β-gal solution (10 ml)
C6FeK3N6 32.93 g
C6FeK4N63H2O 21.74 g
Salmon-gal 100 µl
Tampone fosfato fino a volume
2.5.c Ibridazione in situ “whole mount”
(Sive et al., 2000)
L’ibridazione attraverso la tecnica di “whole mount” permette di studiare il pattern d’ espressione di un gene durante lo sviluppo embrionale di Xenopus
laevis oppure di verificare l’alterata espressione dei geni di interesse. Gli
esperimenti svolti in questa tesi sono stati condotti seguendo il protocollo di Sive et al., 2000.
Durante l’esperimento gli embrioni si trovano in tubi (“vials”) “RNase free” (RF). La vetreria per essere RF viene tenuta in stufa per almeno 4 ore. Anche l’acqua e tutte le altre soluzioni utilizzate nell’ibridazione dovranno essere RF e quindi saranno sterilizzate in autoclave.
Tutti i passaggi, se non diversamente indicato sono eseguiti sistemando le “vials” in orizzontale su un agitatore, aggiungendo e rimuovendo ogni volta 5 ml di soluzione
Procedura di ibridazione
Gli embrioni, che sono conservati in metanolo assoluto (100%), vengono gradatamente reidratati passandoli, a temperatura ambiente, in una serie decrescente di alcoli tramite lavaggi di 5 minuti in ciascuna delle soluzioni indicate:
metanolo 75%, PBTw 25% metanolo 50%, PBTw 50% metanolo 25%, PBTw 75%
Vengono poi effettuati 2 lavaggi da 5 minuti in PBTw 100%.
Dopo l’ultimo lavaggio in PBTw gli embrioni sono trattati per 5 minuti a T ambiente con una soluzione di 10 µg/ml di proteinasi K in PBTw. Durante questi 5 minuti le “vials” sono mantenute in posizione verticale, immobili. Questo passaggio è molto delicato e la sua durata deve essere controllata con precisione in quanto che una permanenza troppo lunga in questa soluzione potrebbe danneggiare gli embrioni. Si lava 2 volte per 1 minuto con PBTw, sull’agitatore in posizione verticale, sempre a T ambiente.
In agitazione verticale, gli embrioni vengono fissati in 4 % paraformaldeide ( 4 ml di PBS +1 ml di 20% paraformaldeide) a T ambiente. Gli embrioni vengono poi lavati brevemente 2 volte con PBTw, seguono 4 lavaggi di 5 minuti ciascuno ( le vials sono nuovamente collocate sull’ agitatore in posizione orizzontale).
Si rimuovono quindi il PBTw da ogni tubo e lo si sostituisce con una soluzione costituita al 50 % da miscela di ibridazione e al 50% da PBS, disponendo i tubi sull’ agitatore verticalmente per 3 minuti: questo passaggio è necessario per abituare gli embrioni alla nuova densità della miscela di ibridazione. Si ripete il passaggio utilizzando una soluzione composta al 100% da miscela di ibridazione, trascorsi i 3 minuti, sostituire con della nuova
miscela di ibridazione, trattare gli embrioni per 2-3 ore a 60 °C (questo passaggo prende il nome di preibridazione).
Segue la fase di ibridazione in cui sostituiamo il tampone di preibridazione con 0.6 ml di nuovo tampone ( uguale in composizione al precedente) a cui si è aggiunta la sonda marcata con digossigenina o fluoresceina; utilizzando una quantità variabile di RNA probe (50-350 ng), precedentemente denaturato per 2 minuti a 95°C.
Si aggiunge infine 0.6 ml di miscela di ibridazione. L’ibridazione dura 12-16 ore a 60°C.
Una volta rimosso, il tampone di ibridazione contenente la/le sonda/e può essere conservato e riutilizzato fino a due/tre volte.
A questo punto è necessario lavare l’eccesso di sonda non ibridata o ibridata in maniera aspecifica; a tale scopo si effettuano lavaggi a forza ionica decrescente, per aumentarne la stringenza, tenendo però presente che è importante aggiungere le soluzioni preriscaldate alla temperatura del lavaggio corrispondente.
