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CARIOLOGIA 4.1 Introduzione
Nel capitolo precedente abbiamo visto che il progetto biologico di ogni organismo vivente è contenuto nel suo DNA, un composto organico la cui molecola è dotata di proprietà che ne permettono la produzione di copie identiche da trasmettere alla discendenza (duplicazione) e di
"stralci", sotto forma di RNA messaggero, tradotti nella sintesi proteica (trascrizione).
Nei primi capitoli abbiamo visto che gli organismi viventi si distinguono in due grandi gruppi:
i Procarioti, il cui corpo è composto da una sola cellula priva di membrane interne, e gli Eucarioti, il cui corpo è composto da una o più cellule dotate di membrane interne. Sia le cellule procariote sia quelle eucariote sono provviste di una o più molecole di DNA. Le proprietà fondamentali del DNA (duplicazione e trascrizione) si mantengono sostanzialmente invariate sia nei Procarioti sia negli Eucarioti, ma in questi ultimi, più sofisticati, i meccanismi sono più complessi.
In questa sede approfondiamo i meccanismi attraverso i quali una copia del progetto biologico viene riprodotta e trasmessa da una cellula eucariote quando si riproduce.
4.2 Cromatina e cromosomi
Le cellule degli Eucarioti assumono un aspetto differente in funzione della fase che attraversano. Durante la vita "normale" della cellula (impropriamente detta a riposo), il nucleo è ben distinto dal citoplasma e il suo contenuto è costituito da una sostanza indifferenziata di aspetto granuloso, detta cromatina. Quando la cellula è invece in fase di moltiplicazione (divisione cellulare), il nucleo cambia completamente aspetto: la membrana nucleare e il nucleolo si dissolvono e al posto della cromatina compaiono corpuscoli di forma e numero caratteristici per ogni specie, detti cromosomi, Questa differenza è dovuta a differenti modi con cui la stessa sostanza fondamentale, il DNA, si organizza.
La cromatina è costituita dalle molecole di DNA distese e avvolte su proteine particolari dette istoni. Il risultato è una struttura "dispersa" che si può assimilare ad un ammasso disordinato di collane di perle. Questa struttura permette al DNA di assolvere alle sue funzioni: la doppia elica, infatti, è in grado si svolgersi e aprirsi sia per la
trascrizione del RNA messaggero per la duplicazione della doppia elica.
La struttura cromosomica evidente durante la divisione è costituita dalle molecole di DNA fortemente spiralizzate (Fig. 26). Il risultato è una struttura in cui le molecole di DNA sono nettamente separate e distinte l'una dall'altra. Questa struttura permette ai cromosomi di essere spostati, processo che si svolge nella divisione.
Cromatina e cromosomi possono essere paragonati ad un insieme di matasse di lana. La cromatina corrisponde ad un ammasso di fili distesi e mescolati tra loro. I cromosomi corrispondono invece ai fili avvolti in gomitoli separati, facilmente separabili l'uno dall'altro. La prima struttura permette l'uso dei singoli fili, pezzetto per pezzetto, la seconda struttura permette lo spostamento ordinato dei fili senza imbrogliare l'ammasso.
Fig. 25. Cromosomi mitotici, visibili durante la fase centrale della divisione cellulare.
Fig. 24. Cromatina.
4.3 Cromosomi
Prima della divisione cellulare, il DNA dei cromosomi subisce il processo di condensazione (Fig. 26): ogni filamento si avvolge a formare una spirale a elica (I livello).
Questa fibra si avvolge a sua volta a elica per formare una spirale di II livello. Dopo altre due spiralizzazioni, il cromosoma assume la forma definitiva visibile durante la divisione cellulare (Fig. 27).
In questa fase, ciascun cromosoma è composto da due bracci uguali, detti cromatidi, uniti in corrispondenza di una strozzatura, detta centromero, e colorati da bande trasversali. L'estremità di ogni cromatidio è detta telomero ed è formata da un particolare ripiegamento del filamento di DNA che ha lo scopo di impedire che molecole diverse si uniscano agli estremi pregiudicando il corretto funzionamento della divisione cellulare. Cromosomi diversi si distinguono per la lunghezza dei cromatidi, per la posizione del centromero e, infine, per la disposizione delle bande trasversali; queste caratteristiche sono costanti per ogni cromosoma, che può pertanto essere riconosciuto.
