Lo sviluppo della retina neurale rappresenta un ineguagliabile modello di studio per la dissezione di questo tipo di meccanismi molecolari.

Introduzione

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Generare la diversità cellulare

Tutti i metazoi derivano da una singola cellula (lo zigote) che nel corso dello sviluppo embrionale si divide formando a tempi successivi i dierenti tipi cellulari che compongono tessuti ed organi. Nonostante gli enormi pro- gressi che negli ultimi venti anni hanno permesso la dissezione molecolare dei segnali extra- ed intracellulari che regolano divisione e dierenziamento cellulare, ancora non si conosce il meccanismo molecolare che fa cambiare le potenzialità dierenziative di una cellula embrionale in relazione al tempo ed alla progressione del ciclo cellulare.

Lo sviluppo della retina neurale rappresenta un ineguagliabile modello di studio per la dissezione di questo tipo di meccanismi molecolari.

Sviluppo della retina nei Vertebrati

Neurulazione e specicazione del campo dell'occhio

Lo sviluppo del Sistema Nervoso nei Vertebrati inizia durante la gastru- lazione, e richiede l'interazione dei tre foglietti embrionali in formazione, l'ectoderma, l'endoderma e il mesoderma.

Alla ne della gastrulazione, una parte dell'ectoderma è già specicata come ectoderma neurale, che è ben riconoscibile per la morfologia colonnare delle cellule che lo compongono. Questa regione dell'embrione è chiamata piastra neurale. La piastra neurale va incontro a processi morfogenetici che portano prima al sollevamento delle pliche neurali e inne al congiungimento delle pliche lungo l'asse antero-posteriore, con la formazione del tubo neurale.

Il tubo neurale darà origine a tutte le strutture del Sistema Nervoso Centrale (SNC) in seguito a profondi cambiamenti della sua struttura. La regiona- lizzazione del tubo neurale richiede l'espressione di specici geni - come i geni Hox - in domini ristretti lungo l'asse antero-posteriore e la formazione di gradienti di morfogeni lungo l'asse dorso-ventrale.

La formazione di restringimenti del tubo neurale causa la separazione delle

diverse vescicole encefaliche. Prima della chiusura del tubo neurale nella

zona caudale, a livello anteriore è già possibile riconoscere le tre vescicole encefaliche primarie: prosencefalo, mesencefalo e rombencefalo. Con restrin- gimenti successivi il prosencefalo si divide in telencefalo e diencefalo, mentre il rombencefalo forma il metencefalo e il mielencefalo. Ciascuna delle vesci- cole encefaliche si svilupperà ulteriormente per originare strutture speciche del cervello.

Lo sviluppo dell'occhio inizia con la formazione di due evaginazioni del prosencefalo chiamate vescicole ottiche (Fig.1). Queste si spingono late- ralmente no a contattare l'epitelio, che in risposta a segnali induttivi si inspessisce e forma il placode del cristallino. In seguito la vescicola ottica va incontro ad un processo di invaginazione che porta alla formazione della coppa ottica; il placode del cristallino segue l'invaginazione della vescicola ottica formando la vescicola del cristallino. La coppa ottica risulta formata da due epiteli giustapposti; lo strato esterno (in contatto con la vescicola della lente) formerà la retina neurale, mentre lo strato più interno formerà l'epitelio pigmentato. L'iride e il corpo ciliare derivano dalla porzione più periferica della retina. La sclera e la cornea derivano dalle cellule mesen- chimatiche provenienti dalle creste neurali. A questo stadio, la connessione della coppa ottica con l'encefalo si restringe a formare il peduncolo ottico, che guiderà la migrazione degli assoni del nervo ottico.

La corretta formazione delle vescicole ottiche richiede la specicazione del campo dell'occhio (eye eld), che inizia già a livello della piastra neurale.

La specicazione del campo dell'occhio richiede la cooperazione e l'intera- zione di fattori necessari all'induzione neurale (noggin), di fattori coinvolti nella specicazione della parte anteriore della piastra neurale (otx2 ) e fattori di trascrizione specici del campo dell'occhio, come rx1 e six3 (Zuber et al., 2003). Molti dei fattori di trascrizione necessari alla specicazione del cam- po dell'occhio sono poi espressi nel corso del dierenziamento delle cellule retiniche (Casarosa et al., 2003).

Struttura della retina neurale

La retina neurale matura ha la stessa struttura istologica in tutti i Verte-

brati (Fig.2). Essa è composta da cinque tipi principali di neuroni e un tipo

di cellula gliale, la glia di Müller. Queste cellule sono organizzate in modo ordinato a formare una struttura pluristraticata. Procedendo dall'epitelio pigmentato al cristallino è possibile individuare: lo strato nucleare esterno (ONL), lo strato plessiforme esterno (OPL), lo strato nucleare interno (INL), lo strato plessiforme interno (IPL) e lo strato delle cellule gangliari (GCL).

- Lo strato nucleare esterno è formato da coni e bastoncelli, cellule foto- recettrici in grado di trasdurre gli stimoli luminosi in potenziali elettrici graduati.

- Lo strato nucleare interno è costituito da tre tipi di interneuroni: le cellule orizzontali, le cellule bipolari e le cellule amacrine. Le cellule orizzontali e le cellule bipolari formano sinapsi con i fotorecettori; i dendriti di queste cellule si estendono nello strato plessiforme esterno, dove prendono contatto con i peduncoli dei fotorecettori. Le cellule orizzontali sono responsabili dell'integrazione dei segnali entranti dai fotorecettori e contribuiscono alla polarizzazione dei campi recettivi. Le cellule bipolari formano sinapsi con i fotorecettori e trasmettono l'informazione entrante alle cellule gangliari. Le cellule amacrine sono neuroni associativi, che contattano le cellule bipolari e le cellule gangliari a livello dello strato plessiforme interno. Nell'INL si trovano anche i nuclei delle cellule della glia di Müller; queste cellule hanno lunghi processi che contattano entrambe le superci dell'epitelio retinico.

- Lo strato delle cellule gangliari comprende le cellule gangliari e alcune cellule amacrine, denite amacrine displaced. Le cellule gangliari ricevono l'informazione entrante dalle cellule bipolari e dalle cellule amacrine. I loro assoni escono dall'occhio e formano il nervo ottico, il quale raggiunge i centri encefalici superiori.

La retina di Xenopus dierisce da quella dei mammiferi solo per alcune

caratteristiche dovute all'adattamento alla vita acquatica. Nel complesso

Xenopus possiede cinque sottotipi di fotorecettori: due tipi di bastoncelli,

sensibili al verde e al blu, e tre tipi di coni, sensibili al rosso, al blu e agli

UV (Witkovsky, 2000). In Xenopus le vie dei coni e quelle dei bastoncelli

non sono separate, ma ogni cellula bipolare riceve input da entrambi i tipi di

fotorecettori. Inne, la stragrande maggioranza delle bipolari non contatta

direttamente le cellule gangliari, ma forma sinapsi con le cellule amacrine, le

Figura 1: Sviluppo dell'occhio nei Vertebrati. (A) Evaginazione delle vescicole ottiche;

(B) induzione del placode del cristallino; (C) formazione della coppa ottica e della vescicola del cristallino; (D) induzione della cornea. Da Gilbert (2006).

Figura 2: Struttura della retina dei Vertebrati. (A) Sezione istologica retinica e

rappresentazione dei tipi cellulari che la compongono (B). Da Cayouette et al. (2006).

quali a loro volta contattano le gangliari (Gabriel et al., 2000). Nonostante queste dierenze, la retina di Xenopus rappresenta un modello valido per lo studio dei processi di retinogenesi nei Vertebrati.

I processi di dierenziamento nella retina neurale

Il modello degli stati di competenza

Come precedentemente illustrato, la retina deriva da una evaginazione del prosencefalo, e come accade per tutte le strutture del SNC, l'architettura tissutale è generata dallo sviluppo di un epitelio monostraticato formato da progenitori neurali proliferanti, chiamati retinoblasti. Ma a dierenza del SNC la retina è più accessibile e possiede un numero minore di tipi cellulari.

Queste caratteristiche hanno reso lo studio della retinogenesi un paradigma per la comprensione dei processi di dierenziamento nel sistema nervoso cen- trale.

I retinoblasti vanno incontro a divisioni cellulari successive, che all'inizio espandono la popolazione di progenitori (fase proliferativa) e in seguito ge- nerano cellule neuronali post-mitotiche (fase neurogenetica).

Studi ormai classici condotti in diverse specie di Vertebrati hanno stabilito due importanti proprietà del processo di retinogenesi.

Innanziatutto, tramite marcatura delle cellule in fase S in diverse fasi di sviluppo è stato dimostrato che le cellule della retina vengono generate in una sequenza ordinata: prima le cellule gangliari, poi le orizzontali, i coni, le amacrine, i bastoncelli, le bipolari e inne le cellule della glia di Müller (Cepko et al., 1996).

Sono stati condotti anche studi di lineage, tramite trasduzione di singoli progenitori retinici con vettori retrovirali esprimenti il gene reporter della β- galattosidasi. In questo modo è stato dimostrato che un singolo progenitore può generare tutti i tipi cellulari della retina, ovvero che i progenitori retinici sono multipotenti (Turner e Cepko, 1987; Price et al., 1987).

