Ruolo di DjPHB2 nel mantenimento delle cellule
staminali di planaria
(Lavoro in preparazione)
Isolamento del gene DjPHB2 e analisi della sua espressione
In questo lavoro di dottorato è stata studiata anche la funzione del gene proibitina di planaria, a partire dalla sequenza di un clone EST già disponibile in banca dati (numero di accesso Gene Bank: Gi32904098), identificato in un precedente studio di microarray (Rossi et al., 2007). Prima di tutto è stata completata la sequenza di questo clone attraverso la metodica 3’-5’ RACE (Fig. 2.23). Il gene codifica per una proteina putativa in cui si ritrova una regione centrale (amminoacidi 37-216) altamente conservata corrispondente al dominio SPFH, appartenente alla Band 7 Family, di cui fanno parte, oltre alle proibitine, stomatine, proteine citoplasmatiche antiproliferative e proteine batteriche HflC (Nijtmans et al., 2002) (Fig. 2.24). La presenza del dominio SPFH è un ulteriore dato che permette di classificare il gene DjPHB2 come nuovo membro della famiglia delle proibitine. Utilizzando il programma tblastx, disponibile in rete, è stata messa in evidenza una forte omologia di sequenza a livello amminoacidico (>80%) con proteine PHB2 di altri organismi. Tra le sequenze presentanti un maggiore grado di omologia con DjPHB2, vi sono quelle isolate in Xenopus laevis, Mus musculus e Danio
rerio (Fig 2.25).
Una volta terminato lo studio sulla sequenza, sono stati affrontati studi di espressione genica. Dati precedenti, ottenuti dall’utilizzo della metodica della PCR real time (Rossi et al., 2006), indicavano che DjPHB2 fosse espresso a livello dei neoblasti. Allo scopo di analizzare in maniera più approfondita l’espressione di DjPHB2, sono stati condotti esperimenti di ibridazione in situ whole mount sia in animali intatti che in rigenerazione.
Negli animali intatti la distribuzione delle cellule che esprimono DjPHB2 è paragonabile alla localizzazione delle cellule esprimenti il gene DjMCM2. Infatti, le cellule esprimenti DjPHB2 si ritrovano accumulate lungo il cordone centrale dorsale, in cluster laterali dorsali e sparse all’interno del parenchima (Fig. 2.26B).
Allo scopo di analizzare l’espressione del gene durante la rigenerazione, gli animali sono stati amputati sopra e sotto il faringe, sono stati fissati a vari tempi dal taglio e
dell’espressione durante la rigenerazione ha rivelato che ad 1 giorno dal taglio, l’espressione di DjPHB2 è evidenziabile al di sotto dell’epitelio; a 3 giorni dal taglio,
DjPHB2 è espresso nelle cellule del blastema rigenerativo; successivamente DjPHB2 è
espresso nella regione che sta rigenerando (Fig. 2.26C). Confrontando l’espressione di
DjPHB2 con quella di DjMCM2 durante la rigenerazione, appare evidente la diversa
localizzazione di questi due marcatori di neoblasti: DjPHB2 è chiaramente espresso a livello del blastema rigenerativo, a differenza di DjMCM2, la cui espressione è limitata alla zona del post-blastema (dati non mostrati).
