Il fiore è un achenio (frutto secco indeiscente con un solo seme non aderente al pericarpo) ovoidale, globoso e duro che contiene un seme detto “canapuccia”

2.1. Cannabis

La Cannabis sativa, è una pianta originaria dell’Asia centrale che si è in seguito diffusa per opera dei Persiani e dei Medi, nella zona del basso Danubio e dell’Europa centrale ed insulare. Nota da molto tempo per la preparazione di tisane e per il suo utilizzo nel settore tessile, divenne una coltura importante per l’Italia all’epoca dei Comuni. Essa appartiene alla famiglia delle Cannabacee ed è una pianta erbacea annua, dioica, con lunga radice e fusto ruvido alto circa due-tre metri variamente ramificato con foglie e brattee (foglie modificate che accompagnano un fiore o un’infiorescenza) alternate, palmato-composte, con penne lanceolate allungate e strette di colore verde scuro e margine seghettato.

I fiori sono piccoli e raggruppati in infiorescenze maschili (ricchi di resina) e femminili poco appariscenti. Quelle femminili sono raccolte in cime compatte insieme a brattee fogliacee mentre quelle maschili sono raggruppate in racemi (infiorescenza indefinita costituita da un asse allungato portante i fiori su peduncoli di eguale lunghezza inseriti ad intervalli regolari all’ascella di brattee) a formare una pannocchia di colore giallognolo.

Il fiore è un achenio (frutto secco indeiscente con un solo seme non aderente al pericarpo) ovoidale, globoso e duro che contiene un seme detto “canapuccia”

ricco di olio.

Il principale costituente della Cannabis, dotato di attività biologica, è il delta-9-teraidrocannabinolo (∆

-THC) 1 [1] che è concentrato nella resina della pianta. La droga è eterogeneamente rappresentata da numerose preparazioni di

“planta tota” o di diverse parti di essa; tale varietà è legata a diverse tradizioni etniche e/o geografiche. Secondo le regioni di provenienza questa droga ha nomi differenti: in India, dove è chiamata “Bhang”, viene generalmente fumata sola o con il tabacco; in Arabia e in Egitto, dove è chiamata “Hashish”, viene ingerita spesso con miele e burro; in Messico e nel sud degli Stati Uniti le sommità fiorite, dette “Marijuana”, vengono mescolate al tabacco.

Marijuana e Hashish rappresentano tuttavia le droghe più note, sia per

l’efficacia che per la diffusione in Occidente, per usi prevalentemente voluttuari.

L’Hashish o Hash, ingerito o fumato, è un concentrato della resina dei fiori di piante maschili e femminili (15-20% THC nell’olio di Hash).

La Marijuana è dalle cinque alle dieci volte meno potente dell’Hashish.

La sinsenilla (11% THC), letteralmente significa “senza semi”, è una forma di Marijuana prodotta impedendo l’impollinazione di piante femminili; il che favorisce l’accumulo di resina nella pianta.

La Cannabis è stata utilizzata nella medicina popolare orientale per quasi 5000 anni e la descrizione del suo uso, si ritrova in un libro di farmacologia scritto nel 2737 a.C. dall’Imperatore cinese Shen Nung, il quale la consigliava per la cura

“della debolezza femminile, la gotta, i reumatismi, la malaria, il beri-beri, la costipazione e la distrazione”.

Pare che intorno al 2737 a.C. la Cannabis fosse usata anche in India e in Medio Oriente.

Mentre i preparati a base di Cannabis venivano ampiamente utilizzati in India e nel Medio Oriente fin dal 900 d. C., in Europa non si trovano notizie fino al 1800.

La Cannabis venne portata all’attenzione degli europei dopo la campagna di

Napoleone in Egitto, ed un certo numero di relazioni mediche e letterarie

documentano il suo uso tra il 1840 e il 1900. Nel diciannovesimo secolo e agli

inizi del ventesimo, gli estratti della Cannabis, prodotti negli Stati Uniti, venivano

impiegati come analgesici per dolori muscolari e come rilassanti; il loro uso è poi

declinato lentamente, a causa della loro scarsa efficacia, del lungo tempo

necessario a produrre gli effetti attesi e dell’imprevedibile attività biologica [2].

