7 1.1Genere 1INTRODUZIONE

1

INTRODUZIONE

1.1

Genere

Aspergillus spp

Il genere

Aspergillus

è un membro del phylum Ascomycota, include più di 185 specie conosciute. Circa 20 specie tra di esse sono note per i loro effetti dannosi sulla salute umana e animale esprimendosi con meccanismi patogenetici invasivi e non[1-3]

.

Il genere

Aspergillus

rappresenta un insieme di muffe che si formano su materia vegetale o animale. Nella tassonomia e nella filogenia le muffe non costituiscono un gruppo preciso, trovandosi nelle divisioni Zygomycota, Deuteromycota e Ascomycota appartenenti al regno dei Funghi. Il genere

Aspergillus

appartiene all'ordine Eurotiales del phylum Ascomycota, caratterizzato da anamorfismo e da esponenti di forma asessuata[4]_.

Dominio: Eukaryota - Whittaker & Margulis, 1978.

Regno: Fungi - T.L. Jahn & F.F. Jahn, 1949 ex R.T. Moore, 1980. Subregno: Dikarya - D.S. Hibbett et al., in D.S. Hibbett et al., 2007. Phylum: Ascomycota - T. Cavalier-Smith, 1998

Subphylum: Pezizomycotina - O.E. Eriksson & K. Winka, 1997. Classe: Eurotiomycetes - O.E. Eriksson & K. Winka, 1997. Subclasse: Eurotiomycetidae - D.M. Geiser & F. Lutzoni, 2007. Ordine: Eurotiales - Benny & Kimbr., 1980.

Famiglia: Trichocomaceae - E. Fisch., 1897. Genere: Aspergillus - Link, 1809.

Morfologicamente gli esponenti del genere

Aspergillus

presentano un conidioforo costituito da uno

stipe

o filamento conidioforo di solito privo

di

setti

che presenta un rigonfiamento all'apice denominato

vescicola

da cui si dipartono i fialidi (cellule con funzione riproduttiva). Dalla vescicola possono dipartire talora le metule (cellule sterili) che si continueranno nei fialidi dando vita in questo caso ad una forma biseriata della testa conidiale o aspergillare. Il prodotto dei fialidi sarà una catena di conidi (spore) i quali potranno assumere in base alla specie sia una forma colonnare che raggiata. La morfologia appena descritta è espressione dell'attività propagativa asessuata, tipica del genere

Aspergillus spp,

Figura n.1[4]_.

Godono di ampia capacità adattativa anche a temperature elevate così da aver assunto nel tempo la denominazione di agenti termo-tolleranti dopo essere stati considerati termofili per molti anni fino all'acquisizione di metodiche di studio più raffinate e precise dalla comunità scientifica. Quasi duecento specie trovano interesse da parte della comunità medica scientifica, esprimendosi con notevole diversità di manifestazione[5]_.

veterinario, agricolo e industriale sia nel campo alimentare che farmaceutico.

1.2 Morfologia delle principali specie di interesse

igienico-sanitario

1.2.1

Aspergillus candidus

[6]

Le colonie su Czapek agar a 25 °C sviluppano un diametro di 1.0-1.5 cm entro 7 giorni, di solito sottili con micelio disposto a raggiera, intermediato da conidiofori che si sollevano dall'agar o dal micelio.

Macroscopicamente le teste conidiali assumono colorazione dapprima bianca, poi color crema. Il filamento conidioforo è caratterizzato da una colorazione leggermente giallastra e parete liscia. Talvolta sulle colonie sono presenti sclerozi di colorazione rosso-porpora fino a nerastra.

Microscopicamente le vescicole appaiono da globose a subglobose, con diametro che può variare da 10 a 50 µm. I fialidi talvolta nascono direttamente dalla vescicola, ma in maggior evenienza dalle metule di diametro di 5-8 x 2-3 µm. I conidi globosi o subglobosi hanno un diametro che varia da 2.5-4.0 µm[7]_.

Importanti metaboliti tossici prodotti dal micete sono la

terfenillina

e la

xantoascina

[6]_.

Habitat: molto spesso è stato trovato in derrate alimentari contenenti cereali[8]

_.

1.2.2

Aspergillus flavus

[6]

Figura n.2

Le colonie su Czapek a 25 °C raggiungono un diametro di 3-5 cm entro 7 giorni, di solito si evidenzia un terreno denso di conidiofori di color giallo-verde. Le teste conidiali sono tipicamente radiate, e crescendo assumeranno forme colonnari variando la tonalità verso una colorazione più scura. I conidiofori ialini grossolanamente rugosi di solito raggiungono la lunghezza di 1 mm.

Microscopicamente le vescicole variano morfologicamente da globose a subglobose raggiungendo 25-45 µm di diametro. I fialidi nascono direttamente dalle vescicole o dalle metule, 6-10 x 3-5 µm[7]

.

I conidi si presentano di colore verde chiaro, echinulati, aventi 3.6 µm di diametro. Possibili sclerozi di colore marrone, marrone-scuro, fino a nero. Importanti metaboliti prodotti dal micete sono l'acido koico, aflatossina B, acido aspergillico, acido ciclopiazonico, acido 3-nitropropionico[7,15, 16, 17].

secchi[8]

_.

1.2.3

Aspergillus fumigatus.

Fresen,1863.

Figura n.3

Le colonie su Czapek a 25 °C raggiungono un diametro di 3-5 cm entro 7 giorni, consistono in un denso tappeto di conidiofori verde scuro, mischiati a ife sporgenti che prendono rapporti con i conidiofori.

Le teste conidiali sono tipicamente colonnari.