Queste osservazioni hanno due implicazioni importanti. La prima è che an-

ché un retinoblasto possa generare diversi tipi di cellule deve necessariamente

andare incontro a divisioni asimmetriche. Per divisioni asimmetriche si in-

tendono divisioni cellulari che producono un progenitore ancora proliferante

e una cellula post-mitotica che va incontro a dierenziamento terminale.

La seconda implicazione è che la competenza dierenziativa di un retino- blasto cambia nel corso della retinogenesi. Secondo il modello proposto da Livesey e Cepko (2001), ogni progenitore attraverserebbe una serie di stati di competenza, ovvero delle nestre temporali in cui è favorita la generazio- ne di un certo tipo cellulare. Questi stati di competenza sarebbero deniti da combinazioni diverse delle proprietà del progenitore (fattori intrinseci) e dell'ambiente circostante (fattori estrinseci) (Fig.3).

Segue una rassegna dei principali fattori intrinseci ed estrinseci coinvolti nella retinogenesi.

Fattori estrinseci nella retinogenesi

Lo sviluppo della retina richiede la presenza di molti fattori estrinseci.

Alcuni di questi fattori, come Shh, BMP4 e FGF, sono fondamentali per il patterning della retina neurale, e sono in grado di regolare la proliferazione e la lunghezza del ciclo cellulare dei progenitori in funzione della concentra- zione e del contesto d'azione (Yang, 2004; Locker et al., 2006).

Esperimenti su espianti retinici in coltura hanno dimostrato che i fattori estrinseci possono giocare un ruolo importante anche nella regolazione del- l'abbondanza di un certo tipo cellulare, tramite inibizione a feedback. Ad esempio, se si mantengono in coltura espianti di retine di ratto a stadio E16 (giorno embrionale 16) con espianti a stadio P0 (giorno postnatale 0) si os- serva una diminuzione della percentuale di cellule amacrine e un aumento di coni. La produzione delle cellule amacrine da parte dei progenitori più precoci è inibita proprio da fattori rilasciati dalle cellule amacrine già die- renziate presenti negli espianti più tardivi (Belliveau e Cepko, 1999).

D'altra parte sono pochi i fattori estrinseci per i quali è stata descritta una

precisa funzione nella specicazione del destino cellulare. Gli studi più det-

tagliati riguardano il commitment dei bastoncelli nella retina di ratto. Il

dierenziamento dei bastoncelli (evidenziato come espressione della rodop-

sina) può richiedere anche diversi giorni dopo l'uscita dal ciclo cellulare. In

queste cellule post-mitotiche, l'attività di molecole secrete può alterare il de-

stino cellulare e indurre il dierenziamento in cellule bipolari. La citochina

CNTF (ciliary neurotrophic factor), aggiunta ad espianti postnatali di re-

tina di ratto, agisce sui progenitori dei bastoncelli non ancora dierenziati e ne induce il dierenziamento in cellule bipolari. Il CNTF potrebbe avere un'attività simile in vivo, poiché in espianti retinici di topi knockout per uno dei recettori del CNTF si osserva un aumento signicativo della proporzione di bastoncelli (Ezzeddine et al., 1997).

Anche la taurina, un derivato della cisteina, è in grado di regolare il dieren- ziamento dei bastoncelli in vivo. La taurina agisce legandosi a canali ionici a controllo di ligando espressi nei progenitori retinici (recettore per la Gly α2 e recettore per il GABA di tipo A), e in questo modo aumenta l'espressione di alcuni geni necessari per il commitment dei bastoncelli, tra i quali il gene homeobox Nrl e l'RNA non codicante TUG1 (Young e Cepko, 2004; Young et al., 2005).

GDF11, una molecola secreta della famiglia TGFβ, è invece coinvolta nel controllo del timing della retinogenesi. In topi mutanti per GDF11 si os- serva un aumento del numero di cellule gangliari a discapito delle cellule amacrine e dei fotorecettori. GDF11 non ha eetti sulla proliferazione dei progenitori, ma agisce alterando l'espressione di geni proneurali come Math5, Mash1 e NeuroD. Gli esperimenti indicano che GDF11 è in grado di control- lare, con un meccanismo a feedback negativo, la permanenza dei progenitori in un certo stato di competenza, ovvero il timing dierenziativo (Kim et al., 2005).

Nonostante la loro specicità nel promuovere il dierenziamento di un par- ticolare tipo cellulare, per nessuno di questi fattori è chiaro il meccanismo molecolare di azione nel controllo dell'espressione di geni chiave del destino dierenziativo.

Fattori intrinseci nella retinogenesi

Lo sviluppo della retina è controllato da numerosi fattori di trascrizione,

che agiscono in modo cooperativo in fasi diverse, come la specicazione del

campo dell'occhio, il controllo della proliferazione dei progenitori neurali, il

loro commitment e inne il dierenziamento di tipi cellulari specici. Molti

dei fattori di trascrizione che controllano la neurogenesi sono stati indivi-

duati per omologia con geni di Drosophila, e sono fattori di trascrizione con

omeodominio o fattori di trascrizione proneurali bHLH.

• In Drosophila l'espressione dei fattori di trascrizione bHLH proneu- rali è necessaria (ma non suciente) a conferire la competenza neurale a gruppi di cellule dell'ectoderma ventrale, detti gruppi proneurali. Que- sti fattori di trascrizione si legano come omodimeri o eterodimeri a regioni promotrici del DNA. La dimerizzazione richiede il dominio HLH (Helix Loop Helix), mentre il dominio basico media il riconoscimento di sequenze di DNA consensus dette E-box. Dal punto di vista funzionale i geni proneurali pos- sono essere divisi in due classi. I fattori bHLH attivatori, come i geni dei complessi achaete scute e atonal, promuovono il dierenziamento neurale.

I geni HLH repressori, come i geni hairy e enhancer of split, mancano del dominio basico di legame al DNA e per questo bloccano i fattori bHLH for- mando eterodimeri non funzionali con essi.

In ciascuno dei gruppi proneurali verrà specicato un solo neuroblasto. La selezione dei neuroblasti avviene tramite il processo di inibizione laterale, che coinvolge i geni neurogenici Notch e Delta. Notch e Delta sono proteine di membrana; l'espressione di Delta è attivata dai fattori proneurali bHLH.

L'interazione del recettore Notch con il suo ligando Delta attiva una cascata di trasduzione del segnale che porta alla soppressione dell'attività dei geni proneurali bHLH. La soppressione è mediata dall'espressione dei geni HLH repressori enhancer of split. In questo modo, tramite un processo stocastico, l'aumento dell'espressione di geni proneurali bHLH in una cellula del grup- po proneurale induce la soppressione dei geni proneurali bHLH nelle cellule vicine, causando l'inibizione del dierenziamento neuronale (Sanes et al., 2000).

Nei Vertebrati gli omologhi dei geni proneurali sono espressi nel sistema nervoso in sviluppo. All'inizio della neurogenesi l'espressione degli omologhi dei geni enhancer of split, come i geni Hes1 e Hes5 , è necessaria al man- tenimento e alla proliferazione dei progenitori neurali, mentre nelle fasi più tardive questi geni sono necessari al dierenziamento della glia. Il dieren- ziamento neuronale richiede l'espressione di diversi geni bHLH attivatori, omologhi dei geni achaete scute e atonal (Hatakeyama e Kageyama, 2004).

Come in Drosophila, nei Vertebrati la via di Notch-Delta rappresenta un po-

tente regolatore dell'attività dei geni proneurali, ma gli eetti dell'attivazione

di Notch sono contesto-specici. Nella fase proliferativa della neurogenesi,

la via di Notch è necessaria all'inibizione del dierenziamento (attivazione

dei geni Hes). Nella fase dierenziativa, Notch blocca l'espressione dei geni proneurali in alcuni progenitori, che alla ne della neurogenesi diventeranno cellule gliali.

Durante la retinogenesi in Xenopus la via di Notch è attiva nelle stesse cel- lule che esprimono i fattori bHLH, ma non ne inibisce l'attività. Infatti la sovraespressione di geni proneurali con un attivatore costitutivo di Notch facilita il dierenziamento neuronale; in questo sistema Notch agisce causan- do l'uscita precoce dei progenitori dal ciclo cellulare (Ohnuma et al., 2002a;

Ohnuma e Harris, 2003).

I geni proneurali bHLH da soli non sono sucienti alla specicazione del destino cellulare. L'espressione di altri geni, come i fattori di trascrizione homeobox, è necessaria per la determinazione del destino cellulare. In al- tri termini, l'attività specica dei geni proneurali dipende dal contesto di espressione, ovvero dalla competenza del progenitore.

• I geni homeobox sono fattori di trascrizione caratterizzati da un dominio di legame al DNA di 60 amminoacidi detto omoeodominio. Spesso l'omeodo- minio è associato ad altri domini di legame al DNA (dominio POU, dominio paired, dominio Six, dominio LIM ecc.), che contribuiscono alla specicità di riconoscimento delle regioni promotrici.