Ogni specie è caratterizzata da un numero definito di cromosomi. Non c'è relazione tra numero di cromosomi e complessità dell'organismo: ad esempio, l'Uomo ha 46 cromosomi, mentre il Paramecio, un organismo unicellulare, ha centinaia di cromosomi. La differenza consiste nel modo diverso con cui sono organizzate le informazioni genetiche nelle varie specie. Un aspetto invece importante è che nell'ambito di una determinata specie il numero dei cromosomi è costante e la presenza di un solo cromosoma in più o in meno può provocare gravi disfunzioni fino ad essere letale: nella specie umana, ad esempio, la sindrome di Down è causata dalla presenza di una terza copia del cromosoma n. 21. Altre patologie più o meno gravi sono
causate da alterazioni della forma di un cromosoma o della posizione delle bande trasversali.
L'insieme dei cromosomi di una specie è detto cariotipo. Da quanto detto è perciò evidente che specie diverse hanno diversi cariotipi. Negli Animali, nelle Piante e nei Funghi più evoluti, il cariotipo è "raddoppiato", in quanto ogni cromosoma è rappresentato da due copie, uguali nella forma, nelle dimensioni e nella disposizione delle bande colorate e del centromero. Gli organismi con cariotipo "raddoppiato" sono detti diploidi mentre gli organismi con cariotipo semplice sono detti aploidi. La diploidia e l'aploidia sono spesso indicate con i simboli 2n e n, dove n indica il numero base di cromosomi. Nelle piante coltivate ricorre spesso la tetraploidia (4n) e l'esaploidia (6n), ottenute con la domesticazione delle specie selvatiche.
Il cariotipo dell'Uomo è composto da 23 coppie di cromosomi (n=23, 2n=46). Nell'ambito di questo cariotipo, i cromosomi delle prime 22 coppie sono detti autosomi. La 23a coppia è composta da due cromosomi di forma uguale nella femmina (XX) e di forma diversa nel maschio (XY).
Questi cromosomi sono perciò detti sessuali. I cromosomi di una stessa coppia sono detti omologhi. Due cromosomi omologhi sono uguali nella forma, nella posizione del centromero, nella disposizione delle bande colorate e nel tipo di informazioni genetiche che contengono (geni).
Fig. 26. Condensazione del DNA A: cromosoma allo stato di cromatina con il filamento di DNA disteso e legato agli istoni. B: spiralizzazione di I livello. C: spiralizzazione di II livello.
Per formare il cromosoma mitotico si hanno altri due livelli di
spiralizzazione.
Fig. 27. Struttura di un cromosoma mitotico.
4.4 Richiami: la struttura del DNA
Nota: questo paragrafo non è oggetto di verifica, ma è inserito a scopo di consultazione per comprendere il significato di ogni termine usato nel capitolo.
Il DNA (acido deossiribonucleico) è un acido nucleico, formato dall'unione di due catene di nucleotidi affiancate e avvolte reciprocamente a elica. Per questo motivo, ogni singola catena è detta semielica. L'unità elementare di una semielica è il nucleotide, una molecola organica composta dall'unione di tre diverse molecole semplici:
1) Un gruppo fosfato: è una molecola inorganica derivata dall'acido fosforico, composta da un atomo di fosforo legato a quattro atomi di ossigeno. Il gruppo fosfato si lega sempre ad una molecola organica attraverso uno degli atomi di ossigeno (Fig. 28).
2) Il deossiribosio: è uno zucchero a cinque atomi di carbonio. Deve il suo nome perché deriva da una molecola di ribosio che ha perso il gruppo OH legato al carbonio n. 2. La molecola è composta da un anello formato dall'atomo di ossigeno e dai primi quattro atomi di carbonio. Il carbonio n. 5 si lega al quarto atomo di carbonio sopra il piano della molecola (Fig. 29).