I conidiofori sono corti e a parete liscia e verde, soprattutto nella parte più alta.

Microscopicamente le vescicole piuttosto clavate raggiungono un diametro di 20-30 µm. I fialidi di 6-8 µm poggiano direttamente sulla vescicola, e spesso assumono colorazione verdastra. I conidi di 2.5-3.0 µm variano dalla forma globosa alla forma subglobosa, allo stesso tempo mostrano parete rugosa ed echinulata[7]_.

verucologena, la fumitremorgin A & B, le fumitossine e le triptoquivaline. L'habitat preferito dal micete è rappresentato da cereali, rifiuti e concimi[8]

_.

1.2.4

Aspergillus niger

[6]

_.

Le colonie su Czapek a 25 °C raggiungono un diametro di 4-5 cm entro 7 giorni dalla coltura. In coltura assume una forma compatta di colore variabile da bianco a giallo alla base, con un denso strato di conidiofori la colorazione varia da marrone scuro a nero. Le teste conidiali nere eradiate tendono a dividersi in ampie colonne con il trascorrere dei giorni. Gli steli hanno parete liscia e colorazione brunastra.

Figura n.4

Microscopicamente le vescicole variano dalla forma globosa alla forma subglobosa, e il loro diametro può variare da 50 µm a 100 µm. I fialidi di 7.0-9.0 x 3-4 µm poggiano direttamente sulle metule. Le metule da ialine a marroni, spesso settate raggiungono una grandezza di 15-25 x 4.0-6.0 µm. I conidi possono presentarsi da globosi a subglobosi e con diametro di 3.5-5 µm[7]_.

fumonisine[18]

.

Habitat: è un comune contaminante alimentari di vari substrati (cibi essicati e spezie)[8]

_.

Recentemente mais, uva e uva passa sono stati citati come substrati contaminabili dall'

A. niger

[18]

.

1.2.5

Aspergillus terreus

[6]

Figura n. 5

Le colonie su Czapek a 25 °C raggiungono un diametro di 3-5.0 cm entro i 7 giorni. Consistono maggiormente in un denso tappeto di conidiofori giallo-marrone tendente a colorazione più scura con il passare dei giorni. Le teste conidiali giallo-brune, di forma compatta e colonnare raggiungono una grandezza di 150-500 x 30-50 µm. I conidiofori di colorazione ialina mostrano parete liscia. Le vescicole subglobose raggiungono i 20-30 µm di diametro. I fialidi nascono dalle metule, entrambe le strutture hanno una grandezza variabile da 5-7 x

2.0-2.5 µm. I conidi globosi possono assumere forma ellissoidale e raggiungere un diametro di 1.5-2.5 µm, la colorazione dei conidi varia da ialina a leggermente giallastra, la parete è sempre liscia[7]

.

Tra i metaboliti tossici si ricordano la terreina, la patulina, la citrinina, la citreoviridina.

Habitat: suolo, spezie, insilati[8]

_.

1.2.6

Aspergillus ochraceus

[6]

_.

Le colonie su Czapek a 25 °C raggiungono un diametro di 2.5-3.5 cm entro i 7 giorni, di solito si presentano con un denso tappeto di conidiofori giallastri. Le teste conidiali dapprima gialle e globose tendono a dividersi in due o più colonne compatte. Il filamento conidioforo può raggiungere 1.5 mm di lunghezza, e assumerà con l'età una colorazione variabile da gialla a marrone pallida, la sua parete è normalmente rugosa. Le vescicole di forma globosa e di colorazione ialina raggiungono i 35-50 µm di diametro. I fialidi si dipartono dalle metule ed hanno grandezza di 7-11 x 2.0-3.5 µm. Le metule invece mostrano una grandezza di 15-20 x 5-6 µm.

I conidi da globosi a subglobosi, arrivano ad assumere un diametro di 2.5-3.0 µm, di colorazione ialina, parete liscia o finemente rugosa. Sclerozi di solito presenti. Queste dapprima bianche, assumono secondariamente una colorazione purpurea[7]

.

Tra i metaboliti tossici si ricordano l'acido penicillico, l'ocratossina A, la xantomegnina, la viomelleina, la vioxantina.

caffè[8]_.

1.2.7

Aspergillus oryzae

[6]

Questa specie trova principalmente interesse per la sua presenza in prodotti fermentati e in ambienti industriali. Tra i suoi metaboliti tossici si ricordano l'acido koico, l'acido ciclopiazonico, e l'acido-3-nitropropionico. Secondo alcuni autori[6]

la distinzione con

A. flavus

sulla base dei riscontri macroscopici risulta abbastanza difficile.

1.2.8

Aspergillus parasiticus

[6]

La differenza principale a livello microscopico con le altre specie è dovuta alla testa conidiale principalmente uniseriata e ai conidi a parete rugosa. Alberga generalmente in colture di cereali, noci, e suolo[8]_.

Tra le principali tossine prodotte dal parassita si ricordano l'acido koico, acido aspergillico, e l'aflatossina B1, B2, G1, G2[15,16,17]

.

1.2.9

Aspergillus ustus

[6]

Le colonie su Czapek agar a 25 °C raggiungono un diametro di 4.5-6.0 cm entro 7 giorni. La colonia dapprima bianca o color crema sfuma verso un colore giallastro in seguito, più tardi vira dal colore chiaro verso una colorazione grigiastra scura o verde-oliva. Le teste conidiali sono radiate e di solito si dividono in più colonne più o meno definite al variare dell'età. La grandezza del diametro è variabile dai 100 ai 125 µm. I conidiofori si elevano sopra il tappeto di ife così sommerse, potendo raggiungere lunghezze fino a 400 µm. Lo stipe di colorazione marrone

presenta all'estremità una vescicola semisferica o globosa di 7.0-15 µm di diametro. I fialidi (4-7 x 3-4.0 µm) si dipartono dalle metule di 5-7 x 2.5-3.0 µm. I conidi di forma globosa si presentano rugosi, echinulati e con diametro variabile da 3.0 µm a 4.5 µm. Di solito sono prodotte cellule di Hulle di grandezza variabile con andamento serpiginoso o elicoidale[7]_.