5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGGGCATTTTTTGAAAAAAAAATTCAACACGCCATTGCTT CATGGATTTAAAAAATGTAGCTAATTCTTTTATGGGTAAAGGTAGTCCCAAAGGGTTGGGTGCGATGTTA ATAGGAGGTGGTCTTATATTTGGATTAACTAAGGCATTTTATACAGTTGATGGTGGTCAAAGAAGTATTA TTTTTAGTCGATTTGGTGGGATTAAAGAAAACATTTATGCTGAAGGACTTCATTTTAGAATTCCTGGTAT ACAATATCCCATCATTTTCGATGTGAGATCTCGTCCAAGAATAATTTCTTCTCCAACTGGAAGCAAAGAT TTACAAATGGTGAATATTTCTCTGAGAGTACTTAGTAGACCAGATATATTAAAAATTCCTGACATATACA GAAATCTCGGTGAAGATTACGACGAAAGAGTTCTGCCTTCAATATCAAATGAAGTTTTAAAAGCCGTTGT CGCTAAATTTAATGCCGGACAATTAATTACACAAAGAGAACAAGTTTCTCTGCTTATTCGGAAACTATTA ATTGAAAGAGCTAAAGATTTTAACATAATCGTTGATGATGTTTCAATTACTGATTTATCGTTTTCTAAAC AATACGGCGAAGCAGTCGAAAGAAAACAGATTTCTCAACAAGAAGCTCAGCGAGCCCAATTTACTGTAAT GCGAGCAAAACAAGAAAGACAACAGAAAATAGTCAATGCCGAAGGAGAAGCGCAAGCTGCAATATTGATC GGTGATGCTTTGTCAGCGAATTCAGGATATTTGAAATTGAGAAAAATAAAAGCATCAGAGAAAATCGCAA GAACGCTGTCAACAGCTCAAAACAGAGCTTATTTAAATGCGAATACATTGATGATGAACATCAATGAAAA AGAATTCAACGATTCAGTCGACAGAGTAGTGAAAAAGAAGTAAGATCGTAAAGTTGGGAAAGTTTTTGTA GTGTTGTTCGAATAAAATAAAGTTTAGAATTTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAA3’
Fig. 2.23: Sequenza nucleotidica ricavata dal sequenziamento degli amplificati derivanti dalla 3’-5’RACE. In grassetto: ATG codone di inizio (Met) e TAA codone di terminazione. MDLKNVANSFMGKGSPKGLGAMLIGGGLIFGLTKAFYTVDGGQRSIIFSRFGGIKENIYAEGLHFRIPGI QYPIIFDVRSRPRIISSPTGSKDLQMVNISLRVLSRPDILKIPDIYRNLGEDYDERVLPSISNEVLKAVV AKFNAGQLITQREQVSLLIRKLLIERAKDFNIIVDDVSITDLSFSKQYGEAVERKQISQQEAQRAQFTVM RAKQERQQKIVNAEGEAQAAILIGDALSANSGYLKLRKIKASEKIARTLSTAQNRAYLNANTLMMNINEK EFNDSVDRVVKKK
Fig. 2.24: Sequenza della proteina putativa codificata da DjPHB2, costituita da 293 amminoacidi. In rosso sono indicati gli aminoacidi che costituiscono il dominio SPFH (37-216).
10 20 30 40 50 60 | | | | | | Xlaevis ---MAQNLKDFAGRLPAGPRGMGTAMKLLLGAGAVAYAVKES
Mmusculus ---MAQNLKDLAGRLPAGPRGMGTALKLLLGAGAVAYGVRES
Drerio ---MASKDPGNFLQQLRQIASRMGSGPRGAGLGVKLLIGAGALAYGVKEA
Djaponica KQWYQRRVRGGIFXKKNSTRHCFMDLKNVANSFMG--KGSPKGLGAMLIGGGLIFGLTKA
:*::.*. : . :* .: :: .*.: :.: ::
Prim.cons. KQWYQRRVRGGIF22222222MAQNLKD4AGRLPAGPRGMGT2LKLLLGAGA2AYGVKE2 70 80 90 100 110 120 | | | | | | Xlaevis VFTVEGGHRAIFFNRIGGVQQDTILAEGLHFRFPWFQYPIIYDIRARPRKISSPTGSKDL
Mmusculus VFTVEGGHRAIFFNRIGGVQQDTILAEGLHFRIPWFQYPIIYDIRARPRKISSPTGSKDL
Drerio TYTVEGGQRAVIFSRIGGMQMDTVLAEGLHFRMPWFQYPIIYDIRARPRKISSLTGSKDL