3) Una base azotata: è una molecola organica composta da uno o due anelli eterociclici, formati da atomi di carbonio e atomi di azoto.Si tratta di molecole organiche contenenti azoto.
La presenza gli atomi di idrogeno legati all'azoto permette la formazione di legami idrogeno tra molecole differenti, una proprietà fondamentale per la funzionalità degli acidi nucleici.
Le basi azotate presenti nel DNA sono quattro (Fig. 30) e
si distinguono in due tipi: le purine (adenina e guanina) e le pirimidine (timina e citosina).
Fig. 29. Deossiribosio. Sopra:
formula di struttura completa.
Sotto: formula semplificata (non vengono mostrati gli atomi di carbonio e di idrogeno. In rosso sono indicati i numeri d'ordine degli atomi di carbonio.
Fig. 28. Gruppo fosfato.
Fig. 30. Basi azotate del DNA. Le frecce blu indicano gli atomi che formano i legami a idrogeno. Le frecce rosse gli atomi di azoto che formano il legame glicosidico con il deossiribosio.
Basi pirimidiniche e puriniche sono fra loro complementari, perché si legano reciprocamente per mezzo di legami a idrogeno. Per la posizione che gli atomi interessati hanno nella molecola, la complementarità è specifica: la timina si lega infatti solo con l'adenina, attraverso due legami a idrogeno, la citosina solo con la guanina, attraverso tre legami a idrogeno (Fig. 31).
In ogni nucleotide, il gruppo fosfato si lega al carbonio n. 5 dello zucchero per mezzo di un legame estere, fra uno dei gruppi ossidrile dell'acido fosforico e il gruppo ossidrile del carbonio n. 5: l'eliminazione di una molecola d'acqua permette la formazione di un ponte ossigeno fra il fosforo e il carbonio (Fig. 32).
Analogamente, la base azotata si lega al carbonio n. 1 dello zucchero per mezzo un legame glicosidico, fra il gruppo N-H della base e il gruppo ossidrile del carbonio n. 1:
l'eliminazione di una molecola d'acqua permette la formazione di un legame fra l'azoto e il carbonio (Fig. 33).
La molecola di un nucleotide risulta perciò composta da una base azotata legata al carbonio n. 1 dello zucchero e da un gruppo fosfato legato al carbonio n. 5 (Fig. 34). I vari nucleotidi differiscono per il tipo di zucchero (ribosio o deossiribosio) e per la base azotata.
Fig. 34. Struttura di un nucleotide (deossiadenosina monofosfato).
Le frecce indicano i gruppi funzionali attraverso i quali avviene la
polimerizzazione degli acidi nucleici, per formazione di un legame estere tra il gruppo fosfato di un nucleotide e il carbonio n. 3 dello zucchero del nucleotide successivo.
Fig. 33. Formazione del legame glicosidico fra il deossiribosio e una base azotata, l'adenina.
Fig. 32. Formazione del legame estere tra l'acido fosforico e il deossiribosio.
Fig. 31. Complementarità delle basi azotate per mezzo della formazione dei legami a idrogeno.
Nel DNA, i nucleotidi polimerizzano formando due catene che si legano per mezzo di legami a idrogeno instaurati tra basi azotate complementari. La polimerizzazione avviene per formazione di legami estere tra il gruppo fosfato di un nucleotide e il carbonio n. 3 del deossiribosio del nucleotide adiacente. Nella figura 35 è rappresentata la struttura di una molecola di DNA composta da 5 monomeri. In realtà una sola molecola è in genere composta da milioni di nucleotidi.