Tra i metaboliti tossici si ricordano l'austamide, l'austdiol, le austine e le austocistine. Il parassita alberga di preferenza su suoli, cereali e colture di arachidi[8]

_.

1.3

Il genere

Aspergillus

come contaminante delle derrate

alimentari

1.3.1

Fitopatogeni a confronto

Tra i principali patogeni opportunisti delle colture agricole sicuramente

A. flavus

svolge un ruolo di rilievo essendo il saprofita più rinvenuto in un range di colture abbastanza ampio e tra l'altro poco specifico, essendo capace di attaccare piantagioni di granturco, cotone, arachidi, frutta secca e noci senza mostrare particolare preferenza tra le monocotiledoni e le dicotiledoni, sia sotto terra che all'aria esposta. Se paragonato con

A. fumigatus

dimostra una scarsa specificità d'ospite[19]_.

In condizioni climatiche favorevoli per la sua crescita è in grado di provocare marciume alle colture. A causa della sua spiccata capacità di crescere in ambienti a bassa attività di acqua è altresì in grado di

colonizzare semi di grano e coltivazioni di oleaginose. Generalmente un ambiente con alte temperature e le colture stressate sono i due parametri ambientali maggiormente favorenti l'infezione di

A. flavus

nelle piantagioni[20]_.

1.3.2

Micotossine

Le micotossine sono metaboliti secondari dei miceti, conosciute come causa di patologie talora mortali sia in animali che umani. Tra le più patogeniche è scientificamente accettata la rilevanza di aflatossine, fumonisine, ocratossina A, deoxinivalenolo (DON o vomitotossina), zearalenone, ergotine:

Aspergillus, Penicillium, Fusarium

e

Claviceps

sono rispettivamente i generi maggiormente legati alla produzione delle suddette tossine.

Le micotossine di derivazione aspergillare più studiate sono senza dubbio le aflatossine, l'ocratossina A e le fumonisine[21]

.

1.3.2.1

Aflatossine

L'identificazione delle aflatossine risale agli anni 60, quando una misteriosa malattia denominata malattia X dei tacchini “Turkey-X disease” causò la morte di 100.000 capi di pollame in Inghilterra[22,23]_.

Le aflatossine sono un gruppo di metaboliti secondari del metabolismo di alcuni ceppi di

A. flavus

e di

A. parasiticus

e strutturalmente correlate tra di loro. Le aflatossine B1, B2, G1, G2 sono le maggiori 4 esponenti[24]_.

L'aflatossina M1 è invece il maggior prodotto metabolico degli animali derivato dall'aflatossina B1. Viene escreta con latte, urine da varie specie di mammiferi cui è stato somministrato cibo contaminato da aflatossine.

L'aflatossina B1 risulta la più tossica essendo il più potente composto naturale ad attività epatocarcinogenica[25]_.

L'ingestione di aflatossine con cibo contaminato causa patologie comunemente denominate aflatossicosi. La condizione morbosa potrebbe presentarsi in forma acuta allorquando alti livelli di aflatossine venissero consumati, determinando danneggiamento epatico, necrosi acuta, cirrosi, e in altri casi insufficienza epatica e morte[26,27]

.

1.3.2.2

Ocratossina A (OTA)

È una micotossina nefrotossica con proprietà carcinogeniche, teratogeniche, embriotossiche, neurotossiche, immunosoppressive[28,29]_.

Oltre alle specie del genere

Penicillium

ritenuto il massimo produttore di OTA rinvenibile su cereali, anche esponenti del genere

Aspergillus

sono ritenuti importanti produttori di micotossine:

A ochraceus

e

A niger

sono tra questi[30,31]_.

1.3.2.3

Fumonisine

Per

fumonisine

si intende un gruppo di micotossine prodotte da miceti facenti parte del genere

Fusarium

e

Aspergillum

.

Aspergillus niger

è responsabile della produzione di fumonisina B1, B2, B4. I substrati maggiormente contaminati sono i cereali, ma recenti indagini effettuate su uva e uva passa hanno dimostrato la capacità di

A.

niger

di contaminare substrati diversi dai cereali[18]

.

In definitiva la contaminazione di derrate agricole pone un potenziale rischio economico e sanitario nel mondo zootecnico, nell'industria

alimentare, e per la salute umana[33-42]

.

1.4

Il genere

Aspergillus

come entità patogena per le specie

animali

Diverse sono le specie animali coinvolte dai meccanismi patogenetici espressi dal genere

Aspergillus

interessando specie di interesse zootecnico, animali da compagnia e specie selvatiche.

1.4.1

Bovini

Tra i bovini da menzionare sono gli aborti provocati nell'ultimo trimestre di gravidanza senza ripercussioni sulla fertilità successivamente all'aborto[43,44]_.]

