CAPITOLO 3 FITOCHIMICA Rhus coriaria L.
3.1 Composizione frazione volatili e olii essenziali
Lo studio della composizione delle frazioni volatili e degli olii essenziali viene effettuato generalmente su piante prettamente aromatiche. Nel caso del Rhus coriaria sono stati trovati pochi studi di letteratura scientifica su tale argomento, in quanto la pianta non è aromatica e quindi produce quantità esigue di olii essenziali e di volatili.
Nel primo studio di Kurucu et al. effettuato nel 1993 sono stati ottenuti gli olii essenziali, separatamente dalle foglie, dai frutti e dalla corteccia dei rami di Rhus coriaria, raccolto in Turchia in due differenti regioni fitogeografiche: Mersin-Mut (regione Mediterranea) ed Artvin (regione Eurosiberiana), mediante idrodistillazione e sono stati analizzati per GC e GC/MS (Kurucu et al., 1993). Le rese in O.E. sono state piuttosto scarse: a Mersin dello 0.3% per il pericarpo e per le foglie e dello 0.4% per la corteccia dei rami; a Artvin dello 0.1% per il pericarpo e per le foglie e dello 0.3% per la corteccia dei rami. Sono state messe in evidenza differenze nella composizione percentuale tra le due regioni fitogeografiche:
• I maggiori costituenti del pericarpo dei frutti sono stati: nonanale (10.77%)[I],
Z-2-decenale (9.90%), limonene (9.49%)[II], cembrene (6.35%) [III] per Artvin;
mentre Z-2-decenale (42.35%)[IV], nonanale (13.09%) per Mersin.
• Delle foglie invece β-caryophyllene (16.95%)[V], cembrene (7.77) (Artvin)
patchoulane (23.87%) [VI] (Mersin)
• Dei rami: β-caryophyllene (12.35%), cembrene (26.50%) (Artvin)
Più recentemente è stato analizzato l’olio essenziale dei frutti di Rhus coriaria raccolti nella regione di Diyarbakir, situata nel sud-est della Turchia nell’anno 2003 (Bahar and Altug, 2009).
I composti volatili sono stati isolati usando tre diverse tecniche: estrazione liquido-liquido, estrazione supercritica SC-CO2 e la tecnica di idrodistillazione. La nostra attenzione si è
soffermata su quest’ultima tecnica, in quanto utilizzata nel nostro laboratorio di Fitochimica. L’idrodistillazione è stata effettuata su un campione di 50 g di Summac polverizzato e la resa in O.E. è stata del 51%; sono stati individuati 17 composti. Per l’analisi è stato usato un gas-cromatografo Perkin Elmer Autosystem, dotato di una colonna capillare 5MS (tabella 3.1).
Tabella 3.1
Il composto più abbondante è risultato essere l’Acido Malico con il 13.86% [VIII], seguito dal 28.52% di β-cariophyllene e 4.96% di cembrene.
Nel 2013 la letteratura scientifica riporta l’analisi dell’olio essenziale delle parti aeree polverizzate di Rhus coriaria, raccolta nella provincia di Khorasan in Iran nell’agosto-settembre del 2009, utilizzando il metodo estrattivo MAE (estrazione assistita con microonde) ed il gas-cromatografo Varian 3400, equipaggiato con colonna capillare DB5(Gharaei et al., 2013). La resa dell’olio essenziale è risultata del 13.5% (w/w) ed i 21 componenti identificati sono risultati complessivamente l’86.6%. Tra questi i maggiori componenti (in % superiore al 4%) sono risultati essere: p-cymene [IX], α-terpinene [X],
limonene, β-caryophillene, δ-cadinene [XI], cembrene. Tra questi in più alta % abbiamo: il β-caryophillene con il 30.7% ed il cembrene con il 21.4%.