Un aspetto importante è che le due catene sono antiparallele, ovvero hanno polarità invertite: nella figura, la catena di sinistra inizia con il gruppo fosfato del primo nucleotide e termina con il deossiribosio dell'ultimo nucleotide (direzione 5'→3'), mentre la catena di destra inizia con deossiribosio del primo nucleotide e termina con il gruppo fosfato dell'ultimo nucleotide (direzione 3'→5'). Infatti, seguendo l'ordine degli atomi nelle due catene si hanno le seguenti polarità invertite:
HO P O 5' 3' O P O → . . . → 5' 3' O P O 5' 3' OH
HO 3' 5' O P O 3' 5' ← . . . ← O P O 3' 5' O P OH
Fig. 35. Struttura della molecola del DNA. Sono cerchiati in rosso i gruppi OH che formano l'inizio e la fine di ogni catena.
Il doppio filamento di DNA subisce una torsione complessa che porta alla formazione di una doppia elica come si vede in figura 36.
4.5 Duplicazione del DNA negli Eucarioti
La divisione di una cellula è sempre preceduta da una duplicazione del suo DNA, in modo che a ciascuna cellula figlia sia assegnata una copia del progetto biologico. La duplicazione del DNA è un processo biochimico complesso che si svolge secondo il modello semiconservativo: le due nuove molecole sono una copia esatta dell'originale e ciascuna mantiene una semielica "vecchia", ereditata da quella originaria. La "nuova" è invece costruita durante la duplicazione (Fig. 37).
In sintesi, la duplicazione di una molecola di DNA si svolge con i seguenti eventi (Fig. 38):
1) srotolamento della doppia elica del DNA: la duplicazione non parte da una estremità della molecola, bensì ci sono diversi punti di inizio all'interno, individuati da specifiche sequenze di basi azotate;
2) apertura delle forcelle di replicazione: in corrispondenza di ogni srotolamento, i legami idrogeno tra le basi vengono rotti in modo da separare le due semieliche in una bolla di replicazione; da ogni bolla, il distacco delle semieliche procede nelle due direzioni. Quando due forcelle si incontrano, si fondono formando una bolla di replicazione più grande. Alla fine resterà un'unica bolla di replicazione con due forcelle che procedono nelle due direzioni opposte fino alle estremità della molecola;
3) aggiunta in serie dei nucleotidi ad ogni semielica, man mano che la forcella avanza, con formazione dei legami a idrogeno secondo la complementarità fra le basi azotate: alla
Fig. 37. Modello semiconservativo della duplicazione del DNA:
ciascuna nuova molecola conserva la metà di quella originaria.
Fig. 36. Struttura a doppia elica del DNA.
timina si legherà il nucleotide che porta l'adenina (e viceversa), alla citosina il nucleotide che porta la guanina (e viceversa);
4) avvolgimento a doppia elica dei nuovi filamenti man mano che si completano: dietro ogni forcella, il doppio filamento di DNA si è duplicata in due doppie eliche.
L'avanzamento della forcella di replicazione, l'aggiunta dei nuovi nucleotidi ai due filamenti e la stabilizzazione delle nuove semieliche è mediata da una serie di enzimi. Data la complessità del processo, ci limitiamo a menzionare quelli fondamentali: DNA elicasi, primasi, DNA polimerasi, DNA ligasi. Questi enzimi operano in serie come un cantiere di lavoro avanzando lungo la doppia elica madre e rilasciando due eliche figlie. Le fasi fondamentali sono le seguenti:
Fase 1: apertura e avanzamento della forcella di replicazione (Fig. 39).
L'enzima DNA elicasi agisce come il cursore di una cerniera lampo: avanzando lungo la doppia elica, la srotola e rompe i legami a idrogeno tra le basi azotate, provocando l'apertura e l'avanzamento della forcella di replicazione. La doppia elica si divide perciò in due filamenti, detti rispettivamente filamento guida e filamento ritardato.
All'azione della DNA elicasi si associa quella di delle proteine SSB (proteine single-strand binding,
"proteine che legano il singolo filamento"): i due
filamenti tenderebbero a riavvolgersi spontaneamente a elica, ma questo non avviene perché le proteine SSB si legano ai due filamenti tenendoli separati e impedendone il riavvolgimento.
Essendo antiparalleli, la distinzione tra il filamento guida e quello ritardato è importante per comprendere il funzionamento della DNA polimerasi:
Fig. 39. Struttura della forcella di replicazione.