Si sostituisce con 1 ml di soluzione composta al 50 % da 2X SSC/0.1 X CHAPS preriscaldato a 37 °C, 10 minuti a temperatura ambiente in agitazione verticale. Seguono quindi 2 lavaggi da 30 minuti ciascuno a 60 °C con 0.2 x SSC/0.1X CHAPS, preriscaldato. Prima di iniziare la procedura di incubazione con anticorpo, si lava 5 minuti a T ambiente, in agitazione verticale, con TBSx. Segue una preincubazione di 2 ore a 4 °C in agitazione orizzontale, in blocking buffer. Si incuba poi per 4 ore a T ambiente o a 4 °C o/n con anticorpo anti-DIG diluito in blocking buffer preincubato precedentemente, anch’esso 2 ore a 4 °C. Il blocking buffer è una soluzione di TBSx + reagente bloccante 2 % + siero di pecora 15 %+ estratto di uova 5 %; (l’utilizzo dell’ estratto di uova riduce il segnale aspecifico).
Per rimuovere l’eccesso di anticorpo si procede con 5 lavaggi a temperatura ambiente di 1 ora ciascuno, di cui uno effettuarsi a 4 °C o/n con TBSx.
Seguono quindi 2 lavaggi di 5 minuti a temperatura ambiente con il tampone per la fosfatasi alcalina (APB buffer) a cui si aggiunge levamisol (inibitore delle fosfatasi endogene ).
A questo punto si aggiunge la soluzione di rivelazione più opportuna; in questo lavoro di tesi il substrato della fosfatasi alcalina piu’ utilizzato è il BM-purple che si trova in forma liquida pronta per l’ utilizzo, la cui reazione cromogenica porta ad una colorazione blu intenso.
La fosfatasi alcalina coniugata con l’anticorpo scinde il substrato cromogenico (BM purple) generando il prodotto colorato che rende possibile evidenziare la zone in cui la sonda si è ibridata e dove il gene in esame si è espresso. Si usano 0.5-1 ml per “vial” a T ambiente fino a quando la colorazione non è soddisfacente (da 1 ora a 7 giorni). La reazione deve avvenire al buio per cui i tubi devono essere coperti da un foglio di alluminio. Una volta che la reazione cromogenica è terminata si rimuove il tampone per la fosfatasi alcalina e si fissano gli embrioni per almeno 1 ora con MEMFA (oppure O/n a 4°C) per stabilizzare la colorazione. Gli embrioni così fissati possono essere conservati in metanolo a -20 °C
Soluzioni: PBS (per 1 litro) NaCl 80g KCl 2g Na2HPO4 15.56g KH2PO4 2 g
TBS (per 1 litro) NaCl 80 g KCl 2 g Tris base 30 g PBTw PBS 1X Tween-20 0.1% TBSx TBS 1X Triton X-100 0.1% Soluzione di paraformaldeide
Si può preparare lo stock di paraformaldeide al 20 % che si conserva in frigo a 4 °C per diversi mesi. Si scioglie la paraformaldeide in acqua RF ad una temperatura di 60 °C e si chiarifica aggiungendo 10 µl di NaOH 10N in 100 ml di paraformaldeide. Quando la soluzione è diventata limpida si lascia raffreddare, si porta a volume con acqua distillata e si filtra con carta 3 MM. Al momento dell’ uso si diluisce la paraformaldeide così preparata con PBS.
Tampone di ibridazione: Formammide 50% SSC 5X RNA di morula 1 mg/ml Eparina 100µg/ml Denhart’s 1X Tween-20 0.1% CHAPS 0.1%EDTA 10mM APB: Tris 100 mM Ph 9.5 MgCl2 50mM NaCl 100mM Depigmentazione (“bleaching”)
La depigmentazione è una tecnica che si utilizza per distinguere meglio la marcatura,e che consiste nel depigmentare gli embrioni con perdita minima di segnale.
A questo scopo è necessario lavare gli embrioni per minuti con MtOH 100% segue un lavaggio di 5 minuti con MtOH 70% e infine si lava con una soluzione composta di 50% MtOH e 0.5X SSC.
Si passano quindi gli embrioni nella soluzione depigmentante, contenente 0.5X SSC, 1% H2O2, 5% Formammide, lasciando i tubi sull’ agitatore e sotto una lampada fluorescente per circa 1-2 ore. A questo punto gli embrioni vengono lavati per 5 minuti con MtOH 70% e poi trasferiti in MtOH assoluto a -20°C.
