RIASSUNTO
Un aspetto fondamentale dello sviluppo della circuiteria nervosa è il trasporto del materiale necessario per la formazione delle sinapsi.
Tanto di quello che conosciamo a riguardo deriva da studi di neuroni in coltura, mentre molti aspetti rimangono ancora da investigare in vivo.
In questo lavoro abbiamo studiato in vivo la dinamica del trasporto del materiale sinaptico nel sistema visivo di ratto. A tale scopo combiniamo le nuove tecniche di live-imaging (FRAP e imaging di singoli pacchetti di materiale marcato) che ci permettono di seguire “in diretta” la dinamica del movimento, con le classiche tecniche di immunoistochimica e microscopia elettronica (EM) che consentono di ottenere informazioni di localizzazione strutturale.
Servendoci dell’anticorpo rivolto contro il dominio luminale della proteina sinaptica Synaptotagmin 1 abbiamo dimostrato l’esistenza di cicli di eso-endocitosi in vivo che consentono l’uptake dell’anticorpo negli assoni delle cellule gangliari
retiniche dopo iniezione intraoculare. Il trasporto del materiale così marcato avviene
soprattutto in strutture vescicolari e corpi tubulo-vescicolari. L’80% di questo
materiale si muove lungo gli assoni sia in direzione anterograda che in direzione
retrograda. La maggiore velocità anterograda gli consente di giungere ai terminali
assonali nel cervello dove viene incorporato nelle sinapsi nascenti.
INTRODUZIONE
Le sinapsi sono giunzioni intercellulari specializzate, formate tra i neuroni e le loro cellule target, che consentono di propagare il segnale da una cellula all’altra con un’alta precisione spaziale e temporale.
Dal punto di vista ultrastrutturale le sinapsi sono composte da domini specializzati (Palay, 1956; Gray 1963) il più prominente dei quali è il bottone presinaptico. Ciascun bottone contiene centinaia di migliaia di piccole (~40-50 nm) vescicole sinaptiche (SV, Synaptic Vesicles), tondeggianti e con un lumen chiaro (Fig. 1).
Figura 1. Esempio di sinapsi matura nel collicolo superiore di ratto adulto. Il bottone pre-sinaptico è caratterizzato dalla presenza delle vescicole sinaptiche (SV) e dalla zona attiva (AZ). La fessura sinaptica lo separa dal terminale post-sinaptico che contiene una densa matrice di proteine chimata densità post-sinaptica. Barra di calibrazione 100nm, (Lund e Lund, 1971).
Per mezzo di una fusione regolata con una porzione specializzata del bottone
presinaptico chiamata zona attiva (AZ, Active Zone), le SV rilasciano il loro contenuto
nella fessura sinaptica, un piccolo spazio tra le cellule presinaptica e postsinaptica
(Fig. 1). La zona attiva è caratterizzata da una rete elettrondensa di proteine e
vescicole sinaptiche immerse in questa matrice (Hirokawa et al., 1989; Landis, 1988;
Phillips et al., 2001). Direttamente apposta alla zona attiva presinaptica, la cellula postsinaptica presenta la densità omonima (PSD, Post Synaptic Density), in cui sono concentrati recettori per i neurotrasmettitori, canali ionici voltaggio-dipendenti e varie molecole della via di trasduzione del segnale chimico-elettrico (Palay, 1956; Sheng, 2001). Infine alcune proteine filamentose si estendono attraverso la fessura sinaptica con il compito di tenere allineate l’AZ e la PSD (Fig. 1) (Palay, 1956, Sheng, 2001).
Le SV sono complessi organelli avvolti da membrana che contengono nel dominio luminale piccole molecole idrofiliche, alcune delle quali funzionano da neurotrasmettitori, e ioni. Le SV, con l’arrivo di un potenziale d’azione, vanno incontro a un processo di esocitosi Ca
2+-dipendente durante il quale rilasciano il neurotrasmettitore nella fessura sinaptica. Dopo l’esocitosi, le SV vengono recuperate tramite endocitosi clatrina-dipendente e localmente riciclate per rigenerare vescicole competenti per un nuovo ciclo di eso-endocitosi (per una review si veda Südhof, 2004). Le SV sono state studiate in dettaglio usando una grande varietà di approcci metodologici (per una review si veda Südhof, 2004) che hanno contribuito a definire l’anatomia molecolare (Fig. 2) di una singola SV (Takamori et al., 2006 ). Tra la proteine di membrana più rappresentate in una SV si trovano
Synaptobrevin 2/VAMP2, coinvolta nella regolazione dell’esocitosi, e Synaptotagmin
1, il sensore per il segnale Ca
2+. Queste informazioni, insieme con la descrizione
funzionale del “traffico” delle SV al terminale presinaptico, rendono le SV uno degli
organelli cellulari meglio caratterizzati delle cellule eucariotiche.
Figura 2. Modello tridimensionale di una tipica vescicola sinaptica. Le diverse proteine sono rappresentate nel reale rapporto stechiometrico e illustrate per codice di nome e colore.
