1. INTRODUZIONE ...6
1.1. I LINFOMI A CELLULE B ...7
1.2. IL DIFFERENZIAMENTO DELLE CELLULE B: IL CENTRO GERMINALE...9
1.3. LA LINEA CELLULARE DOHH2 ...11
1.3.1. La proteina BCL6 ...12
1.3.2. La proteina c-MYC ...14
1.3.3. L’apoptosi e la proteina BCL2 ...16
1.4. MICRORNA: ORIGINE E BIOSINTESI...18
1.4.1. microRNA: meccanismo d’azione ...20
1.4.2. Differenze miRNA-siRNA ...21
1.4.3. microRNA e cancro ...22
1.4.4.La proteina p53 e la sua regolazione sui miRNA ...24
1.4.5. miR-34 ...26
1.4.6.miR-145 ...30
1.5. LENTIVIRUS E VETTORI LENTIVIRALI...33
2. SCOPO DELLA TESI ...39
3. MATERIALI E METODI ...41
3.1. LINEE CELLULARI...42
3.2. ANALISI AL CITOFLUORIMETRO (FACS) ...42
3.3. TRASFEZIONE DEI SIRNA ...44
3.4. TRASFEZIONE DEI PLASMIDI PLENTI...45
3.5. ESTRAZIONE E QUANTIFICAZIONE DELL’RNA ...45
3.6. RETROTRASCRIZIONE A CDNA ...46
3.7. PCR QUANTITATIVA O QRT-PCR ...46
3.8. ESTRAZIONE E QUANTIFICAZIONE DELLE PROTEINE...49
3.9. ESTRAZIONE DEL DNA ...50
3.10.COLONY PCR ...51
3.11. ANALISI DELLA PROLIFERAZIONE CELLULARE...52
3.11.1.Conteggi cellulari ...52
3.11.2.Conteggi con Trypan Blue ...52
3.11.3.Saggio Celltiter AQueous one solution cell proliferation 53.... 3.12.GENERAZIONE DEI VETTORI LENTIVIRALI...53
3.12.1.Block-iT U6 RNAi Entry Vector kit ...54
3.12.2.BLOCK-iT™ Lentiviral RNAi Expression System ...57
3.13.CALCOLO DELL’EFFICIENZA DI CO-TRASFEZIONE DELLE CELLULE DI PACKAGING...59
3.14.TITOLAZIONE DEI VETTORI LENTIVIRALI...61
3.15. SELEZIONE STABILE IN BLASTICIDINA...62
3.16.ANALISI STATISTICHE...62
4. RISULTATI...64
4.1. LA PROTEINA BCL6 È SOVRAESPRESSA NELLE CELLULE DOHH2 ...65
4.2. SILENZIAMENTO TRANSIENTE DI BCL6 ...66
4.3. VERIFICA DELL’ESPRESSIONE DEL MIR-34A E -145 ...70
4.4. COSTRUZIONE DEI VETTORI LENTIVIRALI E LORO TITOLAZIONE ...73
2
4.4.1.Titolazione dei vettori lentivirali nella linea 293FT ...73
4.4.2.Titolazione dei vettori lentivirali nella linea DoHH2 ...74
4.4.3.Titolazione dei vettori in due linee di linfoma a cellule B 76... 4.5. SELEZIONE STABILE IN BLASTICIDINA...79
4.5.1. Saggi cellulari sulla popolazione selezionata stabilmente 83... 4.5.2. Espressione dei microRNA nelle cellule DoHH2 selezionate ... stabilmente 84 5. DISCUSSIONE...86
6. CONCLUSIONI E PROSPETTIVE...92
7. APPENDICI ...95
7.1. APPENDICE 1.SEQUENZE DEI SIRNA UTILIZZATI...96
7.2. APPENDICE 2: DS-OLIGO CLONATI NEL PLASMIDE PENTER ...97
7.3. APPENDICE 3: PRIMERS UTILIZZATI PER LA QRT-PCR ...98
8. BIBLIOGRAFIA...99
Riassunto
I linfomi sono una classe di tumori del tessuto linfoide (linfociti T, B e loro precursori) che rappresenta complessivamente il 5% dei tumori maligni. I più frequenti tipi di linfoma sono detti collettivamente linfomi delle cellule B (BCLs, B-Cell Lymphomas) e tra di essi si ritrovano vari tipi di neoplasie con differenti caratteristiche sia cliniche che molecolari.
Una tra le caratteristiche che contraddistinguono molti tipi di linfomi a cellule B è la sovraespressione della proteina BCL6, un regolatore trascrizionale con molteplici ruoli tra cui il differenziamento delle cellule B e la repressione della proteina tumor suppressor Tp53. La diminuzione di espressione di BCL6 ha prodotto, in linee di linfoma a cellule B, un arresto della crescita e una miglior risposta ad agenti ionizzanti.
Nella linea cellulare che noi abbiamo utilizzato come modello di studio (linea DoHH2 derivata da un linfoma follicolare) il silenziamento di BCL6 in seguito alla somministrazione di un siRNA (short-interfering RNA) provoca solo un minimo effetto sulla proliferazione cellulare. Ciò ci ha suggerito che nella cellula tumorale potessero esistere una serie di sistemi che le permettano di non risentire degli effetti derivanti dalla modificazione transitoria di un fattore di trascrizione come BCL6. Tra i modulatori dell’azione di BCL6 vi sono i microRNA -34a e -145, già noti in letteratura per il loro effetto tumor suppressor.
Lo scopo della tesi è stato quello di studiare il ruolo antiproliferativo di una espressione costitutiva dei microRNA-34a e -145 nella linea DoHH2. A tal fine si è proceduto alla costruzione di un set di vettori lentivirali adattati per consentire l’espressione di ognuno dei miRNA selezionati nelle cellule DoHH2.
I risultati ottenuti suggeriscono che, anche in questa linea cellulare, i due miRNA abbiano un ruolo antiproliferativo. Le cellule trasdotte con i vettori
4
lentivirali codificanti i miRNA infatti subiscono un forte rallentamento della crescita rispetto alle cellule di controllo.
In futuro ci proponiamo di identificare i geni la cui espressione risulta controllata da questi microRNA al fine di chiarire i meccanismi molecolari mediante i quali esplicano la loro attività antiproliferativa. La conoscenza dei meccanismi di azione risulta particolarmente importante soprattutto in prospettiva di un eventuale uso terapeutico di queste molecole.