Diversi geni homeobox partecipano allo sviluppo dell'occhio, cominciando dalla specicazione dell'eye eld e il controllo della proliferazione. Di questi, alcuni sono espressi anche nelle fasi più tardive, quando ha luogo il dieren- ziamento neurale.

Pax6 è il primo gene homeobox caratterizzato nei Vertebrati necessario allo sviluppo dell'occhio. Questo gene ha una funzione estremamente conservata:

la sovraespressione di pax6 del topo in Drosophila è in grado di indurre la formazione di occhi ectopici (Halder et al., 1995). Da esperimenti di questo tipo è stato proposto che pax6 fosse il regolatore master dello sviluppo dell'occhio, ma in realtà pax6 è suciente allo sviluppo dell'occhio solo se agisce in un contesto neurale. In altri termini, la specicazione del campo dell'occhio richiede l'interazione di diversi fattori di trascrizione attivati dagli eventi responsabili del patterning del neuroectoderma (Zuber et al., 2003).

I geni Otx ad esempio sono necessari allo sviluppo dell'occhio poiché hanno

un'attività a monte di pax6 nella specicazione delle regioni anteriori del

neuroectoderma. Infatti topi knockout Otx2 ^−/− mancano di prosencefalo e mesencefalo (Acampora et al., 1995), mentre la sovraespressione di Xotx2 (e Xotx5b) in embrioni di Xenopus produce ghiandole del cemento e tessuti neurali ectopici (Andreazzoli et al., 1997; Vignali et al., 2000).

I geni Six invece hanno un ruolo importante nella proliferazione cellulare. Ad esempio, la sovraespressione di Six6/XOptx in Xenopus promuove la proli- ferazione causando la formazione di occhi più grandi (Zuber et al., 1999).

Six3 invece è espresso nei territori presuntivi dell'occhio e in Medaka agisce bloccando l'inibitore della replicazione del DNA Geminin (Bene et al., 2004).

I geni Rx hanno un ruolo essenziale nello sviluppo dell'occhio dei Vertebra- ti. Questi sono espressi inizialmente nell'eye eld, e durante la neurulazione nelle vescicole ottiche, nell'episi e nel pavimento del diencefalo (Casarosa et al., 1997; Bailey et al., 2004). Mutazioni di rx in diversi sistemi modello portano alla formazione di occhi ridotti o addirittura assenti (Andreazzoli et al., 1999; Bailey et al., 2004). In Xenopus, Xrx1 è necessario non solo alla specicazione delle strutture neurali anteriori, ma anche al controllo della proliferazione dei progenitori neurali (Andreazzoli et al., 2003).

Questi fattori di trascrizione sono espressi anche nei progenitori retinici in dierenziamento, e sono necessari alla retinogenesi. In alcuni casi il loro ruolo è più legato al mantenimento della multipotenza piuttosto che alla specicazione di un preciso destino cellulare. Ad esempio la lipofezione di Xrx1 (normalmente espresso nei progenitori retinici proliferanti) in vescicole ottiche di Xenopus promuove la proliferazione e mantiene nel tempo la mul- tipotenza delle cellule trasfettate; l'eetto è la generazione di cellule gangliari lungo tutto il periodo della retinogenesi (Casarosa et al., 2003; Zaghloul e Moody, 2007). Invece geni come pax6 e six3 partecipano alla specicazione dei tipi cellulari precoci, come le cellule gangliari, le orizzontali e le amacrine (discusso di seguito).

• La specicazione del destino cellulare dei neuroni retinici richiede com- binazioni diverse di fattori bHLH e geni homeobox (Hatakeyama e Kageyama, 2004; Zaghloul et al., 2005). Secondo il modello attualmente proposto i geni homeobox regolerebbero la specicità dello strato cellulare (GCL, INL, ONL) mentre i fattori bHLH determinerebbero il destino cel- lulare nell'ambito degli strati specicati (Hatakeyama e Kageyama, 2004).

Nonostante i dati disponibili in letteratura, non è ancora possibile denire

il codice per la specicazione dei diversi neuroni retinici. Inoltre, le die- renze riportate nei diversi sistemi modello suggeriscono che questo codice sia plastico e non universale.

Cellule gangliari.

L'espressione del gene proneurale ath5 coincide con l'inizio del dierenzia- mento delle cellule gangliari. Ath5 è necessario al dierenziamento delle cellule gangliari: mutazioni o delezioni di ath5 causano l'assenza di questo tipo cellulare (Wang et al., 2001; Kay et al., 2001). Viceversa, la sovraes- pressione di Xath5 in Xenopus causa l'aumento della produzione di cellule gangliari. Tuttavia l'eetto di Xath5 è contesto-specico: se ad esempio si lipofettano vescicole ottiche di Xenopus a stadi tardivi (st.26) la proporzione di cellule gangliari e orizzontali diminuisce a vantaggio dei neuroni più tardivi (fotorecettori e bipolari) (Moore et al., 2002). In Xenopus il dierenziamento delle cellule gangliari richiede Xbh1 , l'omologo di BarH di Drosophila (gene necessario alla specicazione dei fotorecettori R1/R6 degli ommatidi di Dro- sophila). Questo fattore di trascrizione è attivato da Xath5 e a sua volta è in grado di controllare l'espressione dei fattori XBrn3.0 necessari al dieren- ziamento terminale delle cellule gangliari (Poggi et al., 2004). Anche Pax6 è necessario al dierenziamento delle cellule gangliari; in knockout condizionali di topo l'ablazione di pax6 sopprime l'espressione di tutti i geni proneurali tranne NeuroD (Marquardt et al., 2001). In Xenopus la sovraespressione di pax6 è in grado di promuovere il dierenziamento delle cellule gangliari solo in combinazione con fattori proneurali (Wang e Harris, 2005).

Cellule orizzontali.

Nel topo la sovraespressione di Math3 con Pax6 o Six3 è in grado di promuo- vere il dierenziamento delle cellule orizzontali, mentre la sovraespressione di Math3 da solo promuove la formazione di bastoncelli (Inoue et al., 2001).

Nessuno di questi fattori di trascrizione da solo è in grado di promuovere il dierenziamento delle cellule orizzontali. Il fattore di trascrizione Prox1 invece è necessario e suciente alla specicazione di questo tipo cellulare (Dyer et al., 2003).

Cellule amacrine.

Come dimostrato da Inoue et al. (2001), nel topo NeuroD è necessario alla

specicazione delle cellule amacrine, ma la sua sovraespressione promuove il

Figura 3: Modello degli stati di competenza. (A) Cambiamento della competenza dieren- ziativa di un progenitore durante la retinogenesi; (B) Progenitore multipotente che genera diversi tipi cellulari con divisioni asimmetriche. Da Livesey e Cepko (2001)

Figura 4: Fattori di trascrizione necessari alla specicazione dei diversi neuroni retinici.

Lo schema si riferisce ai dati noti per il topo. Si veda il testo per la discussione della specicazione

dei neuroni retinici in Xenopus. Da Hatakeyama e Kageyama (2004)

dierenziamento di cellule amacrine solo se associata alla sovraespressione di Pax6 e Six3 . In Xenopus, esperimenti di lipofezione non hanno riprodotto gli eetti della combinazione di questi fattori di trascrizione osservati nel topo (Wang e Harris, 2005). Anche in Xenopus NeuroD è necessario alla specicazione delle cellule amacrine (Moore et al., 2002), ma a dierenza del topo non viene espresso solo nelle cellule amacrine ma in tutti i progenitori dall'inizio della retinogenesi. La sovraespressione di NeuroD nei progenito- ri retinici causa l'aumento della proporzione di cellule amacrine a discapito delle cellule bipolari. L'attività di NeuroD nel tempo viene regolata a livel- lo post-traduzionale dalla chinasi GSK3β; la sovraespressione di una forma di NeuroD non fosforilabile da GSK3β causa l'attivazione precoce di que- sto fattore di trascrizione e l'aumento della proporzione di cellule gangliari.

Viceversa, la proteina NeuroD di topo non contiene siti di fosforilazione rico- nosciuti da GSK3β (Moore et al., 2002). Questo esempio mostra che il timing dell'attivazione dei fattori bHLH è cruciale per la specicazione delle diver- se cellule retiniche mentre i meccanismi che lo controllano (trascrizionale o post-traduzionale) possono essere dierenti in sistemi modello diversi.

Fotorecettori.

Nel topo i fattori proneurali necessari al dierenziamento dei fotorecettori sono NeuroD e Mash1 (Hatakeyama e Kageyama, 2004). Questi fattori da soli non sono sucienti. Il gene homeobox Otx2 invece è necessario e su- ciente alla specicazione dei fotorecettori (Nishida et al., 2003). In Xenopus un altro membro della famiglia dei geni Otx, Xotx5b, è necessario e sucien- te alla specicazione dei fotorecettori (Viczian et al., 2003). La lipofezione di Xotx5b causa l'aumento della proporzione di fotorecettori, mentre la lipo- fezione Xotx5b fuso ad un repressore trascrizionale riduce la produzione dei fotorecettori. L'espressione di Xotx5b è controllata a livello traduzionale: la proteina è presente solo nello strato dei fotorecettori e dal momento corri- spondente al birthdate (data di nascita, corrispondente al momento di uscita dal ciclo cellulare) di questo tipo cellulare (Decembrini et al., 2006).