Djaponica FYTVDGGQRSIIFSRFGGIKEN-IYAEGLHFRIPGIQYPIIFDVRSRPRIISSPTGSKDL
:**:**:*:::*.*:**:: : : *******:* :*****:*:*:*** *** ******
Prim.cons. V2TVEGG2RAI2F2RIGGVQQDTILAEGLHFRIPWFQYPIIYDIRARPRKISSPTGSKDL 130 140 150 160 170 180 | | | | | | Xlaevis QMVNITLRVLSRPLASELPFMYQRLGLDYDERVLPSIVNEVLKSVVAKFNASQLITQRAQ
Mmusculus QMVNISLRVLSRPNAQELPSMYQRLGLDYEERVLPSIVNEVLKSVVAKFNASQLITQRAQ
Drerio QMVNIGLRVLSRPVASQLPIMYQQLGKDYDERVLPSIVNEVLKSVVAKFNASQLITQRAQ
Djaponica QMVNISLRVLSRPDILKIPDIYRNLGEDYDERVLPSISNEVLKAVVAKFNAGQLITQREQ
***** ******* ::* :*:.** **:******* *****:*******.****** *
Prim.cons. QMVNISLRVLSRP4ASELP4MYQRLGLDYDERVLPSIVNEVLKSVVAKFNASQLITQRAQ 190 200 210 220 230 240 | | | | | | Xlaevis VSLLIRRELTERAKDFSIILDDVAITELSFSREYTAAVESKQVAQQEAQRAQFLVEKAKQ
Mmusculus VSLLIRRELTERAKDFSLILDDVAITELSFSREYTAAVEAKQVAQQEAQRAQFLVEKAKQ
Drerio VSLLIRRDLIERAKDFNIILDDVAITELSFSKEYTAAVEAKQVAQQEAQRAQFFVEKAKQ
Djaponica VSLLIRKLLIERAKDFNIIVDDVSITDLSFSKQYGEAVERKQISQQEAQRAQFTVMRAKQ
******: * ******.:*:***:**:****::* *** **::********* * :***
Prim.cons. VSLLIRREL2ERAKDF2IILDDVAITELSFS2EYTAAVEAKQVAQQEAQRAQFLVEKAKQ 250 260 270 280 290 300 | | | | | | Xlaevis DQKQKIVQAEGEAAAAKMIGDALSKNPGYLKLRRIRAAQSIAKTIASSQNRVYLNADSLV
Mmusculus EQRQKIVQAEGEAEAAKMLGEALSKNPGYIKLRKIRAAQNISKTIATSQNRIYLTADNLV
Drerio DQRQKIIQAEGEAEAAKMLGQAVTKNPGYLKLRRIRAAQNIAKTVAASQNKVYLSADSLV
Djaponica ERQQKIVNAEGEAQAAILIGDALSANSGYLKLRKIKASEKIARTLSTAQNRAYLNANTLM
:::***::***** ** ::*:*:: *.**:***:*:*::.*::*::::**: **.*:.*: Prim.cons. 2QRQKIVQAEGEAEAAKM2GDALSKNPGYLKLR2IRAAQNIAKTIATSQNRVYLNADSLV 310 320 330 340 350 | | | | | Xlaevis LNLQDDTFTRGSDSLVAKQTKK--- Mmusculus LNLQDESFTRGSDSLIKGKK--- Drerio LNLQDSSFN----NLSLGK--- Djaponica MNINEKEFNDSVDRVVKKKXDRKVGKVFVVLFEXNKVXNFQKKKKKKKKKRKKKKKKK :*:::. *. : :
Prim.cons. LNLQD4SF2RGSDSLVK2K322KVGKVFVVLFEXNKVXNFQKKKKKKKKKRKKKKKKK
Fig. 2.25: Multiallineamento delle sequenze amminoacidiche della proteina PHB2 di
Xenopus laevis, Mus musculus e Danio rerio contro la sequenza amminoacidica
putativa di DjPHB2. (*) amminoacidi uguali, in rosso; (:) amminoacidi fortemente similari, in verde; (.) amminoacidi debolmente similari, in blu.
Fig. 2.26: Analisi dell’espressione di DjPHB2 mediante ibridazione in situ whole mount in planarie di controllo. (A) Schema di taglio. (B) Espressione di DjPHB2 in una planaria intatta. (C) Espressione di DjPHB2 a 1, 3, 7 giorni (d) dal taglio.