(Takamori
et al
., 2006).Molto meno chiaro è invece come le SV o le proteine che le formano raggiungano la loro destinazione in corrispondenza delle sinapsi quando queste si formano durante lo sviluppo del sistema nervoso. L’importanza di acquisire dati su questo argomento deriva non solo dal ruolo chiave dei processi di formazione delle sinapsi nel normale sviluppo, ma anche dall’esistenza di gravi patologie nervose legate a mutazioni che alterano l’efficienza del trasporto assonale delle SV.
L’esempio più noto è la malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2A, una neuropatia
periferica ereditaria, una delle cui forme origina dalla mutazione del motore
molecolare KIF1Bbeta, che causa un accumulo di SV lungo l’assone ed in parallelo
una ridotta efficienza sinaptica (Zhao et al., 2001).
Studi effettuati su colture primarie di neuroni di ippocampo che si sviluppano in vitro hanno mostrato che il materiale sinaptico viaggia lungo gli assoni in “pacchetti”
che po
altra parte sulle PTV non sono presen
ssono essere discriminati sulla base del loro contenuto, dimensione e forma (Ziv e Garner, 2004).
Le proteine della AZ come ad esempio Piccolo e Bassoon viaggiano in strutture vescicolari chiamate PTV (Piccolo-Bassoon Transport Vesicles). A livello ultrastrutturale queste appaiono come corpi vescicolari densi e compatti dal diametro di ~80 nm (Zhai et al., 2001). Questi carriers portano diverse proteine con un preciso rapporto stechiometrico cosicché poche di esse (due o tre) bastano a permettere l’assemblaggio di una AZ funzionante al terminale presinaptico (Shapira et al., 2003).
Studi di colocalizzazione hanno indicato che le PTV trasportano anche Synataxin e SNAP-25, due proteine del macchinario necessario per l’eso-endocitosi delle SV e per il rilascio di neurotrasmettitore alle sinapsi. D’
ti altri componenti delle SV come ad esempio Synaptobrevin 2/VAMP-2, Synaptophysin e Synaptotagmin (Zhai et al., 2001).
Il materiale delle SV viaggia su carriers distinti dalle PTV. Esperimenti di live
imaging della proteina VAMP2 coniugata a GFP, durante la sinaptogenesi in colture
neuronali di ippocampo, evidenziano il trasporto di “pacchetti” di materiale marcato
con VAMP-GFP che a livello di microscopia luce colocalizzano con altre proteine
delle SV (SV2 e Synapsin I), così come con alcune proteine presinaptiche compresi
canali calcio voltaggio-dipendenti e con un componente del macchinario di endocitosi
(Amphiphysin I) (Ahmari et al., 2000). Queste grandi strutture GFP-positive, in
movimento lungo gli assoni, sono state identificate come organelli di morfologia
tubulo-vescicolare (TVB, Tubulovesicular Bodies). Questi risultati suggeriscono la
possibilità dell’esistenza di un’unità mobile eterogenea che contiene la maggior parte
delle componenti richieste per la costruzione del terminale presinaptico. E’
importante però considerare una limitazione del metodo di indagine usato per formulare queste osservazioni. Ahmari e colleghi identificano i TVB in base all’osservazione retrospettiva, con microscopio elettronico, della regione in cui in microscopia luce evidenziavano la presenza della fluorescenza di VAMP-GFP. Le strutture tubulo vescicolari che loro vedono in questa zona non è detto che siano quelle che portano VAMP-GFP. Per questo sarebbe utile guardare al livello di microscopia elettronica direttamente un marcatore sulla struttura da analizzare. Allo stesso modo anche nei neuroni ganglionari della radice dorsale (dorsal root ganglion cells),
t
lum-Ab in strutture tipo SV dimostra l’esistenza di cicli di eso-endocitosi, ma non assicura che dopo l’uptake le SV viaggino in quanto tali, fino ai terminali sinaptici.
si è giunti all’identificazione di organelli tubulo-vescicolari come carriers generici per le proteine sinaptiche lungo gli assoni (Nakata et al., 1998).
In apparente contrasto con questi risultati, sono i dati ottenuti da altri protocolli
sperimentali che usano un anticorpo rivolto contro il dominio luminale della proteina
Synaptotagmin 1 (Syt
lum-Ab). Synaptotagmin 1 è una proteina transmembrana,
definita il sensore calcio delle SV. Dopo la fusione delle vescicole sinaptiche con la
membrana plasmatica, il dominio luminale della proteina Synaptotagmin rimane
esposto alla superficie neuronale, permettendo il legame di Syt
lum-Ab al proprio
epitopo e la sua seguente internalizzazione con l’endocitosi delle vescicole
sinaptiche (Fig. 3). Questa tecnica si è rivelata un ottimo metodo per verificare
l’esistenza di vescicole sinaptiche che ciclano attivamente. Infatti questi studi hanno
rivelato l’esistenza di cicli di eso-endocitosi negli assoni in sviluppo. Tali cicli
permettono l’uptake di Syt
lum-Ab in piccole vescicole molto simili alle SV, e solo
raramente in TVB (Matteoli et al., 1992, Kraszewski et al 1995). Questi autori
propongono che il materiale delle SV viaggi in gruppi di vescicole trasparenti (clear
vesicles) e non in TVB. Tuttavia l’uptake di Sy
Figura 3. Uso dell’anticorpo contro il dominio intravescicolare della proteina delle vescicole sinaptiche Sinaptotagmin1 (Sytlum-Ab) per monitorare il riciclo e il traffico delle vescicole sinaptiche in neuroni in coltura (Matteoli et al., 2004).