Un altro gene homeobox necessario al dierenziamento dei fotorecettori è crx.

Nel topo questo gene è espresso a valle di Otx2 nelle cellule post-mitotiche

già specicate ed è necessario al dierenziamento terminale (determinabile

dall'espressione di opsina e dalla formazione del segmento esterno). Infatti

il knockout di crx causa la formazione di fotorecettori non funzionali (Furu-

kawa et al., 1999).

Un altro gene homeobox, Nrl, è coinvolto invece nella scelta tra coni e bastoncelli. Nrl induce il dierenziamento dei bastoncelli e contempora- neamente blocca il dierenziamento dei coni; il knockout di nrl causa la formazione di retine prive di bastoncelli (Mears et al., 2001), mentre la so- vraespressione di questo gene in Xenopus fa aumentare la proporzione dei bastoncelli a discapito dei coni (McIlvain e Knox, 2007).

Cellule bipolari.

In topo, il doppio knockout di Mash1 e Math3 causa l'assenza di cellule bipolari, ma questi geni da soli non sono sucienti alla specicazione di que- sto tipo cellulare. I geni homeobox Vsx1 e Vsx2/Chx10 sono coinvolti nella specicazione delle cellule bipolari. Mutazioni di Chx10 nel topo causano la riduzione dei progenitori retinici e la perdita di cellule bipolari (Burmeister et al., 1996), mentre la sovraespressione di questo gene in combinazione con Mash1 o Math3 promuove il dierenziamento di cellule bipolari (Hatakeya- ma et al., 2001). Nel topo Vsx1 invece è necessario alla specicazione di un sottotipo di cellule bipolari, le bipolari dei coni a centro-o (Ohtoshi et al., 2004).

In Xenopus la sovraespressione Xvsx1 induce l'aumento della proporzione di cellule bipolari (Decembrini et al., 2006; D'Autilia et al., 2006). Anche il ge- ne Otx Xotx2 è coinvolto nella specicazione delle bipolari: la lipofezione di Xotx2 fa aumentare la proporzione di bipolari a discapito dei fotorecettori, mentre il costrutto di fusione di Xotx2 con un repressore trascrizionale ridu- ce la produzione di bipolari (Viczian et al., 2003). Come per Xotx5b, anche l'espressione di Xotx2 e Xvsx1 è regolata a livello traduzionale, in accordo con il birthdating delle cellule bipolari (Decembrini et al., 2006).

La CMZ: una ricapitolazione spaziale della retinogenesi

In alcuni vertebrati, come i Pesci e gli Anbi, l'occhio continua a crescere

durante tutta la vita dell'animale. In questi organismi, ai bordi della coppa

ottica, esiste una zona denominata zona del margine ciliare (CMZ), formata

da cellule indierenziate da cui sono continuamente generate nuove cellule

retiniche e pigmentate. Anche nei mammiferi esiste una regione omologa,

detta margine ciliare pigmentato (PCM), contenente cellule staminali quie- scenti che rappresentano uno strato per la rigenerazione dei diversi tipi cellu- lari della retina adulta (Tropepe et al., 2000) L'ordine con cui sono espressi i geni nella CMZ rispecchia, molto probabilmente, l'ordine temporale con cui questi geni vengono espressi durante l'embriogenesi (Perron et al., 1998).

In Xenopus possono essere identicate quattro zone principali, ciascuna ca- ratterizzata dall'espressione dierenziale di geni implicati nel programma di dierenziamento retinico (Perron et al., 1998).

- Zona 1 (di specicazione): rappresenta la parte più periferica della CMZ dove l'epitelio pigmentato si ripiega sulla retina neurale. Qui troviamo cellule staminali in grado di dare origine sia a cellule della retina che all'epitelio pigmentato. In queste cellule vengono espressi Xpax6 , Xrx1 , e Xsix3 , che sono i geni ad espressione più precoce nello sviluppo dell'occhio.

- Zona 2 (proneurale e neurogenica): contiene i retinoblasti in attiva prolife- razione che esprimono i maggiori attivatori del ciclo cellulare come la ciclina D1, ciclina A2 e cdk2. In essi i geni del campo dell'occhio continuano ad es- sere attivi, ma iniziano anche ad essere espressi geni proneurali omologhi al complesso genico achaete scute di Drosophila, come Xash1 e Xash3 , e geni neurogenici come XNotch-1 e XDelta-1 , implicati in fenomeni di inibizione laterale (Perron et al., 1998; Ohnuma et al., 2002a).

- Zona 3 (di determinazione): avviene qui la determinazione del tipo cellulare.

In questa zona della CMZ sono espressi geni omologhi al complesso atonal di Drosophila, Xngnr, Xath3 , Xath5 e XNeuroD. Questi geni sono espressi in un tempo successivo all'espressione di Xash anche nell'embriogenesi.

- Zona 4 (di dierenziamento): è la zona più centrale. Le cellule presenti in questa regione sono già post-mitotiche e non esprimono più Notch, Delta e Xash; in questa zona cominciano ad essere espressi geni marcatori di speci-

ci tipi cellulari come Brn-3 nello strato delle cellule gangliari (Hirsch and Harris, 1997).

La peculiare organizzazione della CMZ costituisce un importantissimo

strumento alla comprensione dello sviluppo della retina ed un ulteriore

modello per lo studio del dierenziamento del sistema nervoso.

Il problema del timing retinogenetico

I fattori estrinseci e i fattori intrinseci cooperano per la specicazione dei diversi tipi cellulari che compongono la retina. La capacità di un progenito- re di generare i diversi neuroni retinici in una sequenza temporale stabilita indica che l'attivazione dei fattori necessari alla specicazione di questi neu- roni è controllata nel tempo. Si potrebbe pensare che ciò avvenga grazie alla variazione temporale della produzione di diversi segnali induttivi. In realtà il timing della retinogenesi è regolato in modo cellula-autonomo. Ciò è stato dimostrato tramite trapianti eterocronici: se si trapiantano progeni- tori precoci in un embrione a stadi più tardivi, questi progenitori seguono il timing dierenziativo determinato dal momento dell'espianto, ovvero l'am- biente in cui sono inseriti non sincronizza il dierenziamento di queste cellule con quello delle cellule circostanti (Rapaport et al., 2001). Questo suggerisce che esiste un orologio molecolare che regola il passaggio dei retinoblasti attraverso stati di competenza successivi.

Quest'idea trova riscontro in studi condotti in neuroblasti di Drosophila e nella retina di Xenopus.

Nei neuroblasti embrionali di Drosophila i fattori di trascrizione hb, kruppel, pdm e castor sono necessari e sucienti alla specicazione dei diversi tipi di neuroni della progenie, e l'ordine della loro espressione determina l'ordine con il quale questi neuroni sono specicati.

Un meccanismo simile nei Vertebrati potrebbe essere consistere nell'espres- sione sequenziale dei fattori di trascrizione responsabili della specicazione dei diversi neuroni retinici.

Nella retina di Xenopus, l'mRNA di Xotx5b (fotorecettori), Xotx2 e Xvsx1 (cellule bipolari) è espresso in tutti i progenitori retinici lungo tutta la durata della retinogenesi. Tuttavia se si guarda alla sintesi delle rispettive proteine, emerge che queste vengono tradotte esattamente secondo la stessa succes- sione temporale con la quale i corrispondenti tipi cellulari vengono generati (Decembrini et al., 2006). Il controllo della traduzione di questi geni dipende da segnali in cis nel 3'UTR. Questo è stato dimostrato usando dei sensori

costituiti dal 3'UTR di questi geni a valle della sequenza codicante della

GFP. In retine lipofettate con questi sensori, l'espressione della GFP nel

tempo mima la traduzione della proteina corrispondente.

Figura 5: Traduzione di Xotx2, Xotx5b e Xvsx1 durante la retinogenesi in Xenopus.

Ibridazione in situ (rosso) e immunoistochimica (verde) di Xotx2 , Xotx5b e Xvsx1 in varie fasi della retinogenesi di Xenopus. Da Decembrini et al. (2006).

Questi esempi mostrano che il controllo temporale dell'espressione di fat- tori di trascrizione chiave è alla base del controllo del timing dierenziati- vo. Ma cosa regola nel tempo l'espressione di questi fattori di trascrizione?

In Drosophila l'espressione di hb è regolata principalmente a livello trascri- zionale, mentre il timing dell'espressione di questo gene e della transizione hb→kruppel richiede la citochinesi. Invece le transizioni kruppel→pdm→cas avvengono anche in neuroblasti bloccati in G 2 , secondo modalità che possono essere spiegate solo ipotizzando l'esistenza di un orologio intrinseco (Gros- skortenhaus et al., 2005).