1.4.2

Equini

Nell'ultimo trentennio la specie equina è stata oggetto di indagini scientifiche dalle quali è emerso il ruolo certo del genere

Aspergillus

nella patogenesi di alcune manifestazioni morbose tra le quali si vogliono ricordare:

• _{l'aspergillosi invasiva polmonare}[45]_;

• _{l'enterite micotica da}

_{Aspergillus fumigatus}

[46]_;

• _{mediastinite granulomatosa che colpisce soggetti anche non IC}[47]_; • _{la micosi polmonare invasiva da}

Aspergillus niger

_e

Rhizopus

stolonifer

[48]

;

• _{le micosi delle tasche gutturali del cavallo}[49]_;

• _{l'osteomielite da}

Aspergillus fumigatus

_{delle parti distali degli} arti[50]_;

1.4.3

Aspergillus spp negli animali d'affezione

Il genere

Aspergillus

in condizioni favorevoli può esprimere virulenza nei confronti del cane e del gatto. Le specie coinvolte secondo la letteratura sono identificate in

A. fumigatus,

A. terreus, A. ochraceus

[51,52]

.

Aspergillus fumigatus

è largamente partecipe nelle riniti micotiche, in cani dolicocefali, ma rare sono le disseminazioni sistemiche[52]

.

Diversamente dal precedente,

A. terreus

è ritenuto capace di disseminare nel corpo dell'animale comportando infezioni invasive sistemiche spesso letali sia in cani che più raramente in gatti[51]_,

Il Pastore tedesco sembra essere la razza più esposta[51,53]_.

La ragione di questo fenomeno è stata collegata alla deficienza di IgA specifiche tipica della razza, o a disfunzioni in grado di alterare le normali barriere immunitarie normalmente espresse dalle mucose[54,55]_.

A volte le disseminazioni di

A. terreus

hanno esodo in discospondiliti multifocali: il Pastore Tedesco è la razza più soggetta a questo tipo di evento patologico[56]_.

Aspergillus terreus

è tuttavia in grado durante le aspergillosi invasive di trasmettersi per via trans-uterina ai feti e condurli a morte come dimostrato dall'isolamento di

A. terreus

da campioni provenienti dal fegato di cuccioli con madre in preda ad aspergillosi sistemica[57]_.

Esistono casi di otomicosi monolaterali, dalla letteratura recente, ad eziologia aspergillare accertata causate da

A. ochraceus

[58]_.

Nel gatto

A. fumigatus

è stato accertato essere entità nosologica capace di conferire lesioni seno-nasali e lesioni più invasive ora considerate emergenti nelle regioni seno-orbitali[59]

1.4.4

Aspergillosi nelle specie aviare

Le infezioni micotiche causate dal genere

Aspergillus

nelle specie aviarie, rappresentano una delle maggiori cause di mortalità. La specie saprofitica predominante è indubbiamente

A. fumigatus

. Il saprofita opportunista largamente presente in ambiente e nell'aria[60,61] _{nei giovani}

animali provoca infezione di solito acuta e severa, causando un alto tasso di morbilità e mortalità. Nonostante ciò negli adulti l'infezione appare sporadica e ad andamento cronico[62]

.

Casi di aspergillosi sono state riportate in polli[63]_{, tacchini}[64]_{, struzzi}[65]_,

nandù comune (

Rhea americana

)[66]_{, pinguini}[67] _quaglie[68] _{e in altri uccelli}

selvatici[69]_.

In Italia vari casi di aspergillosi invasive sono state riportate anche in gabbiani reali zampegialle (

Larus cachinnans micaellis

)[70]_.

Principalmente l'aspergillosi si rinviene nell'apparato respiratorio e si caratterizza nei volatili con lesioni agli organi interni e in alcuni casi agli occhi, inoltre nel pollame

A. ochraceus

è stato rinvenuto anche al cervello in combinazione a stati di coccidiosi[71,72]

.

1.5

Il genere

Aspergillus

come saprofita opportunista, patogeno

facoltativo nella specie umana

Il genere

Aspergillus

è capace di causare sia patologie locali che patologie a carattere invasivo (AI) anche mortali in soggetti immuno-compromessi (IC). Lo spettro delle localizzazioni è così ampio da poter interessare polmoni, seni del nasale e del frontale e procurare reazioni allergiche dovute alla inalazione di spore. Tra le centinaia di specie del

genere

Aspergillus

, poche sono quelle ritenute capaci di procurare patologia alla specie umana. Le più comuni specie coinvolte nei processi patogenetici sono identificate in

A. fumigatus, A. flavus

e

A. terreus

. I pazienti neutropenici solitamente sono suscettibili alle forme invasive sistemiche, mentre i soggetti sotto terapia cortisonica tendono a sviluppare lesioni cavitarie ai polmoni. Anche i pazienti con patologie ematologiche e patologie ostruttive croniche polmonari, sottoposti a trapianto d'organo o di midollo osseo (pazienti HSCT) o che hanno subito ustioni gravi e/o sottoposti a chirurgia cardiaca sono ritenuti facilmente esposti all'aggressività del genere

Aspergillus

[73]_.

Nei pazienti sottoposti a trapianto di polmone le nuove anastomosi che si vengono a creare fungono da zona elettiva di ancoraggio per il micete[74]_{, mentre più rare sono le endocarditi e le osteomieliti ad}

eziologia aspergillare[75,76]

.

La disseminazione per via ematogena aspergillare può coinvolgere il cervello al livello del quale possono verificarsi ischemie cerebrali, emorragie e ascessi, potendo così indurre meningiti[77]_.

I rilievi ematici condotti su pazienti con aspergillosi invasive spesso sono accompagnati da disordini della coagulazione, la neutropenia infatti viene sovente accompagnata da trombocitopenia[78]

.