[I] nonanale [II] limonene [III]cembrene [IV]Z-2-decenale [V] β-caryophyllene
[VI] patchoulane [VII] α-pinene
HO OH O O OH
[VIII] Acido Malico [IX] p-cymene
3.2 Composizione degli estratti
Gli studi fitochimici sul genere Rhus presenti in letteratura hanno evidenziato la presenza di alcune classi di metaboliti secondari, quali:
• FLAVONOIDI (tra cui antociani) • TANNINI (in particolare gallotannini) • ACIDI ORGANICI (tra cui acidi grassi) • CONTENUTI MINERALI
• POLIISOPRENOIDI
I gallotannini sono stati identificati particolarmente nelle foglie; mentre i frutti sono risultati ricchi di acido linoleico, vitamine e minerali. Inoltre sono presenti i seguenti metaboliti primari:
• VITAMINE • AMMINOACIDI
Inizialmente è stata analizzata un’approssimativa composizione dei frutti, maturi ed essiccati, di Summac siriano (Rhus coriaria), mettendo in evidenza un’elevata presenza di fibre e grassi, le prime importanti per alleviare disturbi gastro-intestinali. Successivamente è stata riscontrata un’alta percentuale di minerali, vitamine ed acidi organici (Kossah et al., 2009).
3.2.1 Contenuto minerale
Lo studio del contenuto minerale del Summac ha rilevato un elevato contenuto di Al (620 ppm), Ca (9576 ppm), Fe (695.13 ppm), Mg (2330 ppm), N (51.3 ppm), P (391 ppm), S (494 ppm) (Ozcan, 2003). Questa elevata percentuale di minerali è stata confermata da studi successivi effettuati sempre sui frutti di Summac (siriano), mettendo in evidenza la prevalenza del K (7441.25ppm) e del Ca (3155.53ppm); seguono poi Mg (605.74 ppm) e P (327.70 ppm). Altri minerali essenziali per la dieta presenti sono: Fe (174 ppm), Zn (55.74ppm), Cu (42.68 ppm). Si evince quindi che tali frutti possono essere utilizzati nella dieta umana, come supplemento ai minerali essenziali (Kossah et al., 2009).
3.2.2 Acidi organici
La presenza di acidi organici è importante, in quanto è proprio l’acidità una delle caratteristiche più importanti del Rhus coriaria, che infatti viene utilizzata soprattutto in Medio Oriente come condimento per insaporire i cibi, al posto del nostro limone. Tra gli acidi che sono stati identificati ci sono:
Acidi bicarbossilici
Mavlyanov et al. nel 1997 hanno trovato nei frutti di Rhus coriaria un’alta percentuale dei seguenti acidi: malico, citrico[I], fumarico[II], tartarico[III] (Mavlyanov et al., 1997). Il 25% del contenuto totale di acidi organici di gran parte delle specie di Rhus è costituito da acido malico (Kossah et al., 2009).
Acidi grassi
(acidi monocarbossilici alifatici)
Nel 2005 sono stati analizzati quattro diversi campioni di Summac, proveniente dal sud-est dell’Anatolia. In tale studio sono stati identificati i seguenti acidi grassi: acido oleico [IV],
linoleico[V] e palmitico [VI], evidenziando un contenuto di acidi grassi totale abbastanza
basso. Studi successivi, effettuati sempre sui frutti maturi ed essiccati di Summac (ma di provenienza siriana), hanno invece rivelato una percentuale elevata di acidi grassi insaturi pari a 69.28% , dei quali acido oleico e linoleico rappresentano i composti principali (36.95% e 30.38%, rispettivamente). Questo valore risulta molto più elevato rispetto alla percentuale totale degli acidi grassi saturi, costituiti principalmente da palmitico, presente al 27.41% presenti nel lavoro di Kossah et al. (Kossah et al., 2009).
O
O
OH HO
[III] acido tartarico
[IV] acido oleico
[V] acido linoleico
3.2.3 Polifenoli
Nel 2010 è stato effettuato uno studio per ottimizzare l’estrazione dei polifenoli dai frutti maturi ed essiccati di Rhus coriaria, raccolti in Siria, tenendo di conto di diversi parametri di estrazione, quali:
-la concentrazione di etanolo in acqua, il cui valore ottimale è risultato 20%v/v;
-la temperatura di estrazione (40°C; se aumenta si è visto una rapida diminuzione, dovuta alla degradazione di alcuni composti fenolici);
-il diametro delle particelle (1,0 mm);
-il rapporto solvente/Summac (15mL/1g-1, una quantità più elevata di solvente potrebbe provocare una diminuzione del contenuto polifenolico, dovuta alla conseguente ossidazione)
-infine il tempo di estrazione (1h; caratteristico soltanto del Rhus coriaria) (Kossah et al., 2010).