Anche in Xenopus la traduzione di Xotx2 , Xotx5b e Xvsx1 richiede la pro-

gressione nel ciclo cellulare; ad esempio, bloccando il ciclo cellulare con trat-

tamenti farmacologici la loro traduzione viene bloccata. Inoltre modulando

la lunghezza del ciclo cellulare si altera il timing della traduzione di Xotx2 ,

Xotx5b e Xvsx1 (Decembrini et al., 2006). Lo studio condotto da Decembrini

et al. (2006) indica che, come in Drosophila, la generazione sequenziale di

diversi tipi di neuroni retinici è controllata da un orologio intrinseco; questo

orologio misura la lunghezza del ciclo cellulare e regola la traduzione dei suoi eettori, i geni Xotx2 , Xotx5b e Xvsx1 .

Qual è la natura molecolare di questo orologio? In neuroblasti post- embrionali di Drosophila il gradiente del fattore di trascrizione chinmo rego- la l'ordine della generazione dei diversi neuroni della progenie. Il gradiente della proteina Chinmo è stabilito grazie al controllo della traduzione del suo mRNA attraverso il 5'UTR (Zhu et al., 2006).

Non ci sono invece indizi sulla natura molecolare dell'orologio che regola la

retinogenesi in Xenopus. Futuri studi dovranno stabilire quali molecole rego-

lano la traduzione di Xotx2 , Xotx5b e Xvsx1 , come l'orologio misura la lun-

ghezza del ciclo cellulare e se questo meccanismo controlla il dierenziamento

degli altri neuroni retinici.

Il controllo della traduzione nello sviluppo e nel dierenziamento

I processi di controllo della traduzione

La concentrazione di una proteina in una cellula dipende dal rapporto tra la velocità della sua sintesi e quella della sua degradazione. Stime recen- ti indicano che le dierenze nelle concentrazioni di una proteina dipendono solo per il 20-40% da dierenze dei livelli dell'RNA messaggero (Mata et al., 2005). Questo mette in evidenza che i processi di regolazione dell'espressione genica a livello post-trascrizionale hanno un impatto sul proteoma (ovvero il repertorio di diverse proteine espresse da una cellula o da un tessuto in un dato momento) molto più profondo di quanto compreso no ad oggi.

Dopo la trascrizione e l'esportazione nel citoplasma, un mRNA può essere sequestrato e localizzato in compartimenti subcellulari specici, può rima- nere non tradotto o può addirittura essere degradato. Il destino dell'RNA messaggero dipende da proteine in grado di riconoscerlo in modo specico. I determinanti della specicità possono essere sequenze consensus, particolari strutture secondarie, o le stesse proteine trasportate dal nucleo al citopla- sma assieme al messaggero maturo, che rappresentano la cosiddetta storia nucleare dell'mRNA (Kuersten e Goodwin, 2003).

I principali siti di regolazione post-trascrizionale si trovano nelle sequenze non tradotte dell'mRNA, chiamate 5' e 3'UTR (untranslated region). Il 3'UTR in particolare può contenere molti segnali in cis importanti per la re- golazione della traduzione. Questi segnali in cis sono sottoposti a pressione selettiva, con l'eetto che geni altamente regolati nello sviluppo ed espressi in maniera tessuto-specica hanno un 3'UTR molto lungo, mentre geni poco regolati hanno sequenze 3'UTR estremamente ridotte (Stark et al., 2005).

I processi di controllo della traduzione sono stati particolarmente appro- fonditi in Drosophila e in C.elegans nell'ambito della formazione degli assi corporei e dello sviluppo della linea germinale. In questi casi l'attività tra- scrizionale è molto ridotta o assente, e i processi di sviluppo sono regolati tramite il controllo della traduzione di mRNA precedentemente immagazzi- nati (Gilbert, 2006; Kuersten e Goodwin, 2003; de Moor et al., 2005).

I principali fattori di regolazione della traduzione che riconoscono elementi in

cis nel 3'UTR appartengono a due classi di molecole: microRNA e proteine che legano l'RNA messaggero.

microRNA

I microRNA (miRNA) sono regolatori post-trascrizionali estremamente conservati nell'evoluzione, presenti nelle piante e in tutti i metazoi (Pasqui- nelli et al., 2000; Lagos-Quintana et al., 2001). Si tratta di molecole di RNA a doppio lamento lunghe 21-22 nt, e la loro attività si basa sul riconoscimento di sequenze complementari nel 3'UTR dell'mRNA bersaglio. I miRNA ma- turi derivano da trascritti che subiscono diversi processi di rimaneggiamento all'interno del nucleo e del citoplasma (illustrato in Fig.6). Il riconoscimen- to del bersaglio e l'inibizione della traduzione avvengono nel citoplasma e richiedono l'assemblaggio del complesso multiproteico RISC (RNA-induced silencing complex). Per il riconoscimento del bersaglio è necessario che ci sia complementareità perfetta a livello dei nucleotidi 2-8 del miRNA, che rappresentano la cosiddetta seed region. Le altre posizioni sono libere, ov- vero possono contenere mismatch che non precludono l'attività biologica del miRNA. Se l'appaiamento è perfetto, il duplex miRNA/mRNA è sottoposto ad un taglio endonucleasico che avvia la completa degradazione dell'RNA messaggero. Viceversa, se l'appaiamento non è perfetto, l'mRNA non viene degradato ma la sua traduzione è bloccata (Fig.6).

Diversi studi condotti negli Invertebrati hanno messo in evidenza l'importan- za dei miRNA nello sviluppo del sistema nervoso. In Drosophila, il microR- NA miR-9a è coinvolto nella specicazione dei precursori neurali degli organi sensoriali esterni (SOP), raorzando l'inibizione laterale Notch-dipendente (Li et al., 2006; Cohen et al., 2006). In C.elegans è stato descritto un com- plesso circuito genetico, comprendente alcuni miRNA e fattori di trascri- zione, che controlla la specicazione di neuroni chemosensibili (Kosik, 2006;

Hobert, 2004). Non esistono al momento studi condotti in Vertebrati che

dimostrino il ruolo di specici miRNA nella neurogenesi.

Figura 6: La via dei miRNA. I miRNA derivano da lunghi trascritti, detti pri-miRNA, sinte- tizzati nel nucleo dalla RNA Polimerasi II. Nel nucleo i pri-miRNA vengono processati dall'en- donucleasi di tipo III Drosha a dare i pre-miRNA, molecole di RNA lunghe circa 70-80 nt con una tipica struttura a forcina. I pre-miRNA vengono trasportati nel citoplasma dall'esportina 5 e inne processati dall'enzima Dicer, che rilascia il miRNA maturo. Il riconoscimento dell'mRNA bersaglio e l'inibizione della traduzione richiedono il complesso multiproteico RISC (RNA-induced silencing complex). Il RISC comprende proteine in grado di riconoscere specicamente e legare i miRNAs, RNA elicasi ATP-dipendenti e proteine con attività endoribonucleasica (Argonaute). Il meccanismo di inibizione della traduzione dipende dalla complementareità tra miRNA e bersaglio.

Se l'appaiamento è perfetto, il duplex miRNA/mRNA è sottoposto ad un taglio endonucleasico che

avvia la completa degradazione dell'RNA messaggero. Viceversa, se l'appaiamento non è perfetto

(ed è la situazione più comune), l'mRNA non viene degradato ma la sua traduzione è bloccata

con un meccanismo non ancora chiarito a livello molecolare (Pillai et al., 2007). (Figura da Kosik

(2006)).

Nome Descrizione - Esempi Motivi basici ricchi di Arg Tat e Rev di HIV Proteine con domini αβ

RRM βαββαβ Lega ssRNA, riconoscendo sequenze consensus

speciche. Es.: Musashi, PABP, HuD

KH βααββα Lega ssRNA. Es.:Nova

dsRBP αβββα Legano dsRNA. Es.: RNasi III

OB fold βββαββ Barile β formato da cinque foglietti antiparalle- li. Può legare ssRNA o dsRNA. Es.: Dominio PAZ di Argonauta, domini cold shock.

Motivi a dita di Zinco Possono legare anche il DNA. Es.:TFIIIA

Motivi multimerici Pumilio

Tabella 1: Le principali famiglie di proteine che legano l'RNA. Modicato da Siomi e Dreyfuss (1997) e da Chen e Varani (2005).

Proteine che regolano la traduzione legando l'RNA (RBP)

Le prime proteine che legano l'RNA (RBP) furono descritte negli anni '80, ma le RBP oggi conosciute sono solo una piccola parte di quelle esistenti.

Basta considerare che la famiglia di geni contenenti l'RNA Recognition Motif (RRM), uno dei domini di legame all'RNA, rappresenta da sola ben l'1,5-2%

del genoma umano (Chen e Varani, 2005).

Le RBP sono implicate in tutti i processi di regolazione post-trascrizionale, dallo splicing e l'esportazione dell'mRNA dal nucleo no alla regolazione del- la localizzazione, della traduzione e della degradazione dell'RNA messaggero.

Le RBP possono essere classicate in base ai domini di legame all'RNA che contengono, come mostrato in tabella 1. Anche se questi domini sono molto conservati e le loro proprietà strutturali sono state ben caratterizzate, ad oggi non è ancora possibile associare ad una struttura una determinata specicità di riconoscimento. Allo stesso modo non è possibile predire la funzione speci-

ca di una RBP conoscendo solo il dominio di legame all'RNA che contiene.