1.6

Generalità sugli antimicotici

Negli ultimi decenni si è visto progredire la ricerca verso nuove molecole antimicotiche aumentando così le scelte terapeutiche a disposizione della comunità medica e dell'industria farmaceutica. Attualmente

esistono quattro classi terapeutiche antimicotiche, disponibili per le aspergillosi invasive umane in pazienti critici e per il trattamento delle micosi nelle specie animali. La classificazione chimica li differenzia in

polieni

[79]_,

_azoli

[80]_{, e}

_chinocandine

[81]_{, e analoghi delle pirimidine}[82]_.

1.6.1

Azoli e meccanismo d'azione

In generale gli antifungini azolici sono dei fungistatici e diventano fungicidi solo ad alte concentrazioni disorganizzando le strutture di membrana[32]

.

Fanno parte dei derivati azolici due classi di derivati feniletilici: a struttura imidazolica e a struttura triazolica, presentanti lo stesso spettro di azione antifungina e lo stesso meccanismo di azione[32] _(Figura

n. 6). N N R₁ R R₂ R₂ N N N R₁ R 3 4

Struttura imidazolica Struttura triazolica Figura n.6

L’attività dei farmaci azolici è legata alla presenza dell’anello azolico (imidazolico o triazolico) non sostituito ed alla simmetria tetraedrica dell’atomo al quale tale eterociclo è legato[83]

Le molecole in esame per lo più idrofobiche[84] _{e l’anello azolico, il solo}

gruppo reattivo capace di determinare l’interazione con il target delle cellule fungine, rappresentano l'anello di congiunzione nell'espressione dell'attività antimicotica.

Gli studi in vitro effettuati su tali molecole hanno messo in evidenza la correlazione vigente tra l'elevata lipofilia e la loro capacità di penetrare le membrane biologiche ed a rompere quindi il legame tra gli enzimi di membrana e la membrana stessa. Studi sulla demetilazione degli steroli in ceppi di

Saccharomyces cerevisiae,

hanno dimostrato che sia in condizioni aerobiche che anaerobiche, nella crescita cellulare la 14 α-demetilazione del

lanosterolo

è catalizzata dal citocromo P-450-NADPH-reduttasi.

Gli azoli si legano tramite uno degli atomi di N dell'anello azolico all'atomo di ferro del gruppo eme localizzato al centro della proteina cyp51. Attraverso questo legame probabilmente vien bloccato l'accesso del lanosterolo al sito attivo, nel punto in cui cioè C14 viene demetilato[85]

L’inibizione della 14 α-metil-Lanosterolo-demetilasi, enzima che dipende dal sistema microsomiale CYP51 fungino risulta essenziale nel bloccare i processi di demetilazione attraverso cui viene normalmente a formarsi l' ergosterolo.

L’inibizione della sintesi dell’ergosterolo è così fondamentale nel regolare la struttura e la permeabilità della membrana fungina e conseguentemente anche le funzioni enzimatiche della membrana.

Imidazolo e triazoli, impedendo la biosintesi dell’Ergosterolo, portano ad un accumulo di 14-metilsteroli; questi steroli in eccesso possono distruggere la struttura compatta dei fosfolipidi di membrana, bloccando così l’accrescimento dei funghi.

membrana cellulare del fungo, come anche l'accumulo di steroli tossici come i 14α-metilsteroli provocano inibizione della crescita funginea[86]_.

HO HO ∆ 8,14 −_diene Ergosterolo O2, NADPH 14α-demetilasi funghi 14 HO Colesterolo mammiferi Lanosterolo HO 14 Figura n.7

Oltre ad avere un ruolo terapeutico e profilattico nel trattamento delle micosi anche aspergillari nella umana specie e negli animali, le molecole azoliche vengono largamente impiegate per il trattamento preventivo sia curativo in campo agricolo nei confronti delle crittogame (funghi), vedi Tabella n 1.

Ad oggi nella specie umana vengono di routine impiegati quattro composti azolici identificati come: itraconazolo, fluconazolo, voriconazolo e posaconazolo.

1.6.1.1 L'Itraconazolo

È l'agente azolico più datato, ampiamente riconosciuto come potente inibitore del genere

Aspergillus.

Un tempo utilizzabile per via enterale,

ora è disponibile anche in formulazioni somministrabili per via parenterale.

1.6.1.2

Ruolo del Fluconazolo nella cura e profilassi antimicotica

Per profilassi viene intesa la somministrazione di agenti antimicotici in pazienti ad alto rischio di invasione micotica e senza segni e sintomi riferibili ad infezioni micotiche in atto al fine di abbassare le probabilità di contrarre infezioni micotiche invasive e talora letali. Il fluconazolo è utilizzato allo scopo come farmaco di prima scelta, ma non sono chiari i risultati per i pazienti critici a forte rischio di infezioni massive, diversamente dai pazienti affetti da patologie d'organo o pazienti neutropenici in cui la molecola si è dimostrata essere efficace[87]_.

Il Fluconazolo diversamente che nelle candidiasi però non sembra essere molto efficace nei confronti del genere

Aspergillus

e degli Zygomyceti. Tuttavia essendo disponibile in formulazioni somministrabili per via endovenosa e per via orale risulta tra i più utilizzati anche per il suo basso costo e la sua maneggevolezza.

È tuttavia poco raccomandabile in pazienti critici sottoposti a cure analgesiche e sedative con fentanyl e/o midazolam poiché aumenta le concentrazioni sieriche dei due farmaci in quanto metabolizzate dallo stesso isoenzima CYP3A4/5[88]_.

1.6.1.3

Il Voriconazolo

È un esponente della famiglia degli azoli di seconda generazione, possiede un ampio spettro di attività nei confronti delle specie del

genere

Candida

,

Cryptococcus

neoformans

,

Aspergillus

e

Fusarium.