Flavonoidi
Nelle foglie di Rhus coriaria già nel 1988 è stata riscontrata la presenza di composti polifenolici nella percentuale di 15-20% (Van Loo et al., 1988). La maggior parte di questi risulta essere costituita da tannini idrosolubili, con un’unità centrale di glucosio, a cui sono legati residui di acido gallico (gallotannini), chiamati anche “Summac tannic acid” e flavonoidi. Tra questi ultimi sono stati identificati flavonoli quali: miricetina [I],
quercetina [II] e kaempherolo [III]; ma anche: agathisflavone [IV], amenthoflavone [V], hinokiflavone [VI] ed un nuovo flavonoide dimerico: il sumaflavone [VII]. I flavonoidi
principali dell’estratto sono stati separati usando la cromatografia liquida (LC) e sono state identificate attraverso tecniche spettroscopiche. Anche dai frutti freschi di Rhus coriaria prelevati in Cina nella provincia di Anhui, , è stata riscontrata una notevole quantità di flavonoidi dopo trattamento con Steam Explosion (Chen and Chen, 2011). Tale tecnica consiste nell’uso di vapore saturo ad alta pressione per scaldare rapidamente la biomassa in un reattore. I frutti di Summac sono stati esposti ad una temperatura di 200̊ per 5 minuti. Durante tale processo la quercitrina [VIII], (detta anche quercetina-3-O-ramnoside, il glicoside principale di tali frutti) è stata deglicosilata (privata del ramnosio) e convertita in
quercetina (il flavonoide corrispondente). Siccome tale processo ha causato la riduzione
del calibro ed ha portato alla formazione di grandi fessure e micropori sul rivestimento dei frutti, i frutti sono stati seccati, messi in un mortaio con pestello e quindi schiacciati e successivamente setacciati in quattro diverse grandezze. Successivamente sono stati eliminati i pigmenti e l’olio attraverso estrazioni ripetute con il Soxhlet, usando etere di petrolio. La soluzione è stata poi filtrata, dopodiché è stato determinato il contenuto totale di flavonoidi, usando uno spettrofotometro. Lo studio del processo cinetico ha dimostrato che la resa dei flavonoidi dei frutti di Rhus coriaria, che hanno subìto Steam Explosion, è aumentata di otto volte rispetto al campione naturale; ciò è dovuto all’effetto di tale tecnica sulla dimensione delle particelle: la Steam Explosion, riducendo il diametro dei frutti (per la degradazione di alcuni composti, quali pectine ed emicellulose), aumenta la superficie specifica del materiale, permettendo un’estrazione efficiente dei flavonoidi con resa finale più elevata.
Gli studi fitochimici si sono rivolti soprattutto alla composizione degli estratti più polari e a fonti della pianta diverse dai frutti. Dalle foglie di Rhus coriaria, raccolte ed essiccate, presso San Cataldo (Sicilia) nel Settembre 2009 è stato ottenuto un estratto acquoso (Regazzoni et al., 2013), che dopo purificazione ha portato all’isolamento di: diversi gallotannini, da mono- a deca- galloglicosidi, appartenenti alla classe di tannini idrolizzabili e derivati flavonoidi, incluso: quercitrina (quercetina-3-O-ramnoside),
glucoside [IX], glucuronide [X] e miricetina-3-O-ramnoglucoside [XI].
R1 R2 R3
[I] miricetina -OH -OH -OH
[IX] miricetina -OH -OH -O-glucoside
[X] miricetina -OH -OH -O-glucuronide
[XI] miricetina -OH -OH -O-ramnoglucoside
[II] quercetina -OH -H -OH
[VIII] quercetina -OH -H -O-ramnoside
[IV] agathisflavone
[VI] hinokiflavone
Antociani
Gli antociani sono pigmenti idrosolubili, appartenenti alla famiglia dei flavonoidi. Nel 1997 dai frutti di Rhus coriaria furono isolate le seguenti antocianine: chrysantemina (cianidina-3-β-D-glucoside) [III], mirtillina (delfinidina-3-β-D-glucoside)[II] e delfinidina [I] (Mavlyanov et al., 1997).