Il motivo è che le RBP si sono evolute per combinazioni successive di questi

domini e di altri moduli funzionali non implicati direttamente nel legame

all'RNA. I domini ausiliari possono contribuire alla funzione della proteina

conferendo una maggiore specicità di riconoscimento, interagendo con altre

proteine o svolgendo un'attività enzimatica. Inne, una stessa RBP può ave-

re funzioni diverse, sia se è regolata a livello post-traduzionale (fosforilazione,

localizzazione cellulare...) sia se interagisce con cofattori proteici diversi.

Le RBP possono regolare la traduzione in diversi stadi (inizio, allunga- mento o terminazione) e possono esercitare un'attività attivatrice o inibitrice.

L'inizio della traduzione è il passaggio più regolato (de Moor et al., 2005;

Gebauer e Hentze, 2004). Nell'inizio cap-dipendente proteine che legano il cap al 5' dell'mRNA e proteine che legano la coda di poli(A) prendono con- tatto tra loro formando una struttura detta closed-loop. La coda di poli(A) è legata e stabilizzata da proteine dette PABP (Poli(A) Binding Proteins).

L'assemblaggio del closed loop richiede il legame del fattore di inizio eIF4E all'estremità 5' dell'mRNA e il legame del fattore eIF4G alle PABPe a eIF4E.

Alcuni regolatori della traduzione regolano la lunghezza della coda di poli(A):

RNA messaggeri con una coda di poli(A) corta hanno una bassa probabilità di assumere correttamente la struttura closed loop, e possono rimanere silenti o essere degradati. Altri fattori invece agiscono competendo con eIF4G per il legame a eIF4E. Queste RBP sono in grado di riconoscere sequenze speci-

che nel 3'UTR degli mRNA bersaglio e possono essere regolate da eettori a valle di vie di trasduzione del segnale.

Controllo della traduzione: aspetti funzionali

A dierenza della regolazione trascrizionale, il controllo della traduzio- ne ha due proprietà importanti che lo rendono cruciale in diverse fasi dello sviluppo e nel dierenziamento. Queste proprietà sono la velocità e la pos- sibilità di un controllo locale.

La velocità di regolazione consente ad una cellula di rispondere rapidamente ai segnali ambientali. Ad esempio, in Aplysia in seguito a facilitazione sinap- tica viene attivata una proteina CPEB, in grado di legare specici mRNA e di promuoverne la traduzione molto prima che possano avvenire cambia- menti dell'espressione genica a livello nucleare (Si et al., 2003a,b).

La possibilità del controllo locale della traduzione permette di limitare la

sintesi di una proteina ad uno specico compartimento cellulare o di distri-

buirla lungo un gradiente. Questo è stato descritto in diversi casi, come nello

stabilimento degli assi embrionali nell'oocita di Drosophila, dove i gradienti

dei morfogeni Hunchback e Caudal vengono stabiliti grazie a inibitori del-

la traduzione distribuiti nell'oocita secondo gradienti opposti (Kuersten e

Goodwin, 2003).

Queste considerazioni sulla funzione delle RBP possono essere sucienti nel- l'ipotesi che una RBP regoli un numero limitato di mRNA. In realtà l'ap- plicazione dei microarrays allo studio dei bersagli di RBP ha rivelato che una singola RBP è in grado di legare in vivo no a un centinaio di mRNA.

Questi studi hanno inoltre mostrato che: (1) le RBP sono associate a sotto- popolazioni di mRNA funzionalmente correlati; (2) queste sottopopolazioni di mRNA cambiano dinamicamente in risposta a cambiamenti ambientali;

(3) uno stesso mRNA può essere regolato da RBP diverse. Ciò suggerisce che le funzioni delle RBP possono essere più ampie di quelle indicate.

Per interpretare questi dati Keene e Tenenbaum (2002) hanno formulato l'i- potesi dell'operone post-trascrizionale. Secondo questo modello gli mRNA regolati da una stessa RBP rappresenterebbero i geni del tradizionale ope- rone batterico, e le RBP sarebbero i regolatori dell'operone. I membri di uno stesso operone avrebbero in comune uno stesso elemento in cis ri- conosciuto dalla RBP corrispondente. Questi elementi sarebbero presenti in combinazioni dierenti negli UTR dei messaggeri così regolati (Fig.7).

Veriche sperimentali hanno dimostrato che gli operoni post-trascrizionali esistono ed hanno una plasticità elevata. In S. cerevisiae i cinque omologhi di Pumilio (Puf1p-Puf5p) legano set specici di mRNA, ad esempio Puf3p lega mRNA di proteine mitocondriali (Gerber et al., 2004). In Drosophila, Pumilio riconosce mRNA con la stessa sequenza consensus riconosciuta da Puf3p, ma questi mRNA appartengono a gruppi funzionali completamente diversi da quelli individuati nel lievito (Gerber et al., 2006). In altri termini, gli operoni post-trascrizionali possono evolvere molto velocemente, semplice- mente per aggiunta o perdita dei siti di regolazione in cis che li identicano.

Considerato che il repertorio di RBP dei genomi degli eucarioti superiori è confrontabile a quello dei fattori di trascrizione, ciò espande enormemente le possibilità di regolazione di genomi più piccoli di quanto atteso (Keene e Tenenbaum, 2002; Moore, 2005).

La coordinazione veloce e simultanea dell'espressione di decine di geni cor-

relati funzionalmente è alla base dei meccanismi di switch molecolare. Il

modo più eciente per ottenere questo tipo di coordinazione dell'espressio-

ne genica è il controllo della traduzione da parte di RBP. Esistono diversi

esempi: in C. elegans il passaggio da uno stadio larvale al successivo o lo

switch da spermatogenesi a oogenesi richiedono l'attività di diverse RBP

Figura 7: Modello dell'operone post-trascrizionale. A livello trascrizionale (in alto), i fattori di trascrizione (TFs) regolano l'inizio della trascrizione legandosi a sequenze speciche del DNA (in giallo). A livello post-trascrizionale (al centro), le RBPs regolano la degradazione, la traduzione o la localizzazione degli mRNA in modo coordinato, interagendo con sequenze o strutture speciche dell'RNA, spesso presenti nel 3'UTR (in rosso). Le relazioni funzionali a livello delle proteine (in basso) possono corrispondere a geni co-regolati a livello trascrizionale e post-trascrizionale: geni che codicano per proteine funzionalmente correlate, come le subunità di complessi stechiometrici (blu) o componenti della stessa via metabolica (grigio), possono essere regolati dagli stessi TFs e i loro mRNA possono essere co-regolati a livello post-trascrizionale da RBPs (linee tratteggiate).

Modicato da Gerber et al. (2004)

.

(Gilbert, 2006).

Questo scenario è ulteriormente complicato dalla possibilità di regola- zione della traduzione tramite i miRNA. Ai miRNA è stato attribuita la funzione di regolatori ni (ne-tuning) dell'espressione genica e di respon- sabili della robustezza dei processi di sviluppo. Anche i miRNA regolano simultaneamente molti messaggeri, che hanno in comune lo stesso seed match.

Tuttavia la regolazione traduzionale da parte di RBP mostra una maggiore plasticità, sia per il tipo di regolazione (non necessariamente inibitoria), sia per la possibilità di risposta diretta alle vie di trasduzione del segnale.

Indagini bioinformatiche hanno mostrato che esiste una correlazione positiva tra la distribuzione di siti di legame di RBP note e quella dei siti di lega- me di miRNA (George e Tenenbaum, 2006). Ciò suggerisce miRNA e RBP possono competere per siti di legame adiacenti, e che legandosi ai siti bersa- glio potrebbero indurre la formazione di strutture secondarie mutualmente esclusive, oppure cooperare in maniera positiva per la regolazione dello stes- so messaggero. Dato che le RBP possono rispondere a segnali ambientali, queste potrebbero funzionare come veri e propri modulatori dell'attività dei miRNA (Bhattacharyya et al., 2006).

Grazie a queste proprietà i meccanismi di regolazione della traduzione potrebbero essere alla base del patterning temporale nei processi di die- renziamento. In altri termini, il controllo della traduzione potrebbe essere usato per stabilire una serie discreta di stati distinti che si susseguono in un ordine denito tramite meccanismi di switch molecolare.

La successione di stati di competenza distinti nei progenitori multipotenti del sistema nervoso è alla base della generazione della diversità neuronale.

Ma questi stati di competenza possono essere stabiliti tramite variazioni nel controllo della traduzione? Alcuni suggerimenti in questa direzione vengono dallo studio della regolazione di hunchback (hb) in Drosophila e in C. ele- gans.

Nei neuroblasti di Drosophila, i fattori di trascrizione hb, kruppel, pdm e

castor sono necessari e sucienti alla specicazione di diversi tipi di neuroni

e la loro espressione nel tempo è strettamente regolata per assicurare una

corretta istogenesi (Isshiki et al., 2001). Hb attiva l'espressione di kruppel e

nell'oocita è regolato a livello traduzionale dal complesso formato da Nanos,

Pumilio e Brat.

In C. elegans l'omologo di hunchback hbl-1 è espresso nell'ectoderma e nel sistema nervoso e appartiene alla via dei geni eterocronici. Alla stessa via appartengono i geni lin-29 e lin-41 , rispettivamente omologhi di kruppel e di brat. Inne, hbl-1 è regolato sia dal miRNA let-7 sia da Pumilio, che riconoscono siti adiacenti in cis nel 3'UTR.