Ruolo di DjPHB2 durante la rigenerazione
Per studiare la funzione del gene DjPHB2 nella biologia dei neoblasti è stato analizzato l’effetto del silenziamento genico di DjPHB2 durante la rigenerazione. Planarie tagliate al quarto giorno dal taglio (prima rigenerazione) sono in grado di formare un blastema rigenerativo e completare i normali processi morfogenetici. Tuttavia, è possibile osservare un ritardo nella formazione del blastema così come nel ripristino delle parti mancanti negli animali iniettati con dsDjPHB2 rispetto ai controlli. Gli animali iniettati muoiono dopo 30-35 giorni dalla prima iniezione.
Sebbene planarie iniettate siano in grado di rigenerare, esperimenti di ibridazione in
situ whole mount, utilizzando il marcatore molecolare DjMCM2, hanno permesso di
evidenziare una riduzione dei neoblasti localizzati nei cluster laterali, così come di quelli sparsi, in animali in cui il gene DjPHB2 è stato silenziato rispetto ai controlli. Questa differenza tra trattati e controlli è evidente maggiormente a livello dei frammenti che rigenerano la coda. Successivamente, le cellule che esprimono DjMCM2 si riducono progressivamente e si ritrovano, a tempi tardivi (20 giorni) , preferenzialmente a livello della linea mediana dorsale del corpo degli animali (Fig. 2.27A). L’analisi della distribuzione di cellule in mitosi, mediante la tecnica di immunolocalizzazione con anticorpo anti-istone H3 fosforilato, ha ulteriormente dimostrato che la distribuzione delle cellule in mitosi a 20 giorni dal taglio è localizzata preferenzialmente lungo la linea mediana del corpo di animali trattati con dsDjPHB2 (Fig. 2.27C). L’analisi dell’indice mitotico conferma la marcata riduzione (80%) dei neoblasti in animali trattati rispetto ai controlli. L’analisi dell’espressione di un altro marcatore molecolare,
DjPiwi-1, rivela che il pattern di espressione di questo gene non cambia in seguito al
silenziamento a 20 giorni dal taglio (in prima rigenerazione) in frammenti che rigenerano la testa e in frammenti che rigenerano la coda (Fig. 2.27B).
Fig. 2.27: Effetto del silenziamento di DjPHB2 durante la prima rigenerazione. (A) Espressione del gene DjMCM2 visualizzata mediante esperimenti di ibridazione in situ whole mount in animali di controllo (c) e trattati con dsDjPHB2 a 20 giorni dal taglio (20 d). (B) Espressione di DjPiwi-1 visualizzata mediante ibridazione in situ whole mount in animali rigeneranti silenziati per DjPHB2 (20 d) e di controllo (c). (C) Immunolocalizzazione con anticorpo anti istone H3 fosforilato su sezioni trasversali ottenute da frammenti di testa a 20 giorni di prima rigenerazione trattate con dsPHB2 (20 d) e planarie di controllo (c).
Quando il blastema viene tagliato al terzo giorno di prima rigenerazione, (seconda rigenerazione), i frammenti di animali rigeneranti non sono in grado di formare un blastema (Fig. 2.28A). In particolare, le teste non sono in grado di formare il blastema rigenerativo (95%); alcune (5%) formano inizialmente un piccolo blastema, che però regredisce in 1-2 giorni. La morte incorre dopo circa 14 giorni dal secondo taglio. Le code, invece, riescono a formare il blastema rigenerativo anche se questo risulta essere più piccolo rispetto a quello presente nei controlli. Anche la testa rigenerata è di dimensioni ridotte rispetto a quella dei controlli ed appare arrotondata, senza le auricole, e presenta o un occhio solo, o due occhi, ma uno più piccolo ed uno più grande (dati non mostrati). Le code trattate muoiono entro 30 giorni dal taglio.