R R1
[I] delfinidina -H -OH
[II] mirtillina -3-O-glucoside -OH [III] chrysantemina -3-O-glucoside -H
Tannini
I gallotannini sono i cosiddetti tannini idrolizzabili (assieme agli ellagitannini), costituiti nella parte centrale da un nucleo di D-glucosio, i cui gruppi ossidrilici sono totalmente o parzialmente esterificati con acidi fenolici. Sono detti idrolizzabili in quanto hanno la proprietà di idrolizzarsi, in ambiente acido o debolmente basico, e liberare zucchero ed acidi fenolici (Morelli et al., 2005).
Acido gallico
R=R1=R2=R3=R4=H (glucosio) acido gallico
R=R1=R2=R3=R4=galloile (gallotannini)
Già nel 1987 furono identificati gallotannini nelle foglie del Summac. Fu utilizzato un ceppo di Aspergillus niger, il quale, producendo tannasi, ha la capacità di idrolizzare i gallotannini di Rhus coriaria, favorendo la conversione quantitativa del 98% dei gallotannini in acido gallico puro (Pourrat et al., 1987). Nel 2002 è stata studiata l’estrazione di gallotannini dalle foglie di Summac e le migliori condizioni estrattive sono risultate essere: la macerazione delle foglie in acqua a 45 °C per 60 minuti senza agitazione. Fu progettato uno strumento che simulasse la tecnica estrattiva counter-current (un metodo di estrazione multipla liquido-liquido, che permette la separazione di sostanze con diverso coefficiente di distribuzione); successivamente i costituenti dell’estratto sono stati analizzati attraverso la cromatografia liquida-HPLC, con cui sono stati identificati ben otto gallotannini: penta-, esa-, epta-,octa-, nona-, deca-, undeca- e dodecagalloil glucosio derivati (Zalacain et al., 2003).
Nel 2009 sono state analizzate le strutture di ben sei tannini idrolizzabili, tra cui quelle del Summac, attraverso la tecnica MALDI-TOF-MS: desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice, abbinata ad uno spettrometro di massa, dotato di un analizzatore a tempo di volo. In questo modo sono state così definite le loro strutture oligomeriche (Pizzi et al., 2009).
Da questo studio è emerso che gli oligomeri dei tannini dei vari estratti presentavano, come struttura comune, uno “scheletro” di glucosio; che fu osservato grazie al fatto che fu spogliato dei residui gallici, mettendo in evidenza il legame zucchero-zucchero. In particolare è stato analizzato l’estratto delle foglie di Summac.
Pizzi et al. videro che l’estratto tanninico commerciale del Summac è costituito da tre tipi di oligomeri, caratterizzati da una complessa struttura con 13 unità di glucosio, a cui sono collegati residui gallici o digallici.
3.2.4 Poliisoprenoidi
Dall’estratto con benzina delle foglie di Rhus coriaria essiccate (200g), usando la tecnica di HPTLC, si è ottenuto un contenuto totale di poliisoprenoidi (PPs) di 63.1g, corrispondente al 2.2-2.5% della massa iniziale. I prenoli con n=10-13 sono i più presenti; tra essi l’undecaprenolo (n=11) è il maggior costituente. Attraverso poi la GC-MS le sostanze importanti individuate sono state: l’α-tocoferolo (6.93%) ed, in minore percentuale, componenti del tocoferolo mannoside (0.13%), farnesilacetato (0.18%), pentadecanale (0.10%) ed hexadecanale (0.08%) (Mamatkulova et al., 2012).
3.2.5 Vitamine
Dall’analisi dei frutti maturi ed essiccati di Summac siriano (Rhus coriaria) sono state individuate le seguenti vitamine: la più abbondante è risultata la piridossina (B6) (69.83%),
a seguire l’acido ascorbico (38.91%), la tiamina (B1) (30.65%) e la riboflavina (24.68%).
Sono state identificate anche: la cianocobalamina (B12) (10.08%), la nicotinamide (PP)
(17.95%) e la biotina (H) (4.32%) (Kossah et al., 2009).
3.2.6 Amminoacidi
Inoltre, dall’analisi dei frutti maturi ed essiccati di Rhus coriaria sono stati individuati diciotto amminoacidi, compresi gli otto amminoacidi essenziali:
-amminoacidi essenziali: leucina, isoleucina, lisina, metionina, treonina, fenilalanina,
valina e triptofano;
-amminoacidi non essenziali: arginina, istidina, cisteina, acido aspartico, acido