Studi futuri dovranno chiarire se nei Vertebrati la successione degli stati di

competenza dei progenitori neurali è riconducibile a variazioni dell'attività

di miRNA e di proteine che legano l'RNA.

Scopo della tesi

Il timing retinogenetico dipende dalla regolazione temporale dell'espres- sione di geni chiave per la determinazione del destino cellulare. I più recenti dati riportati in letteratura suggeriscono che l'espressione di questi geni nel tempo è controllata a livello traduzionale. Come dimostrato in Decembrini et al. (2006), l'espressione di Xotx2 , Xotx5b e Xvsx1 nella retina di Xenopus è regolata da fattori in grado di riconoscere elementi in cis nel 3'UTR degli mRNA bersaglio. Quale sia la natura di questi fattori è tuttora ignoto. D'al- tra parte, le proprietà funzionali delle RBP ne fanno candidati privilegiati per la regolazione del patterning temporale dei processi di dierenziamento.

Date queste premesse, il mio lavoro di tesi è stato mirato all'individuazio- ne di RBP coinvolte nella retinogenesi. E' stato scelto un approccio del tipo gene candidato per selezionare alcune RBP (XLin-28A/B, Nrp-1, Xpumilio e Xcat2); quindi ne è stata vericata l'espressione durante la retinogenesi. In seguito sono state condotte analisi funzionali riguardanti le RBP ritenute più interessanti (XLin-28A e Nrp-1). Questi esperimenti forniscono indicazioni preliminari sulla funzione di queste RBP durante lo sviluppo retinico.

Segue la descrizione delle principali RBP analizzate.

Il gene eterocronico lin-28.

Gli eventi dello sviluppo embrionale a livello di singoli tessuti e organi sono coordinati e integrati nel tempo da programmi genetici intrinseci, in parte sensibili alle condizioni ambientali. In C.elegans il timing dello svi- luppo è regolato dai geni eterocronici. I mutanti in questi geni, noti come mutanti eterocronici, sono caratterizzati dall'alterazione del timing degli sta- di di sviluppo larvale in alcuni lineage cellulari (Ambros e Horvitz, 1984).

In C.elegans questi fenotipi sono facilmente individuabili: è possibile seguire esattamente il dierenziamento poiché tutte le divisioni cellulari seguono un lineage predenito, e tutte le fasi dello sviluppo embrionale e larvale (stadi larvali 1-4, L1-4) sono facilmente riconoscibili.

I geni eterocronici di C.elegans hanno omologhi anche nei Vertebrati, ma la loro funzione non è stata ancora caratterizzata. E' interessante notare che l'espressione di questi geni nello sviluppo ha lo stesso decorso tempora- le osservato in C.elegans: geni espressi nei primi stadi larvali sono espressi precocemente nei Vertebrati, e viceversa. La conservazione della struttu- ra e dell'espressione di questi geni suggerisce l'ipotesi di una conservazione funzionale.

Lin-28 è uno dei geni eterocronici scoperti in C.elegans e poi clonati nei Vertebrati. In particolare, lin-28 è l'unico gene eterocronico codicante per una RBP del quale sia stato isolato un omologo in Xenopus. In Xeno- pus, lin-28 è espresso in strutture neurali e durante la retinogenesi (come dimostrato in questa tesi). Considerata la funzione di lin-28 in C.elegans (descritta di seguito) e la possibile conservazione funzionale nei Vertebra- ti, questo gene rappresenta un candidato interessante per la regolazione del timing retinogenetico.

Il prodotto del gene lin-28 è una piccola proteina citoplasmatica con due domini di legame all'RNA: un dominio cold shock (CDS) e un dominio a dita di zinco simile ad alcuni domini di legame all'RNA retrovirali (Fig.(C)). La combinazione di questi due domini non è presente in nessun'altra proteina ad oggi nota. Probabilmente LIN-28 lega molecole di RNA a singolo lamento e ne regola la traduzione (Moss et al., 1997).

In C.elegans Lin-28 funziona come un vero e proprio switch molecolare che

controlla la transizione tra gli stadi larvali L2 e L3 (Fig.(B)). Nel mutante lin-28(0) (perdita di funzione) gli eventi del secondo stadio larvale (L2) sono sostituiti da quelli dello stadio successivo in molti lineage cellulari. Vice- versa, il guadagno di funzione di lin-28 impedisce la progressione agli stadi successivi a L2. In altri termini, l'espressione di lin-28 in L1 ed L2 è neces- saria anché non venga attivato precocemente il programma genetico dello stadio L3.

Non sorprende che l'espressione di lin-28 sia rigidamente regolata a livello trascrizionale e traduzionale (Seggerson et al., 2002; Morita e Han, 2006).

Tra gli inibitori traduzionali di lin-28 ci sono alcune RBP e i primi miRNA scoperti, lin-4 e let-7 . I geni bersaglio di lin-28 in C.elegans non sono stati caratterizzati, ma sono noti i rapporti epistatici tra lin-28 e molti altri ge- ni eterocronici (Fig.(A)). L'analisi di questa via genetica mette in evidenza che la regolazione del timing dello sviluppo richiede la coordinazione degli

orologi intrinseci, come i ritmi circadiani, e delle informazioni sullo stato nutrizionale e la temperatura, che indicano la permissività dell'ambiente al proseguimento dello sviluppo. In assenza di nutrienti il programma dei ge- ni eterocronici, e quindi lo sviluppo larvale, non vengono attivati. Inoltre lin-28 interagisce geneticamente con geni responsabili dei ritmi circadiani, come lin-42 (l'omologo di Period dei Vertebrati) e con geni coinvolti nel si- gnalling dell'insulina (i geni dell'insulina stessa, ins-33 , e del suo recettore, daf-2 ). Inne il dominio cold shock di Lin-28 è presente in proteine che re- golano l'accessibilità dell'mRNA in condizioni di bassa temperatura, e che per quest'attività vengono considerate chaperon dell'mRNA (Sommerville, 1999).

Il ruolo degli omologhi di lin-28 nei vertebrati resta tuttora oscuro. Nei Vertebrati esistono due famiglie di geni lin-28 , chiamate lin-28A e lin-28B.

Questi geni sono stati isolati recentemente e il loro pattern di espressione sembra coerente con l'ipotesi di un ruolo nel dierenziamento (Moss e Tang, 2003; Yang e Moss, 2003).

Anche i miRNA lin-4 e let-7 hanno omologhi nei Vertebrati (rispettivamen-

te miR-125a/miR125b e let-7a-i/miR-98) che sono stati associati a numerosi

processi cellulari. Il 3'UTR dei geni lin-28 contiene dei siti di legame per

questi miRNA, suggerendo che la regolazione dei geni lin-28 da parte di que-

sti miRNA sia evolutivamente conservata e abbia un signicato funzionale

Figura 8: Il gene eterocronico lin-28. (A) Pattern di espressione e interazioni genetiche

dei principali geni eterocronici del nematode C.elegans. Modicato da Rougvie (2005). (B)

Fenotipi eterocronici dei mutanti lin-28 perdita di funzione (lin-28(0)) e guadagno di fun-

zione (lin-28(gf)) in C.elegans. (C) La proteina Lin-28 con i suoi domini di legame all'R-

NA. CDS=cold shock domain. (D) Allineamento delle sequenze amminoacidiche delle proteine

Xlin-28A e Xlin-28B di X.laevis. L'allineamento è stato ottenuto utilizzando il programma Clu-

stalW, e l'immagine è stata realizzata utilizzando l'editor per allineamenti multipli Jalview. La

linea continua indica il dominio cold shock, C e H indicano i residui conservati di cisteina e istidi-

na del dominio a dita di Zinco. I diversi colori sono stabiliti dal programma Jalview in base alle

proprietà chimiche comuni dei residui amminoacidici terminali.

importante.

Se si inducono delle cellule di carcinoma embrionale umano o murino a die- renziare in senso neuronale (con acido retinoico), si può osservare un aumen- to dell'espressione di miR-125b e una contestuale diminuzione della proteina Lin-28 (Wu e Belasco, 2005; Sempere et al., 2004). Tuttavia, a dieren- za di quanto accade in C.elegans, l'espressione di lin-28 in questo modello sperimentale è regolata prevalentemente a livello trascizionale (Lee et al., 2005).

Alcuni degli mRNA direttamente regolati da Lin-28 sono stati isolati re- centemente in studio condotto su mioblasti murini indotti a dierenziare in miotubi (Polesskaya et al., 2007). Lin-28 è necessario al dierenziamento del muscolo scheletrico, come dimostrato riducendo l'espressione di Lin-28 con siRNA. Inoltre nel corso del dierenziamento il livello della proteina aumen- ta mentre quello di miR-125b diminuisce.