Per comprendere il motivo per cui le teste non fossero in grado di formare un blastema rigenerativo sono stati condotti esperimenti di ibridazione in situ whole mount, utilizzando i marcatori molecolari DjMCM2 e Dj Piwi-1. I risultati ottenuti dimostrano che, in planarie trattate con dsDjPHB2, incapaci di formare il blastema, a 7 giorni dal taglio (seconda rigenerazione), sono evidenziabili dei neoblasti localizzati preferenzialmente lungo la linea mediana dorsale del corpo (Fig. 2.28B). L’analisi dell’espressione del marcatore molecolare DjPiwi-1 mostra la presenza, nella linea mediana del corpo degli animali trattati, di cellule positive anche per questo marcatore, a 7 giorni dal secondo taglio (Fig. 2.28C). La permanenza di neoblasti lungo la linea mediana di animali trattati con dsDjPHB2 a 7 giorni dal taglio è confermata anche dall’analisi istologica condotta su sezioni trasversali colorate in ematossilina ed eosina (Fig. 2.29F, G). Per analizzare la distribuzione e la quantità di cellule in mitosi anche per gli animali in seconda rigenerazione sono stati condotti esperimenti di immunolocalizzazione su sezioni trasversali con anticorpi anti-istone H3 fosforilato per l’analisi della distribuzione delle cellule proliferanti (neoblasti). A 7 giorni dal secondo taglio, in animali trattati con dsDjPHB2, le pochissime cellule proliferanti rimaste si trovano esclusivamente lungo la linea mediana dorsale del corpo e in molte sezioni non è addirittura possibile riscontrare alcuna cellula positiva all’istone H3 fosforilato (Fig. 2.28D, E). Per quantificare la riduzione delle cellule proliferanti, osservata negli esperimenti di immunolocalizzazione, è stato valutato l’indice mitotico a 3 giorni dal taglio in animali di controllo e trattati con dsDjPHB2, sia durante la rigenerazione posteriore che anteriore. Nelle teste, in cui il trattamento con l’RNAi determina effetti più marcati, già a 3 giorni dal taglio si ha, nel trattato, una riduzione del 95% delle
cellule in mitosi rispetto al controllo, mentre nelle code la riduzione è del 70% (Fig. 2.28H).
Fig. 2.28: Effetto del silenziamento di DjPHB2 durante la seconda rigenerazione. (A) Immagine in luce di organismi iniettati a 7 giorni dal secondo taglio. Le planarie in cui è stato silenziato DjPHB2 (RNAi) non formano il blastema. B) Espressione di
DjMCM2 visualizzata mediante ibridazione in situ whole mount in animali
rigeneranti silenziati per DjPHB2 (RNAi) e di controllo (c). (C) Espressione di
DjPiwi-1 visualizzata mediante ibridazione in situ whole mount in animali
rigeneranti silenziati per DjPHB2 (RNAi) e di controllo (c). (D, E) Immunolocalizzazione con anticorpo anti istone H3 fosforilato su sezioni trasversali ottenute da frammenti di testa trattate con dsPHB2 (RNAi) e planarie di controllo (c). (F, G) Analisi istologica di sezioni trasversali di tessuto colorate con ematossilina ed eosina di animali rigeneranti silenziati per DjPHB2 (RNAi) e di controllo (c). (H) Analisi di cellule mitotiche in frammenti di testa (heads) e di coda (tails) trattati con
dsPHB2 e di controllo (c) a tre giorni di seconda rigenerazione. Il numero di cellule
capaci di entrare nella fase M è stato analizzato in una finestra temporale di 6 ore. I valori sono espressi come percentuale rispetto alle planarie di controllo a cui è stato dato arbitrariamente il valore di 100%. Ogni valore rappresenta la deviazione media
Per indagare meglio il motivo per cui le teste non fossero in grado di formare un blastema rigenerativo, sono stati condotti esperimenti di microscopia elettronica a trasmissione. Le microfotografie mostrano la corretta chiusura della ferita ma al di sotto dell’epitelio rimarginato, non è evidenziabile il tipico accumulo di neoblasti riscontrabile nei controlli a 3 giorni di rigenerazione dal secondo taglio (Fig. 2.29A).
