ABSTRACT RIASSUNTO

INDICE

ABSTRACT RIASSUNTO

1. INTRODUZIONE 1

1.1. Apprendimento e memoria 1

1.2. Studio dei meccanismi di base della memoria: tecniche a confronto 4

1.3. Il paradigma del contextual fear conditioning 7

1.4. Il circuito nervoso della paura 9

1.5.Modificazioni dell’eccitabilità ippocampale legate a fear conditioning 14

1.6. Modificazioni dell’espressione genica legata a fear conditioning 17

1.7. Metabolismo dell’Acetil-L-Carnitina 20

1.8. Modificazioni dell’eccitabilità ippocampale legate alla somministrazione di ALC 23

1.9. ALC e modulazione dell’espressione genica 25

2. SCOPO 27

3. MATERIALI E METODI 29

CONTEXTUAL FEAR CONDITIONING

3.1. Soggetti sperimentali 29

3.2. Apparato di condizionamento 29

3.3. Protocollo di condizionamento alla paura 30

3.4. Isolamento e conservazione dei tessuti 31

3.5. Estrazione dell’RNA totale 32

3.6. Isolamento dell’mRNA poliA

33

3.7. Controllo della qualità dell’mRNA poliA

34

3.8. Costruzione delle librerie soppressive sottrattive 35

3.9. Screening primario delle librerie 38

3.9.1. PCR da colonia 38

3.9.2. Spot Blot del prodotto di PCR 39

3.9.3. Marcatura delle sonde 40

3.9.4 Ibridazione su filtro 40

3.10. Preparazione del DNA plasmidico su piccola scala (Miniprep) 43

3.11. Analisi delle sequenze 44

3.12. Analisi di espressione genica tramite RT-PCR real time 45

3.13. Quantizzazione dei livelli di espressione genica: metodo del 2

48

3.14. Analisi statistica 48

ACETIL-L-CARNITINA

3.15. Soggetti sperimentali e trattamento 49

3.16. Estrazione di proteine da tessuto 49

3.17. Western blot 50

3.17.1. Sds-page 51

3.17.1.1. Composizione dei gel elettroforetici 51

3.17.1.2. Preparazione dei campioni 51

3.17.1.3. Separazione elettroforetica e trasferimento 51

3.18. Immunoblotting 52

3.19. Chemioluminescienza 53

3.20. Analisi statistica 54

4. RISULTATI 56

4.1 Risultati dello screening primario di geni candidati a essere differenzialmente espressi in seguito a CFC 56

4.2. Analisi delle sequenze 58

4.2.1 Sequenza del clone 2VG1 60

4.2.2 Sequenza del clone 5VD5 62

4.3. Risultati dell’analisi di espressione tramite

RT-real-time PCR 63

4.4. Quantizzazione di proteine modulate da trattamento

cronico con ALC tramite la tecnica del western blot 65

5. DISCUSSIONE 69

5.1 Clone 2VG1: isoforma ξ della proteina 14-3-3 70

5.2. Clone 5VD5: proteina profilina 2 73

5.3.Catena leggera della chinesina 1 (KLC1) 77

5.4. Proteina basica della mielina 81

5.5. Subunità D del settore V1 della pompa protonica ATPasi lisosomiale 84

6. CONCLUSIONI 88

7.BIBLIOGRAFIA 90