Gli autori hanno utilizzato la tecnica della co-immunoprecipitazione dei com- plessi contenenti Lin-28A, e poi hanno analizzato gli RNA e le proteine che li componevano tramite RT-PCR e spettrometria di massa. Lin-28 è associato ai polisomi e aumenta l'ecienza della sintesi proteica, aumentando la pro- babilità degli eventi di inizio per ogni molecola di mRNA; per questa sua attività è stato denito un enhancer della traduzione. I principali bersagli di Lin-28 sono gli mRNA di IGF-2, MyoD e Lin-28 stesso. IGF-2 è un fattore secreto importante nella miogenesi, poiché agisce in maniera autocrina per potenziare l'attività trascrizionale del gene master della miogenesi MyoD (Wilson e Rotwein, 2006). L'attività di Lin-28A in questo circuito aumenta la produzione delle proteine IGF-2 e di MyoD, e ciò è fondamentale poiché compensa la forte diminuzione dell'attività trascrizionale dei mioblasti in dierenziamento (Wilson et al., 2003; Wilson e Rotwein, 2006). E' interes- sante osservare che anche nei Vertebrati (almeno in questo esempio) lin-28 è necessario al dierenziamento e regola la traduzione di fattori insulin-like.

I fattori insulin-like sono stati associati al timing dierenziativo anche nello

sviluppo dell'occhio in Drosophila (Bateman e McNeill, 2004). Questi dati

suggeriscono che lin-28 potrebbe avere una funzione conservata anche nei

Vertebrati nella regolazione del timing dierenziativo.

Nrp-1, l'omologo di Musashi in Xenopus

Musashi è una proteina che lega l'RNA espressa specicamente nel siste- ma nervoso in sviluppo e conservata da Drosophila ai mammiferi. Questa proteina è caratterizzata da due domini di legame all'RNA detti RRM (RNA recognition motifs), che riconoscono specicamente la sequenza consensus (A/G)U 1−3 AGU nel 3'UTR degli mRNA bersaglio (Imai et al., 2001).

In Drosophila musashi (msi) è necessario alla specicazione del lineage neurale durante lo sviluppo delle setole sensitive, organi formati da una se- tola (bristle), una tasca (socket) e un neurone sensitivo. Il mutante msi ¹ è caratterizzato da una doppia setola, da cui il nome ¹ . Le setole sensitive si originano da un precursore (sensory organ precursor o SOP) che con una di- visione asimmetrica genera un progenitore non-neurale (IIa) e un progenitore neurale (IIb). Determinanti del destino neurale, come Numb (descritto più avanti), vengono segregati nel progenitore IIb. Il respressore trascrizionale tramtrack69 (ttk69 ) è necessario alla specicazione del lineage non-neurale, e viene espresso in IIa. In IIb invece l'espressione di ttk69 è inibita a livello traduzionale da Musashi. Musashi è espresso anche in IIa, ma la sua atti- vità è inibita probabilmente da vie di signalling. In moscerini mutanti per musashi i precursori SOP non riescono a dividersi in modo asimmetrico e si formano due progenitori IIa, quindi due setole. Questo è il primo esempio di divisioni asimmetriche controllate tramite la traduzione (Okabe et al., 2001;

Okano et al., 2002).

Nei Vertebrati esistono due omologhi di musashi, musashi-1 (Nrp-1 in Xenopus) e musashi-2 , con elevata omologia, espressione e funzioni simili (Okano et al., 2002). Questi geni sono espressi nel sistema nervoso in svi- luppo e nelle regioni di neurogenesi dell'adulto (Okano et al., 2002). Nel topo l'ablazione di musashi-1 durante lo sviluppo del sistema nervoso causa la perdita del pool delle cellule staminali neurali (Sakakibara et al., 2002).

Per questo motivo musashi è stato considerato un gene importante per il mantenimento della staminalità (Okano et al., 2005). Ad oggi sono stati

1

Musashi è un leggendario samurai giapponese che nei suoi combattimenti usava contempo-

raneamente due bokken (bastoni di legno) - da cui l'analogia con il fenotipo doppia setola del

mutante msi

.

caratterizzati pochi bersagli di Musashi. In cellule di mammifero è stato dimostrato che musashi-1 è in grado di inibire la traduzione di Numb (inibi- tore di Notch) e di p21 (inibitore del ciclo cellulare) legandosi al 3'UTR dei loro mRNA (Imai et al., 2001; Battelli et al., 2006).

E' stato inoltre dimostrato che Musashi-1 è in grado di attivare indiretta- mente Notch, proprio inibendo la traduzione di Numb (Imai et al., 2001).

Tuttavia è dicile interpretare il signicato funzionale dell'inibizione della traduzione di Numb da parte di Musashi-1. Infatti il ruolo di Numb nei Vertebrati resta controverso. In Drosophila e nei Vertebrati, Numb è una proteina citoplasmatica che viene segregata asimmetricamente durante le di- visioni neurogeniche dei progenitori. In Drosophila Numb lega il dominio intracellulare di Notch e ne induce l'endocitosi e la degradazione (Cayouette e Ra, 2002). Per quanto riguarda i Vertebrati, gli studi più recenti sug- geriscono che diverse forme di splicing di Numb siano coinvolte in diverse fasi della neurogenesi. All'inizio della neurogenesi, Numb è necessario al- la proliferazione dei progenitori: in topi mutanti per numblike (omologo di Numb) e knockout per numb il dierenziamento neurale viene anticipato e si formano meno neuroni a causa della riduzione della fase proliferativa dei progenitori. Successivamente Numb è invece necessario al dierenziamento neuronale, poiché inibisce l'attività Notch.

Nel corso della neurogenesi, Numb è distribuito in modo asimmetrico nel neuroepitelio, e quindi nei progenitori. A seconda dell'orientamento del pia- no di divisione cellulare, Numb può essere segregato in modo simmetrico o asimmetrico nelle cellule glie. Ad esempio nella retina di ratto Numb è con- centrato presso la supercie apicale del neuroepitelio. Nella fase proliferativa della retinogenesi il piano di divisione cellulare è orientato parallelamente alla supercie del neuroepitelio, Numb viene distribuito egualmente tra le cellule

glie e queste continuano a proliferare. Durante il dierenziamento, il piano

di divisione cellulare diventa perpendicolare alla supercie del neuroepite-

lio e Numb viene segregato asimmetricamente; le cellule che non ereditano

Numb dierenziano in glia di Müller (Fig.9).

Figura 9: Segregazione asimmetrica di Numb nel corso della retinogenesi. Modicato da (Cayouette et al., 2001).

Musashi-1 è espresso sia nelle cellule staminali neurali sia nei progenitori.

Se le funzioni principali di Musashi-1 nella neurogenesi sono dovute alla regolazione della traduzione di Numb, allora bisogna distinguere tra un ruolo precoce e un ruolo tardivo di questa RBP. Nelle cellule staminali neurali (ruolo precoce) Musashi-1 è necessario al mantenimento della staminalità, tramite l'attivazione di Notch e l'inibizione della traduzione di p21, come concluso da diversi studi. Ma durante il dierenziamento (ruolo tardivo), Musashi-1 è necessario nelle divisioni asimmetriche, dove potrebbe essere regolato diversamente nelle due cellule glie e potrebbe potenziare l'attività di Notch per la scelta tra neurogenesi e gliogenesi, proprio come accade nel SOP di Drosophila.

Nella retina di Xenopus Nrp-1 è espresso sia nei progenitori proliferanti sia in cellule postmitotiche, in particolare nello strato dei fotorecettori (cfr Amato et al. (2005) e questa tesi). Data l'elevata conservazione della funzione di Numb nei metazoi, è logico supporre che anche nei progenitori neurali di Xenopus Numb sia regolato traduzionalmente da Nrp-1 (ad oggi non è stato clonato l'omologo di numb in X. laevis, ma esiste un omologo di numb in X. tropicalis). Non è invece chiaro quale possa essere il ruolo di Nrp-1 nelle cellule post-mitotiche. E' possibile che in questo contesto Nrp-1 agisca su mRNA diversi da numb e p21 .

La possibilità che Nrp-1 regoli mRNA diversi da numb e p21 è sostenuta

da uno studio recente, che ha dimostrato che Nrp-1 è espresso negli oociti di Xenopus e che è coinvolto nella maturazione meiotica in risposta al pro- gesterone (Charlesworth et al., 2006). La corretta risposta al progesterone richiede l'attivazione della traduzione di diversi set di mRNA in una precisa sequenza temporale. Nrp-1 è necessario all'attivazione della traduzione de- gli mRNA precoci, come Mos (chinasi attivata dal progesterone), Eg/CDK2, Eg3, XBub3 (regolatori del ciclo cellulare), Notch e TATA-BP2. L'espressio- ne di un dominante negativo di Nrp-1 distrugge il timing della traduzione di questi mRNA e la maturazione meiotica non ha luogo (Charlesworth et al., 2006). Inoltre Musashi-1 è stato isolato in miociti murini complessato a com- plessi ribonucleoproteici traduzionalmente attivi (Polesskaya et al., 2007).

Questi dati indicano che musashi/Nrp-1 può agire in maniera contesto-

specica, che può fungere da attivatore o inibitore della traduzione e che

la sua attività può essere modulata da vie di signalling. I dati riportati

in letteratura suggeriscono che questa RBP probabilmente agisce in modo

diverso nelle diverse fasi della retinogenesi.