Fig. 2.29: Analisi di planarie al terzo giorno di seconda rigenerazione trattate con dsDjPHB2 mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). La barra verde indica l’epitelio della ferita. (A) Animali di controllo. (B) Animali trattati con
Ruolo di DjPHB2 in planarie intatte
Gli animali intatti in cui è stato silenziato il gene DjPHB2 mostrano, a 25-30 giorni dalla prima iniezione, una diminuzione della motilità accompagnata da una progressiva degenerazione della testa con perdita iniziale delle auricole e, quindi, della parte della testa anteriore agli occhi, fino alla perdita completa della testa (Fig. 2.30A). Per le planarie iniettate la morte incorre in media tra i 50 e i 60 giorni dalla prima iniezione.
Dato che il fenotipo ottenuto (degenerazione della testa) è tipico di planarie prive di neoblasti, è stata analizzata la distribuzione di queste cellule in animali in cui DjPHB2 è stato silenziato. A tale fine è stata analizzata l’espressione del marcatore molecolare di neoblasti DjMCM2. I risultati ottenuti mostrano che il pattern di espressione del gene
DjMCM2 è ridotto in animali in cui il gene DjPHB2 è stato silenziato, rispetto ai
controlli (Fig. 2.30B) . In specifico, si evidenzia un’iniziale diminuzione dei neoblasti sparsi nel parenchima, particolarmente di quelli localizzati nella zona anteriore al faringe. A 35 giorni dalla prima iniezione DjMCM2 è esclusivamente espresso lungo la linea mediana del corpo. La presenza di neoblasti lungo la linea mediana del corpo e la marcata riduzione dei neoblasti sparsi nel parenchima a 35 giorni, è confermata anche dall’analisi istologica condotta su sezioni trasversali colorate in ematossilina ed eosina (Fig. 2.30F, G).
Al fine di analizzare la distribuzione delle cellule proliferanti sono stati effettuati esperimenti di immunolocalizzazione su sezioni trasversali con anticorpi anti istone H3 fosforilato, specifico per cellule in mitosi, ossia per i neoblasti, essendo queste cellule le uniche proliferanti in planaria. A 20 giorni dalla prima iniezione di dsDjPHB2, è possibile osservare una riduzione delle cellule in mitosi rispetto ai controlli. In accordo con quanto evidenziato dai dati precedenti di ibridazione in situ whole mount, i neoblasti rimanenti sono localizzati preferenzialmente lungo la linea mediana dorsale del corpo ed è osservabile una riduzione dei neoblasti sparsi all’interno del parenchima. A 35 giorni la quantità di cellule in mitosi è drasticamente ridotta e le poche cellule proliferanti che permangono sono situate esclusivamente lungo la linea mediana dorsale del corpo (Fig. 2.30D, E). Allo scopo di quantificare il numero di cellule capaci di entrare nella fase M del ciclo cellulare, animali intatti di controllo e trattati con
dsDjPHB2 35 giorni dopo la prima iniezione, sono stati posti in colchicina, bloccando,
così, la divisione delle loro cellule. L’analisi dell’indice mitotico ha dimostrato una riduzione del 90% delle cellule proliferanti in animali silenziati per DjPHB2 rispetto al
esperimenti di immunolocalizzazione. La riduzione delle cellule proliferanti è stata dimostrata anche mediante analisi al FACS delle frazioni di neoblasti sensibili all’irraggiamento (X1 e X2) (Hayashi et al., 2006; Reddien et al., 2005). L’analisi è stata condotta utilizzando una frazione cellulare arricchita di neoblasti ottenuta da animali di controllo e animali trattati con dsPHB2 a 35 giorni dalla prima iniezione che non avevano regressione della testa. I risultati ottenuti hanno rivelato che: il numero delle cellule della frazione X1 è ridotto dell’ 80% rispetto ai controlli, il numero delle cellule della frazione X2 è ridotto del 40% rispetto ai controlli, mentre il numero di cellule della frazione Xis è ridotta del 10% rispetto ai controlli (Fig 2.31).