2.1.1. Effetti della Marijuana

Nel 1964 è stato identificato il principale costituente psicoattivo della Cannabis: il

∆

-THC (1), mentre gli altri cannabinoidi, il ∆

-THC (2), il cannabinolo (CBN) (3) e il cannabidiolo (CBD) (4) sono risultati di minore interesse [1].

O H H

OH

∆ ⁹ -THC ∆ ⁸ -THC

O H H

OH

1 2

Cannabinolo (CBN) O

OH

Cannabidiolo (CBD) HO

OH

3 4

Gli effetti del fumo della Marijuana sono già evidenti dopo pochi minuti, mentre quelli provocati dall’ingestione dell’Hashish, vengono avvertiti dopo almeno trenta minuti dall’assunzione.

Il fumo della Marijuana porta direttamente il ∆

-THC (1), gli altri cannabinoidi, e le impurezze presenti, ai polmoni e quindi nel circolo sanguigno con il quale raggiungono gli organi bersaglio. Le sostanze vengono metabolizzate nel fegato, per poi essere eliminate dall’organismo mediante le urine.

Quando l’Hashish viene ingerito, il ∆

-THC (1) è assorbito a livello delle

mucose del tratto gastro-intestinale, raggiunge il fegato mediante la vena

mesenterica, dove subisce una prima metabolizzazione; ciò riduce in modo

evidente la concentrazione sanguigna del ∆

-THC (1) e di conseguenza il suo

Il livello di ∆

-THC (1) nel sangue e dei suoi metaboliti nelle urine diminuisce dopo poche ore che si è fumata la Marijuana, sebbene alcuni di essi siano stati ritrovati dopo lunghi periodi successivi all’ingestione o al fumo [4,5].

Ιl ∆

-THC (1) e gli altri cannabinoidi sono molto liposolubili, quindi possono accumularsi nel tessuto adiposo dal quale vengono lentamente rilasciati determinando un prolungamento dell’effetto del composto. La Marijuana ha un’azione negativa sulla memoria a breve termine e sull’attività motoria oltre che manifestare un’importante azione analgesica.

Il persistere di tali effetti è conseguenza dell’accumulo del ∆

-THC (1) nelle riserve lipidiche ed al suo lento rilascio.

Gli effetti acuti di Marijuana o di ∆

-THC (1) sono associati ad una diminuzione delle funzioni percettive e psicomotorie secondo una relazione di dose-dipendenza. L’ippocampo, in cui sono principalmente localizzati i recettori a cui si legano i principi attivi della Marijuana, è associato alla memoria e alla capacità di apprendimento. La Marijuana ha effetto anche sulla qualità della comunicazione orale, probabilmente come risultato della sua azione sulla memoria a breve termine. La Marijuana viene usata per il suo effetto eccitante, o

“High”, anche se ha effetti sedativi. Sono state riportate alcune reazioni avverse, che vanno dal leggero malessere fino a sindromi più serie, incluso il panico, la paranoia, le allucinazioni, la confusione e il terrore.

Il fumo provoca effetti tossici su tutto il sistema respiratorio. Nonostante l’utilizzo periodico di Marijuana induca bronco-dilatazione, i fumatori cronici hanno in genere problemi di tipo respiratorio quali ad esempio bronchite, asma e rinofaringiti [6].

L’uso di Marijuana o di ∆

-THC (1) provoca un aumento della frequenza cardiaca.

Nell’uomo il fumo cronico di Marijuana può ridurre il numero e la motilità

degli spermatozoi, mentre per quanto concerne il sistema riproduttivo femminile

essa influenza negativamente l’ovulazione, il ciclo mestruale nonché il normale

sviluppo del feto. Alcuni studi in vivo e in vitro hanno dimostrato che il ∆

-THC

(1) ha anche un’azione immunosoppressiva inibendo la risposta immunitaria

cellulo-mediata [7,8] e le difese cellulari sviluppate nei confronti di alcuni agenti infettivi [9-11] .

2.2. Recettori dei cannabinoidi

Omogenati di membrane cellulari e sezioni di tessuto sono stati utilizzati per la caratterizzazione e la localizzazione dei recettori dei cannabinoidi nel cervello, usando il radioligando [H

]CP-55,940 (5) [12] .

OH H H

OH

OH CP-55,940 5

Al momento sono stati identificati due sottotipi recettoriali: il CB

e il CB

che appartengono alla famiglia di recettori a sette eliche transmembranali accoppiati alle proteine G (G

/Go).