Fig. 38. Formazione e avanzamento delle forcelle di replicazione nella duplicazione del DNA.
- il filamento guida è composto dalla sequenza di nucleotidi che ha polarità 3'→5' secondo la direzione di avanzamento della forcella di replicazione;
- il filamento ritardato è invece composto dalla sequenza che ha polarità 5'→3' secondo la direzione di avanzamento della forcella.
Fase 2: sintesi dei primer.
L'enzima che costruisce i filamenti di DNA, la DNA polimerasi riesce ad attaccare un nucleotide legando il gruppo fosfato del nuovo nucleotide al gruppo OH del carbonio n. 3 di quello precedente. Di conseguenza, questo enzima può funzionare solo se esiste già una sequenza di nucleotidi a cui "appoggiare" i nuovi, mentre non può iniziare una sequenza.
La duplicazione di un filamento richiede perciò un innesco da parte di un altro enzima, detto primasi. La primasi è una RNA polimerasi, ovvero un enzima che costruisce filamenti di RNA.
Questo enzima agisce in successione alla DNA elicasi costruendo un breve filamento di RNA detto primer.
L'inserimento dei primer avviene in modo differente nei due filamenti. Sul filamento guida viene prodotto un solo primer all'inizio della bolla di replicazione. Sul filamento ritardato viene invece costruito un primer ogni volta che si completa la costruzione di un frammento di Okazaki e si deve pertanto iniziare una nuova sequenza.
Gli RNA primer, in una fase successiva vengono rimossi da un enzima specifico e sostituiti dalle sequenze analoghe di DNA.
Fase 3: sintesi dei nuovi filamenti di DNA.
È la fase principale della duplicazione, mediata dall'enzima DNA polimerasi. Questo enzima opera dietro la DNA elicasi e la primasi su entrambi i filamenti, legando fra loro i nucleotidi che si aggiungono in sequenza man mano che la forcella avanza. Il funzionamento della DNA polimerasi sui due filamenti è differente: come si è detto in precedenza, l'enzima lega il gruppo fosfato del nuovo nucleotide al carbonio 3 dell'ultimo nucleotide aggiunto, perciò è in grado di costruire un filamento di DNA solo procedendo in direzione 5'→3'.
Sul filamento guida, la DNA polimerasi procede senza interruzioni in quanto la direzione di avanzamento coincide con la direzione di costruzione del nuovo filamento (vedi Fig. 40).
Sul filamento ritardato, invece, la DNA polimerasi procede "a sbalzi": dovendo costruire la sequenza seguendo una direzione opposta a quella di avanzamento della forcella, l'enzima lavora in ritardo su un tratto di filamento che è stato ripiegato, fino a raggiungere l'inizio del frammento costruito in precedenza. A questo punto rilascia il ripiegamento e riprende a costruire la sequenza su un altro tratto lasciato scorrere, partendo da un nuovo primer. Questo meccanismo provoca la formazione, sul filamento ritardato, di sequenze complementari "slegate", dette frammenti di Okazaki. Ogni frammento di Okazaki inizia con una sequenza primer e termina, senza legarsi, con
Fig. 40. Innesco delle sequenze per mezzo degli RNA primer nel filamento guida e in quello ritardato.
l'inizio del frammento di Okazaki costruito precedentemente (Fig. 41).
Fase 4: unione dei frammenti di Okazaki.
Dietro il complesso della elicasi, della primasi e della polimerasi, interviene in sequenza un quarto enzima, la DNA ligasi. Questo enzima unisce i frammenti di Okazaki, man mano che si liberano, legando il carbonio 3 dell'estremità di un frammento al gruppo fosfato dell'estremità del frammento adiacente.
Il processo si svolge piuttosto velocemente: ad esempio, il genoma umano comprende diverse centinaia di milioni di nucleotidi, ma l'intero processo di duplicazione si svolge in otto ore.
Fig. 41. Meccanismo di azione della DNA polimerasi sul filamento guida e sul filamento ritardato.