Si comporta sia da fungistatico che da fungicida nei confronti di alcuni miceti filamentosi. Tra gli effetti avversi si ricordano disturbi visivi reversibili. Confusione, allucinazioni, esantemi ed epatiti. Tuttavia offre il vantaggio di poter essere somministrato per via orale ed intravenosa[89,90]_.

Offre però delle controindicazioni in pazienti sottoposti a terapie intensive con clearence di creatinina < 50mL/min o sotto emodialisi per il possibile accumulo di ciclodestrina con potenti effetti tossici[91]_.

Il voriconazolo causa come il Fluconazolo, in relazione all'età ed in pazienti con patologie epatiche e affetti da polimorfismo del CYPZC19, aumento dei livelli sierici di fentanyl e midazolam quando co-somministrati[88,92]_.

Inoltre sono state osservate interazioni con omeprazolo, fenitoina e warfarin.

1.6.1.4

Ruolo del Posaconazolo nella cura e profilassi

antimicotica

Il posaconazolo è la molecola più recente di natura azolica. Offre attività contro

Candida spp.

,

Aspergillus spp.

,

Cryptococcus

e

Mucorales

. Al momento pare essere utilizzabile solo per via orale (assorbita meglio se ingerita con cibi grassi).

Per questo motivo trova scarsa utilità nei pazienti critici sottoposti a cure intensive. La sua scelta come farmaco di elezione in pazienti neutropenici affetti da leucemia trova tuttavia ampio consenso nei trattamenti antimicotici a scopo preventivo[93]_{. Ciononostante viene}

anche impiegato come farmaco di seconda linea nelle aspergillosi invasive, ma con scarsi effetti invece nei confronti delle mucormicosi[94]_.

1.7 Cura e profilassi delle Aspergillosi Invasive (AI)

Le patologie imputabili al genere

Aspergillus

attualmente sono trattate attraverso tre classi di agenti antimicotici. Polieni (Amfotericina B), echinocandine e azoli sono le classi farmaceutiche più utilizzate come farmaci antimicotici[95,96]

.

Molti autori hanno da sempre auspicato un trattamento antimicotico al solo sospetto di “AI” in quanto la mortalità in casi di infezione rimane statisticamente alta. Per molti anni l'amfotericina B ha rappresentato l'antimicotico di primaria scelta fino a quando indagini mirate hanno rilevato un'alta incidenza delle resistenze nei confronti della molecola da parte del genere

Aspergillus

. Ciò ha prodotto una limitazione negli approcci preventivi a base di Amfotericina B (AmB) nei pazienti affetti da aspergillosi invasiva conducendo i ricercatori verso nuove preparazioni a base di lipidi e amfotericina B (LABA)[97]

.

Ad oggi i clinici per il trattamento delle AI si avvalgono di terapie elettive dove la primaria scelta ricade sul voriconazolo[98]

.

L'itraconazolo tuttavia rimane il più utilizzato nei trattamenti di aspergillosi polmonare concomitante ad allergie e in condizioni di patologie croniche come le fibrosi polmonari[3]_.

Per contro come descritto in precedenza il posaconazolo è utilizzato in profilassi preventiva nei soggetti con disturbi ematopoietici e quindi a rischio di aspergillosi[99,100]

1.8 Gli Azoli in Medicina Veterinaria

L'unico farmaco autorizzato al commercio per la veterinaria è l'ITRAFUNGOL® destinato alla specie felina. Di recente allestimento è la preparazione per uso topico[32]

.

L'ITRAFUNGOL® a base di itraconazolo, è un triazolico di sintesi ad ampio spettro con elevata attività contro i dermatofiti (

Trichophyton

spp,

Microsporum

spp.), lieviti (

Candida

spp.,

Malassezia

spp.), vari funghi dimorfi, zigomiceti ed eumiceti (es.

Aspergillus spp

.).

La proprietà farmacologica rispecchia appieno quanto detto per il meccanismo di azione dei triazoli. Infatti mostra capacità altamente selettiva di legarsi agli iso-enzimi del citocromo P450 fungino. Questo conduce ad inibizione della sintesi dell’ergosterolo, ad alterazione della funzione enzimatica delle proteine di membrana e di conseguenza della permeabilità della membrana stessa. Tale effetto è irreversibile e provoca la degenerazione strutturale.

1.9 Molecole azoliche nella cura e nella prevenzione delle

fitopatologie

Tra le molecole triazoliche che l'industria farmaceutica presta alla cure e alla prevenzione delle fitopatologie si ricordano quelle a base di

ciproconazolo, propiconazolo, tebuconazolo, tetraconanzolo.

In Tabella n. 1 vengono riportati alcuni principi attivi azolici con relative indicazioni d'uso e numero di registrazione per l'immissione al commercio.

1.10 Introduzione alla farmaco-resistenza

L'antimicotico-resistenza può essere definita come una resistenza microbiologica o clinica, o come un'associazione delle due resistenze che si verificano quando la crescita del patogeno e l'infezione è inibita da una concentrazione antimicrobica più alta rispetto al range visto per i ceppi non sottoposti a trattamento.

La resistenza clinica è definita dalla situazione in cui l'infezione è inibita da una concentrazione di agente antimicrobico che è associato con alta percentuale di fallimento terapeutico.