Fig. 2.30: Il silenziamento di DjPHB2 induce regressione della testa e morte in planarie intatte. (A) Immagini in luce di un controllo e organismi iniettati a differenti giorni (d) dopo la prima iniezione. (B) Espressione di DjMCM2 visualizzata mediante ibridazione
in situ whole mount nei controlli e in planarie iniettate con dsDjPHB2 a differenti giorni
(d) dalla prima iniezione. (C) Analisi delle cellule mitotiche in animali di controllo e in animali trattati con dsDjPHB2 (35 d). Il numero di cellule capaci di entrare nella fase M del ciclo cellulare è stato analizzato in una finestra temporale di 6 ore. I valori sono espressi come percentuale rispetto alle planarie di controllo a cui è stato dato arbitrariamente il valore di 100%. Ogni valore rappresenta la deviazione media standard di tre campioni indipendenti analizzati in duplicato. ** Significativo con p<0,01. (D, E) Distribuzione delle cellule mitotiche analizzate mediante immunolocalizzazione con l’anticorpo anti istone H3 fosforilato su sezioni trasversali ottenute dalla regione del corpo anteriore al faringe. (F, G) Analisi istologica di sezioni trasversali di tessuto colorate con ematossilina ed eosina. L’epitelio dorsale si trova verso l’alto. Gli animali trattati con dsDjPHB2 mostrano una ridotta densità cellulare. Le punte di freccia indicano i cluster di neoblasti localizzati lungo la linea mediana dorsale del corpo di animali.
Fig. 2.31: Profilo al FACS di cellule marcate con ioduro di propidio (PI) e calceina. L’analisi è stata condotta in una popolazione di cellule arricchita in neoblasti (< 25 μm) ottenute da planarie di controllo (c) e trattate con dsDjPHB2 (35 d) 35 giorni dopo la prima iniezione. Le popolazioni X1 (rosso) e X2 (blu) sono sensibili alle radiazioni, la popolazione Xis (verde) è resistente ai raggi X. La significatività è stata assegnata con il t-test Student’s.
Discussione
Mediante la metodica dei microarrays sono stati individuati 44 geni specifici dei neoblasti, uno dei quali è risultato essere omologo a geni appartenenti alla famiglia delle proibitine (PHB) (Rossi et al., 2007). L’analisi della sequenza del gene completo, isolato durante questo lavoro di tesi e denominato DjPHB2, rivela che questo gene ha una significativa omologia di sequenza, a livello amminoacidico, con i membri PHB2 di questa famiglia proteica.
I dati ottenuti mediante esperimenti di ibridazione in situ confermano che DjPHB2 è un marcatore di neoblasti. Questo gene, infatti, ha un pattern di espressione paragonabile a quello del marcatore molecolare di neoblasti DjMCM2 (Salvetti et al., 2000). In particolare, DjPHB2 è espresso a livello dei neoblasti sparsi nel parenchima così come in quelli accumulati lungo la linea mediana e nei clusters dorsali laterali.
Durante la rigenerazione, DjPHB2 è espresso nel blastema rigenerativo, a livello del quale si accumulano i neoblasti determinati e in via di differenziamento. Questi risultati suggeriscono un ruolo di DjPHB2 non solo nei neoblasti in proliferazione, come ad esempio quelli sparsi nel parenchima (Salvetti et al., 2009), ma anche in neoblasti in differenziamento.