Una seconda questione ancora aperta è se il materiale sinaptico trasportato sia effettivamente diretto o meno alle sinapsi. Tutti gli studi in vitro concordano sull’osservazione che questo materiale sia altamente mobile lungo gli assoni, ma ci sono discrepanze circa la direzionalità del movimento. Alcuni studi evidenziano un movimento principalmente anterogrado (Ahmari et al., 2000; Nakata et al., 1998; Lee et al., 2003); altri invece, riportano osservazioni circa repentini e continui cambi di
direzione che inducono nei casi estremi un’apparente mancanza di trasporto netto
(Dai e Peng, 1996; Kaszewski et al., 1995; Sabo et al., 2006; Sytnyk et al., 2002). Si
deve considerare però che le sinapsi in vitro si trovano e possono formarsi lungo
tutta l’estensione dell’assone. E’ chiaro che in un tale sistema è difficile discriminare
se la bidirezionalità indichi il movimento verso specifiche sinapsi nascenti, che
possono trovarsi sia in posizione anterograda sia in posizione retrograda rispetto al
pacchetto di materiale che viaggia, oppure rifletta un comportamento incontrollato dei
pacchetti che pattugliano l’assone e che eventualmente si bloccano nel sito
sinaptico. Questo punto potrebbe essere chiarito da uno studio della dinamica del
trasporto del materiale sinaptico in vivo, dove le sinapsi sono localizzate solo alla
terminazione assonale. Un sistema in vivo permette quindi una separazione netta tra l’assone, privo di sinapsi, e il suo terminale dove si formano le sinapsi.
Per cercare di risolvere gli aspetti conflittuali del trasporto del materiale delle SV, abbiamo affrontato in questo lavoro il problema della dinamica del trasporto negli assoni usando come modello le cellule ganglionari retiniche di ratto in sviluppo. Lo studio acquista anche maggiore interesse considerando la scarsezza di informazioni circa il trasporto del materiale sinaptico in vivo rispetto alla grande quantità di informazioni che invece si hanno da studi in vitro. La maggior parte degli studi in vivo si sono serviti della microscopia elettronica ed ottica combinate alla biochimica per investigare le caratteristiche macroscopiche del trasporto negli assoni. Questi studi si sono focalizzati sul trasporto in massa del materiale sinaptico (bulk transport) individuando la componente veloce del trasporto assonale attraverso cui viaggiano la maggior parte di queste proteine, ma i carriers impegnati nel trasporto e la loro dinamica sono ancora da definire. Studi di microscopia elettronica del trasporto assonale, condotti mediante l’interruzione (crash) del nervo dopo il trattamento del tessuto con traccianti radioattivi, hanno portato all’identificazione di strutture membranose tubulo-vescicolari che si accumulano nella regione prossimale dell’interruzione (trasporto anterogrado) e grandi e densi corpi membranosi che si accumulano nella zona distale dell’interruzione (trasporto retrogrado), ma non all’identifcazione dei carriers per le diverse proteine (Tsukita e Ishikawa, 1980; Li e Dahlström, 1997).
In questo lavoro abbiamo cercato di analizzare in vivo la dinamica del
trasporto di materiale delle SV in assoni in sviluppo, scegliendo come modello di
studio gli assoni delle cellule ganglionari (RGCs) di ratto. Le RGCs rappresentano
l’unica uscita per i neuroni della retina: i loro assoni convergono verso il centro della
retina a formare la testa del nervo ottico (Optic Disc); da qui costituiscono il nervo
ottico (ON, Optic Nerve) che proietta ai centri visivi superiori. Le fibre retiniche terminano in diversi nuclei visivi del talamo responsabili di varie funzioni del sistema visivo, come il collicolo superiore (SC, Superior Colliculus), il nucleo soprachiasmatico (SN, Suprachiasmatic Nucleus) ed il nucleo genicolato laterale dorsale (dLGN, dosal Lateral Geniculate Nucleus) (Fig. 4).
Figura 4. Illustrazione schematica del sistema visivo di mammifero. Gli assoni delle RGCs da diverse regioni della retina convergono verso il disco ottico e formano il nervo ottico. Questo attraverso il chiasma ottico proietta ipsilateralmente o controlateralmente ai principali target visivi: il nucleo genicolato laterale dorsale (dLGN) e il collicolo superiore (SC).