In altri termini il patogeno è inibito da una concentrazione più alta dei normali dosaggi ritenuti sperimentalmente efficaci e sicuri per l'uomo. In riferimento alla sensibilità di miceti agli azoli, dati epidemiologici stanno portando a maturare l'idea di uno sviluppo e di un innalzamento dei tassi di resistenza del genere

Aspergillus

nei confronti degli azoli. Il fenomeno per come è stato indagato si dimostra in continua crescita al punto da rendere più indaginosa la gestione dei pazienti nonostante i nuovi agenti antifungini. Negli anni sono stati condotti dai ricercatori test in vitro sulla sensibilità dei miceti agli antimicotici, e spesso i risultati portano talvolta verso un'incompleta attività verso le micosi. Negli ultimi anni sono stati standardizzati metodi di studio oggi considerati affidabili e disponibili dal

Clinical and Laboratory Standard

Institute

(CLSI) in USA e dall'

European Committee on Antimicrobial

Susceptibility Testing

(EUCAST) in Europa per la conduzione di studi sulla sensibilità con alto coefficiente di riproducibilità.

dati) per il calcolo di breakpoint clinici e valori di cut-off epidemiologici. In tal senso vogliamo ricordare che il cut-off scaturisce dai valori di sensibilità espressi dai ceppi selvaggi ancora privi di meccanismi di resistenza verso uno specifico principio attivo.

Per breakpoint si intende la dose terapeutica ritenuta efficace entro range di sicurezza per i destinatari e ricavata a partire da studi di farmacocinetica e di farmacodinamica e dalle evidenze cliniche riscontrate in Europa in relazione a specie-ceppo identificato e alla condizione del paziente. Questo comporta un continuo aggiornamento dei valori di breakpoint, assegnati così sulla base dei dati ricavati dalle prove di sensibilità in vitro. Conseguentemente, come previsto dalla “

European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing”,

bisognerebbe volgere maggiormente l'attenzione sui valori delle MICs espressi dai patogeni che sulla classe di sensibilità/resistenza momentaneamente assegnata agli isolati al momento della valutazione delle MICs poiché i breakpoint possono differire in base alla specie di destinazione cui è rivolto il principio attivo. Motivo per cui, in base a quanto consigliato dal metodo

EUCAST,

ogni valore di MIC, espresso nei confronti di un principio attivo valutato, si tradurrà per gli isolati rientranti nella categorie sensibile, intermedia e resistente in:

isolato rispondente al trattamento

isolato ancora rispondente al trattamento

isolato probabilmente refrattario al trattamento comunemente ritenuto efficace e suggerito dalla farmacopea internazionale.

Di conseguenza il valore delle MICs, qualora mutevole nel tempo, contribuirebbe nel facilitare il riconoscimento di situazioni d'emergenza riferibili ad iniziali meccanismi di resistenza che potrebbero verificarsi negli anni a seguire, e poter così anticipare con gestioni appropriate fenomeni riferibili a meccanismi di resistenza eventualmente irreversibili o per lo meno difficilmente contrastabili.

1.11 Meccanismi di resistenza

Per una migliore esplicazione si vuole ricordare che nel Regno degli esseri viventi è presente una parte fissa nel DNA che si ripete in tutti i Domini. Questa parte fissa del DNA codifica per l'espressione di molecole facente parte della super-famiglia di enzimi raggruppati con il nome di Citocromo-P450 (CYP450). Ogni enzima è codificato da una lunga serie di codoni formati a loro volta da una tripletta di nucleotidi, lungo l'mRNA, considerata l'unità codifcante per uno specifico aminoacido durante la sintesi proteica. Della super-famiglia CYP450 gli enzimi vengono per convenzione chiamati CYP.

Ogni isoenzima CYP nella nomenclatura è corredato di un numero.

In definitiva la nomenclatura prevede lo stesso nome sia per l'enzima che per il gene che lo codifica. L'enzima che ci riguarda in questo argomento è l'enzima CYP51A, più conosciuto come 14-alpha-metil-lanosterolo-demetilasi, codificato dal gene omonimo.

Nella resistenza agli antimicotici ad oggi il più comune meccanismo di azolo resistenza riportato riguarda la mutazione del gene cyp51A che porta ad alterazioni del target proteico degli azoli. La mutazione porta

alla sostituzione di nucleotidi in uno o più codoni che esprimono per l'enzima.

La frequenza di

A. fumigatus

resistente agli azoli è stata considerata bassa fino a pochi anni or sono, ma tuttavia sono in continua crescita in Europa casi d'emergenza riferibili alla multi-azolo resistenza[101]

.

Nel 2012 in Olanda un meccanismo dominante di resistenza è stato riferito a TR/L98H in cyp51A. In campioni isolati da ricoverati in ospedali olandesi la prevalenza di resistenza agli azoli variava tra lo 0.8% ed il 9,4%. Si è ipotizzato che il meccanismo di resistenza TR/L98H sviluppasse nell'ambiente stesso. Infatti in Olanda gli azoli sono frequentemente utilizzati per la protezione delle colture e la conservazione dei materiali. Secondo i ricercatori è verosimile che la resistenza delle spore di alcuni ceppi normalmente presenti in ambiente, una volta inalate nelle vie aeree conduca ad infezioni cliniche. Dagli autori furono auspicati trattamenti alternativi, come l'utilizzo di formulazioni lipidiche di amfotericina B o una combinazione di voriconazolo ed echinocandina. Tuttavia sono pochi i dati a supporto di queste scelte[102]

.

1.12 Resistenza agli antimicotici azolici del genere Aspergillus

L'azolo resistenza di

Aspergillus

è stata riportata in Cina, Canada, Stati Uniti e in parecchi altri paesi europei, con particolari livelli di emergenza osservati in Olanda e nel Regno Unito.

La resistenza di

A. fumigatus

è stata riportata per la prima volta nel 1997 dopo un lavoro fatto su isolati degli anni 80. Il fenomeno fino al

2004 era considerato di rara evenienza sia in UK che in Olanda[103]

.

