in associazione a una matrice osteo-conduttiva quali, ad esempio, i copolimeri di acido glicolico/BMPs o ceramiche di fosfato-tricalcico/aspirato di midollo osseo. La matrice

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40 conduttiva diventa un sistema di erogazione per agenti bioattivi, che richiedono una minor chemiotassi e una minor migrazione di cellule progenitrici degli osteoblasti al sito di trapianto. La diretta infusione di cellule nel sito di lesione, inoltre, porterebbe a un più rapido recupero della normale struttura ossea (Giannoudis et al., 2005).

I continui progressi nel campo della terapia genica e dell'ingegneria tissutale hanno portato alla valutazione di ulteriori famiglie di fattori di crescita, di scaffold biologici, nonché all'incorporazione di cellule staminali mesenchimali per arrivare, infine, allo sviluppo di sostituti tissutali pronti per l'uso.

Una strategia comune nel campo dell’ingegneria tissutale prevede l’uso di matrici tridimensionali biodegradabili in materiale sintetico o naturale, comunemente denominate scaffold, che forniscono alle cellule una struttura temporanea che può riprodurre le funzioni della matrice extracellulare dei tessuti biologici, agire come substrato per l’adesione cellulare, fornire supporto meccanico e guidare il tessuto durante la rigenerazione (Marler et al., 1998; Kim & Mooney, 1998). Scaffold costituiti da una struttura micro/nanofibrosa hanno mostrato alcune caratteristiche che li rendono interessanti per l’applicazioni nel campo dell’ingegneria tissutale, quali elevata porosità e area superficiale che possono favorire l’adesione, la migrazione e l’interazione cellulare, nonché il rilascio di fattori bioattivi (Chew et al., 2006). Le tecniche di elettrospinning e wetspinning stanno riscuotendo notevole successo nel campo dell’ingegneria tissutale e del rilascio controllato di farmaci grazie alla loro semplicità, basso costo, facilità di caricamento di fattori bioattivi nelle fibre e capacità di produrre strutture fibrose tridimensionali con diversa organizzazione e scala microstrutturale (We & Ramakrishna, 2006; Puppi et al., 2010b).

Diversi polimeri naturali, come collagene, chitosano o fibrinogeno, o sintetici, come (poli(ε-caprolactone) [PCL], acido poli(lattico-co-glicolico) [PLGA] o acido poli(L-lattico) [PLLA]), sono stati proposti in ingegneria tissutale (Puppi et al., 2010a; Puppi et al., 2010b; Engel et al., 2008). Il PCL è uno fra i polimeri sintetici maggiormente studiati nel campo della rigenerazione del tessuto osseo grazie alle sue proprietà di biocompatibilità e biodegradabilità (approvato già da tempo dalla

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41 FDA viene impiegato per la produzione di suture riassorbibili utilizzate in chirurgia). Il PCL è un poliestere alifatico che in condizioni fisiologiche può essere degradato sia per via enzimatica sia per via idrolitica. Data la sua struttura semicristallina, presenta una degradazione molto lenta (circa 2 anni) in quanto l’alto grado di impaccamento delle catene polimeriche limita l’ingresso di fluidi nella struttura molecolare e quindi rallenta la degradazione del materiale (Pitt, 1990). Diversi studi hanno suggerito il suo uso nel campo dell’ingegneria tissutale e la sua bassa velocità di degradazione suggerisce il suo impiego per la rigenerazione del tessuto osseo (Hutmacher, 2000; Savarino et al., 2007). In particolare l’inclusione di una fase ceramica bioattiva, ad es. nano particelle di idrossiapatite (HA), in matrici di PCL tridimensionali (scaffold) è stata dimostrata migliorare le proprietà meccaniche e l’osteoconduttività del materiale, nonché favorire l’adesione e la proliferazione di cellule osteoblastiche in vitro, senza alterazioni a carico del fenotipo (Mondrinos et al., 2006; Lei et al., 2007; Fabbri et al., 2010).

I polimeri a stella sono una classe di materiali sintetici costituiti da una struttura macromolecolare ramificata in cui tre o più catene polimeriche lineari sono legate ad una molecola centrale a basso peso molecolare. In genere, in soluzione e allo stato fuso, hanno una struttura molecolare compatta e presentano proprietà differenti rispetto ai corrispettivi polimeri lineari con stessa composizione monomerica e equivalente peso molecolare, come minore viscosità e miglior controllo della concentrazione dei gruppi terminali di catena. In questa attività di ricerca verrà impiegato un PCL a stella, sviluppato dal gruppo del Prof. Ramani Narayan del Michigan Biotechnology Institute (Balakrishnan et al., 2004; Balakrishnan et al., 2006), costituito da tre catene di PCL lineari attaccate ad un atomo di alluminio centrale.

Particolare peculiarità dei polimeri biodegradabili, emersa da numerosi studi, è la possibilità di caricarli con farmaci e di impiegarli come matrici per la preparazione di micro/nano particelle da utilizzare come vettori per il rilascio locale nel trattamento di infezioni. Il rilascio controllato di farmaci da materiali polimerici e

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42 inorganici è stato ampiamente studiato (Schmidt et al., 1995; Lin et al., 1999; Diez-Pena et al., 2002; Mack et al., 2009) allo scopo di valutare la capacità degli scaffolds di mantenere una corretta concentrazione locale senza determinare tossicità o reazioni sistemiche avverse. La produzione di fibre caricate con farmaci antibiotici offre il duplice vantaggio di aumentare la distribuzione del farmaco e migliorare la cinetica di rilascio (Chang et al., 2008).

