riassunto
RIASSUNTO
Questa tesi sperimentale fa parte di un progetto di ricerca finalizzato ad individuare i geni candidati ad essere differenzialmente espressi nelle strutture cerebrali (quali ippocampo, amigdala e corteccia peririnale) coinvolte in processi di apprendimento, in ratti sottoposti al paradigma comportamentale del contextual fear conditioning (CFC).
Molte informazioni sulla memoria e sull’apprendimento associativo derivano da studi di condizionamento classico svolti sia su vertebrati che invertebrati. Tale procedura implica la formazione di un’associazione tra stimoli e/o risposte, in quanto uno stimolo neutro chiamato stimolo condizionato (CS) è associato ad uno stimolo che normalmente evoca una risposta fisiologica chiamato stimolo incondizionato (US). Accoppiando ripetutamente i due stimoli anche il solo CS è in grado di generare la risposta. Una forma di condizionamento classico è il condizionamento alla paura o classical fear conditioning, basato su processi neurali di apprendimento e memoria che permettono di rispondere in maniera efficace a stimoli, che altrimenti non indurrebbero risposte spontanee di paura. In tale paradigma comportamentale l’amigdala svolge un ruolo chiave indipendentemente dalle modalità sensoriali usate come CS. Anche l’ambiente dove viene presentato l’US può assumere caratteristiche di SC inducendo risposte che vengono definite di paura condizionata al contesto. In questa forma di condizionamento al contesto si ha l’attivazione dell’amigdala, della corteccia peririnale e soprattutto dell’ippocampo. Animali sottoposti al CFC mostrano una risposta comportamentale alla paura che è quella dell’immobilità o freezing ogni volta che sono inseriti nell’apparato di condizionamento
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(retrieval test). Registrazione elettrofisiologiche effettuate su slices di ippocampo di ratti condizionati evidenziano la comparsa di modificazioni dell’eccitabilià che perdurano fino a 7 giorni dopo il condizionamento. Tali modificazioni sono correlate a processi neurali che avvengono solo in questi animali (associazione tra stimolo avversivo e contesto). Da anni è noto che forme di memoria a lungo termine sono associate a modificazione dell’espressione genica e sintesi di nuove proteine che sono alla base di cambiamenti strutturali persistenti. Per individuare i possibili geni coinvolti in tali modificazioni in seguito a CFC, abbiamo utilizzato la tecnica dell’ibridazione sottrattiva soppressiva (suppression subtractive Hybridisation, SSH). L’SSH rappresenta un efficiente metodo che tramite la costruzione di librerie sottrattive di cDNA, permette l’isolamento di sequenze differenzialmente espresse in seguito al trattamento in esame. In particolare l’efficienza dell’SSH consiste nella capacità di isolare anche i trascritti più rari non evidenziabili con altre tecniche che evidenziano pattern di espressione genica. A 48 ore di distanza dal condizionamento, i cervelli sia degli animali condizionati che dei controlli (animali mai entrati nell’apparato di condizionamento) sono stati estratti e sezionati in tre parti: anteriore, medio-temporale e cerebello-bulbare. L’RNA poliA+ estratto dalle sezioni medio-temporali degli animali condizionati e dei controlli viene utilizzato per la costruzione delle librerie sottrattive di cDNA.
Dopo aver valutato l’efficienza della sottrazione i cDNA vengono clonati e sottoposti a screening. Le sequenze dei cloni differenziali, ottenute con sequenziatore automatico, sono analizzate mediante comparazione con le sequenze depositate in banche dati tramite programmi come FASTA e BLASTN. Da tale studio è emerso che, in
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seguito a CFC, si assiste ad una modulazione positiva dell’espressione di geni codificanti per proteine coinvolte nel trasporto e nel rilascio delle vescicole, nei meccanismi di trasduzione dei segnali, nella morfogenesi degli astrociti e nel metabolismo energetico mitocondriale. In questo lavoro di tesi sono state analizzate le sequenze dei geni candidai ad essere differenzialmente espressi che hanno mostrato avere un elevata omologia con sequenze di DNA codificante per proteine note, quali la complessina 1, la phosphoprotein enriched in astrocytes e la subunità 6 della ATPsintetasi. L’analisi di espressione di questi trascritti è stata valutata con RT-PCR relativa.