Una recente indagine sulla azolo-resistenza condotta su

A. fumigatus

presentata al Mycology Reference Centre Manchester, United Kingdom, metteva in luce un progressivo aumento di casi di resistenza, che andavano in aumento dallo 0% del 1997 al 20% del 2009

.

Inoltre il 78% degli isolati resistenti si era dimostrato anche multi-azolo resistente. Significativa fu l'osservazione che permise di individuare una percentuale del 78% tra i resistenti che non presentavano mutazione al codone 98 del gene Cyp51A, ritenuta storicamente come la causa capace di conferire resistenza agli azoli nella specie di

A. fumigatus

[104]_.

Nel 2008 sempre più casi suggerivano l'emergenza di una resistenza verso diverse molecole azoliche[105-109] _{e sempre più verosimile era}

considerato come fattore di rischio l'utilizzo in agricoltura degli azoli[107,108]

.

Anche in Spagna nel 2001 sono state condotte indagini di sensibilità in vitro su 24 specie di

Aspergillus

nei confronti dell'amfotericina B, fluconazolo, dell'itraconazolo, del ketoconazolo e della 5-fluorocitosina. La resistenza di ceppi patogeni all'amfotericina B e alla 5-Fluorocitosina si era dimostrata bassa, mentre la resistenza agli azoli fu significativa, specialmente nei confronti del fluconazolo (36%). Molti di questi patogeni, presentano problemi di resistenza intrinseca. Nelle infezioni, la corretta identificazione di specie e lo studio della sensibilità in vitro è importante per la scelta di un adeguato trattamento antifungino[110]_.

Fino al 2009 la prevalenza e l'incidenza delle resistenze cliniche in Olanda erano sconosciute. Fu così programmato uno studio di

sorveglianza multicentrico al fine di determinare gli effetti della resistenza e condurre verso nuove strategie di gestione sulla salute pubblica. Dal 2007 al 2009, campioni di

Aspergillus spp

furono sottoposti a screening al fine di valutare la resistenza nei confronti dell'itraconazolo. Fu osservata una prevalenza di ceppi resistenti all'itraconazolo del 5,3%. Si evidenzio che i ceppi azolo-resistenti albergavano più frequentemente in pazienti con patologie oncologiche o ematologiche rispetto a pazienti azolo-naive (non trattati) che tuttavia in una percentuale del 64% erano portatori di ceppi resistenti. Si trovò che le aspergillosi invasive associate ad alti tassi di mortalità in Olanda dovuti a fenomeni di resistenza multiazolica erano molto diffusi[111]_.

In vitro però la ridotta sensibilità delle specie

Aspergillus

agli azoli è rimasta abbastanza bassa nella gran parte delle indagini scientifiche che si sono avvalsi dell'itraconazolo come principio attivo di riferimento[112,103]_.

Gli studi condotti in Europa hanno mostrato costante associazione tra l'alto numero dei casi di immuno-compromissione nella specie umana e l'utilizzo talora senza controllo e intensivo di formule anticrittogamiche in campo agricolo. Ad oggi l'emergenza dei trattamenti terapeutici fallimentari non trova una continuità statistica tale da imporre certezze deduttive sulle cause. È tuttavia opinione crescente che esista un legame tra utilizzo di massa di principi azolici e fallimento terapeutico, motivo per cui negli ultimi anni in Nord Europa sono stati affrontati studi sui meccanismi d'azione degli azoli e studi di farmaco sensibilità per meglio apprendere i meccanismi farmacocinetici e le risposte adattive delle

specie micotiche indagate.

È pensiero comune che i diversi fattori citati possano provocare nei miceti modificazioni strutturali fenotipiche espressione di variabilità genetica tale da indurre resistenza farmacologica nei confronti degli azoli, molecole peraltro di nuova formulazione approvate solamente agli inizi degli anni '90.

La mancanza di formule terapeutiche alternative potrebbe condurre a fenomeni di emergenza l'intero sistema sanitario. Da ciò si intuisce l'importanza che assume una sorveglianza epidemiologica circa la presenza di ceppi resistenti o sensibili, come anche la valutazione delle Concentrazioni Minime Inibenti (MIC) dei ceppi patogeni opportunisti al fine di raffinare le strategie di utilizzo dei principi attivi su tutti i livelli di utilizzo degli antimicotici a partire dall'industria agricola-alimentare, passando per la veterinaria, fino a giungere alle strategie diagnostiche e terapeutiche impiegate in medicina umana.

Per questo motivo è stata sviluppata una tesi avente come oggetto sperimentale la: “Valutazione della sensibilità all’itraconazolo di isolati ambientali e clinici di miceti del genere

Aspergillus

”.

Tabella n. 1

Nome commerciale

Principio attivo Registrazione del Ministero della

Salute

Indicazioni

AGORA® Ciproconazolo n. 12920 del

23.01.2006 Septoriosi (Septoria spp.) Ruggini (Puccinia spp.) Oidio (Erysiphe graminis)

PROPYDOR® Propiconazolo n. 11157 del 18.01.2002

Elmintosporiosi Ruggini

PROPYDOR® Propiconazolo n. 11157 del

18.01.2002

Oidio

Septoriosi Monilia Cladosporiosi

FOLICUR® Tebuconazolo n. 15222 del

19/12/2011

Oidio

Ticchiolatura Monilia Bolla

FOLICUR® Tebuconazolo n. 15222 del

19/12/2011

Ruggini

Stemphylium Fusarium Mal del piede

DOMARK® Tetraconazolo n° 8803 del

6.03.1996

Oidio da:

(Uncinula necator ) (Erysiphe cichoracearum) (Sphaerotheca fuliginea)