Un ruolo di DjPHB2 nella biologia dei neoblasti è suggerito anche dai risultati ottenuti silenziando l’espressione di questo gene mediante la metodica di interferenza genica. Il silenziamento di DjPHB2 è letale, infatti, sia in animali intatti che in rigenerazione. Le planarie intatte mostrano una degenerazione progressiva della testa seguita dalla morte dell’animale. Questo fenotipo è generalmente riscontrabile in animali privi di neoblasti come, ad esempio, in quelli che hanno subito un irraggiamento con dosi letali (es. 30 Gy) (Salvetti et al., 2009). L’analisi della distribuzione dei neoblasti in animali silenziati per DjPHB2 rivela una significativa riduzione dei neoblasti in questi organismi. In particolare, in seguito al silenziamento di DjPHB2, scompaiono i neoblasti sparsi nel parenchima e quelli accumulati in clusters laterali. I neoblasti localizzati lungo la linea mediana del corpo sono invece mantenuti dagli animali iniettati, anche in planarie completamente prive della testa. La drastica riduzione dei neoblasti è anche confermata dall’analisi della distribuzione delle cellule in proliferazione, così come dalla quantificazione del numero di mitosi. I dati ottenuti indicano che il silenziamento di DjPHB2 influenza anche la capacità rigenerativa degli animali. Questo è particolarmente evidente in planarie in seconda rigenerazione
blastema rigenerativo. Analisi al TEM dimostrano che in questi animali non si forma il blastema perché non si verifica il tipico accumulo di neoblasti al di sotto dell’epitelio della ferita presente negli animali wild type. In animali trattati con dsDjPHB2 si verifica un drastico calo delle mitosi e l’analisi della distribuzione dei neoblasti rivela una riduzione del numero di neoblasti sparsi nel parenchima e di quelli accumulati in clusters laterali. Tuttavia, come riscontrato nelle planarie intatte, esperimenti di ibridazione in situ whole mount indicano la presenza costante di neoblasti esprimenti i geni DjMCM2 e DjPiwi-1 lungo la linea mediana del corpo degli animali trattati, anche in quelli privi di blastema. Planarie in seconda rigenerazione posteriore, così come planarie in prima rigenerazione anteriore e posteriore, sono invece in grado di formare un blastema rigenerativo e di rigenerare la parte mancante del corpo, anche se durante la seconda rigenerazione si verificano ritardi rigenerativi e processi morfogenetici anomali. In precedenza sono già stati descritti casi in cui il silenziamento di un gene coinvolto nel mantenimento dei neoblasti abbia prodotto un fenotipo solo durante la seconda rigenerazione (Salvetti et al., 2005). Durante la prima rigenerazione, sebbene il silenziamento genico induca una riduzione dei neoblasti, il numero di queste cellule, già presenti nel parenchima, è generalmente sufficiente per permettere la formazione di un blastema rigenerativo. Se in questi animali, però, viene stimolata una seconda rigenerazione, il numero di neoblasti rimasti non è sufficiente per iniziare o per completare in modo corretto la rigenerazione, in assenza di nuovi neoblasti prodotti. Questo è particolarmente evidente durante la rigenerazione posteriore perché la testa della planaria contiene un numero esiguo di neoblasti rispetto al resto del corpo.
In conclusione, sulla base dei dati ottenuti è possibile ipotizzare che DjPHB2 sia coinvolto nel mantenimento dei neoblasti sparsi nel parenchima e di quelli accumulati in clusters laterali, ma non dei neoblasti presenti lungo la linea mediana del corpo di planaria, che vengono mantenuti in animali silenziati per l’espressione di DjPHB2.
Considerando che l’analisi dell’espressione di DjPHB2 suggerisce che questo gene è espresso anche nei neoblasti accumulati lungo la linea mediana, una possibile ipotesi è che DjPHB2 svolga ruoli differenti in popolazioni diverse di neoblasti. Non è, però, da escludere anche l’ipotesi che esista una sottopopolazione di neoblasti accumulati lungo la linea mediana che esprima DjMCM2 e DjPiwi-1 ma non DjPHB2. In questo scenario,
DjPHB2 potrebbe, ad esempio, essere coinvolto nel mantenimento di neoblasti nelle
prime fasi del processo differenziativo. Il silenziamento di DjPHB2 porterebbe, nel tempo, alla perdita di queste cellule, sebbene i neoblasti presenti lungo la linea mediana
continuino a proliferare nel tentativo di ripristinare la popolazione di neoblasti. L’impossibilità di ristabilire il corretto numero di neoblasti determinerebbe, in conclusione, l’arresto del normale turnover cellulare e la morte dell’animale.