Le fibre di PCL hanno mostrato una compliance ed estensibilità elevate e possono essere caricate con proteine e farmaci steroidi, grazie a tecniche di filatura, a partire da una sospensione contenente farmaco e polimero (Chang et al., 2008). Esse, inoltre, si sono rilevate un substrato favorevole alla crescita cellulare (Balmayor et al., 2009; Porter et al., 2009).

I fluorochinoloni rappresentano, fra gli antibiotici, una classe relativamente recente. Introdotti per la prima volta nel 1986 sono un gruppo di antibatterici di sintesi, con attività battericida. Presentano un ampio spettro d’azione in quanto mostrano efficacia verso organismi anaerobi, aerobi Gram-positivi e Gram-negativi (Beretta, 1996). In particolare, quelli di terza generazione come Enrofloxacina e Levofloxacina, presentano nuove e più spiccate proprietà biologiche verso cocchi e gram-positivi, e nei confronti di Mycoplasma, Legionella, Chlamydia e

Mycobacterium spp (Brown, 1996; Fish & Chow, 1997). Entrambe hanno mostrato

spiccata efficacia verso i principali patogeni ritenuti maggiormente responsabili di infezioni ossee (Staphylococcus Aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus spp. e Pseudomonas auriginosa) (Wildermuth et al., 2007; Papich & Riviere, 2009). Grazie a queste caratteristiche trovano un importante impiego nel trattamento di infezioni sostenute da batteri β–lattamino-resistenti e meticillino-resistenti (MRSA) (Papich & Riviere, 2009).

Entrambi i farmaci presentano una buona efficacia di penetrazione nei tessuti; sono in grado di penetrare il tessuto osseo e sinoviale se somministrati, per via parenterale, ad alti dosaggi (Duval & Budsberg, 1995). Presentano una concentrazione intracellulare piuttosto notevole soprattutto nei leucociti (Papich & Riviere, 2009) per questo motivo sono in grado di raggiungere concentrazioni

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43 notevoli nelle zone dove è presente infezione. La loro azione battericida è concentrazione dipendente piuttosto che tempo dipendente (Papich & Riviere, 2009). L’enrofloxacina è registrata per il solo uso veterinario e trova ampia applicazione nel trattamento delle più comuni infezioni. La levofloxacina è registrata per esclusivo uso umano e trova impiego solo per il trattamento di infezioni particolarmente resistenti.

Il modello cunicolo è riportato (An & Friedman, 1999a; Pearce et al., 2007) quale specie comunemente utilizzata per la conduzione di studi sperimentali per la valutazione di diversi tipi di materiali ossei per impianti. Il coniglio si presenta, infatti, di facile gestione e la sua taglia lo rende particolarmente adatto alla conduzione di diversi tipi di valutazione sul meccanismo di rigenerazione ossea. Nonostante le enormi differenze con le comuni specie da affezione (cane, gatto, grossi erbivori) e con l’uomo, sia per la conformazione anatomica, sia per la struttura istologica dell’osso (Wang et al., 1998), sia per il rimodellamento osseo (haversiano e corticale) cui esso va incontro (Castaneda et al., 2006), il modello cunicolo, e in particolare la razza New Zealand White, rappresenta un modello particolarmente diffuso per la valutazione della rigenerazione ossea in difetti critici a carico delle ossa lunghe (Hedberg et al., 2005b; Bodde et al., 2008; Kasten et al., 2008; Liu et al., 2009; Niemeyer et al., 2010; Wang et al., 2010).

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44 SCOPO DEL PROGETTO

In considerazione dei presupposti scientifici precedentemente esposti e della crescente incidenza di lesioni ossee caratterizzate da grave perdita di sostanza che richiedono l’impiego di innesti ossei non sempre facilmente reperibili, è emersa, con sempre maggior insistenza, la necessità di allestire dei supporti tridimensionali in grado di promuovere e sostenere la rigenerazione ossea.

La frequenza elevata con cui i processi flogistici ossei possono determinare sia la perdita di sostanza grave, sia il fallimento del processo messo in atto per la loro riparazione, unita alla difficoltà di intraprendere terapie antibiotiche particolarmente gravose, ha maturato la necessità di allestire dei supporti polimerici che fossero al contempo capaci sia di stimolare la rigenerazione ossea, sia di trattare l’infezione eventualmente presente agendo da sistemi a rilascio controllato di farmaco locale.

Il presente lavoro di ricerca si pone, quindi, come obiettivo quello di sviluppare scaffolds tridimensionali micro/nano strutturati in *PCL da valutare nel processo di rigenerazione ossea su lesioni con grave perdita di sostanza complicate da infezione.

Gli scaffolds a base di *PCL allestiti mediante tecnica di wet-spinning, saranno caricati con due antibiotici fluorchinolonici (Enrofloxacina o Levofloxacina) e un fattore osteoconduttivo, promotore della rigenerazione, quale l’Idrossiapatite. Durante l’attività, i parametri del processo di produzione saranno ottimizzati e correlati alla morfologia delle fibre ottenute.

Per gli scaffolds caricati con farmaci, saranno, inoltre, valutate, con tecnica di cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), l’efficacia di caricamento degli

scaffolds e la cinetica di rilascio in vitro.

Prove di citocompatibilità in vitro mediante studi di coltura cellulare con cellule pre-osteoblastiche saranno condotte mediante test quantitativo, mediante Saggio dei Sali di Tetrazolio (WST-1), e test colorimetrici con osservazioni a microscopia confocale laser (CLSM).

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45 verranno valutate mediante studio in vivo, su modello cunicolo, analizzando l’entità del processo rigenerativo attuato e la morfologia del tessuto neoformato in difetti ossei di dimensioni critiche.