Metodi di auto radiografia [13-16], ibridizzazione in situ [17-19] studi immunoistochimici e immunoradioattivi [20] hanno permesso di localizzare i recettori CB

nelle regioni cerebrali e di valutarne la funzionalità, associata all’azione farmacologica dei cannabinoidi. Altre sostanze saggiate non si legano a questi siti, dimostrando così una specificità dei recettori verso tali composti.

Tuttavia non è da escludere che queste molecole, data la loro lipofilicità, riescano

a penetrare all’interno della cellula e interagire con proteine associate alla

membrana, dando risposte che non sono attribuibili all’interazione con i recettori

CB

[21].

2.2.1. Recettore CB1

Questo recettore è una proteina che attraversa sette volte la membrana e presenta una sequenza amminoacidica con una struttura terziaria, tipica dei recettori accoppiati alle proteine G. Solo recentemente è stata individuata la sequenza amminoacidica del recettore CB

presente nel cervello umano [22]. Il recettore CB

di ratto presenta una sequenza che è per il 97,3% identica a quella del recettore CB

umano, e nella regione transmembranale è identica per il 100% [23].

Bonner et al. sono riusciti a clonare un DNA complementare da una libreria di cDNA ottenuta dalla corteccia cerebrale di ratto, che codifica per il primo sottotipo recettoriale: il CB

L’attivazione recettoriale inibisce l’adenilato-ciclasi, è PTX sensibile (la sigla PTX si usa per indicare la tossina della pertosse che viene normalmente utilizzata per valutare se un certo recettore è accoppiato alla proteina G nella traduzione del segnale), può regolare le correnti al Ca

[24], attivare i canali del K

“inwardly rectifying” [25] e di tipo A oltre che attivare la MAP chinasi (proteina chinasi fitogeno-dipendente) osservando tale effetto è stato anche in vivo. Infine i recettori CB

risultano più sensibili ai cannabinoidi psicoattivi piuttosto che a quelli non psicoattivi [22].

Più recentemente è stata individuata una variante ammino-terminale del recettore CB

: è stata denominata CB

[29].

Un’alta densità dei recettori CB

è stata ritrovata nell’ippocampo, una

regione essenziale sia per immagazzinare le nuove informazioni acquisite e sia

nella regolazione del rilascio dei corticosteroidi, i quali a loro volta sono associati

a cambiamenti di umore e al comportamento.

Di recente è stato dimostrato, mediante tests in vivo, che gli agonisti CB

, quali WIN 55,212 (6) e HU-210 (7), sono capaci di aumentare in questa regione il rilascio di acetilcolina (Ach); tale effetto è inibito dal pretrattamento con SR141716 (8) [30].

N

CH ₃ O

O

N

O WIN 55,212

6

O CH ₂ OH

OH

HU-210 7

N N

Cl

NH O

N

Cl

Cl SR 141716

8

La maggiore concentrazione di recettori CB

si trova nella regione CA3 del

corno di Ammon e nello strato molecolare del gyrus dentato [31].

elettrica delle fibre rilascianti il glutammato aumenta i livelli dell’endocannabinoide 2-arachidonilglicerolo (2-AG) (9).

2-AG

OCH(CH ₂ OH) ₂ O

9

Una spiegazione di ciò viene dall’attivazione dei recettori NMDA [32];

infatti il rilascio di glutammato attiva i recettori-canali NMDA, che consentono l’ingresso di Ca

nella cellula, attivando la fosfolipasi C, la quale libera DAG e in un successivo passaggio il 2-AG (9), quindi l’endocannabinoide attiva i recettori presinaptici CB

e riduce il rilascio di glutammato.

La presenza di recettori CB

nei gangli della base è in accordo con alcuni effetti dei cannabinoidi, quali atassia statica, acinesia, movimenti involontari, e perdita di controllo dei movimenti [33,34]. I neuroni che contengono i recettori CB

sono GABA-ergici e presinaptici [35].

Alcune evidenze fanno pensare che il sistema dopaminergico sia in stretta relazione con il sistema endocannabinoide. Innanzitutto nello striato di ratto il rilascio di anandamide (arachidoniletanolammide, o AEA) (10) è stimolato dall’attivazione dei recettori D

[36]; inoltre l’azione dei cannabinoidi non è bloccata solamente da SR141716 (8), ma anche dagli antagonisti D

[37].

NHCH ₂ CH ₂ OH O

AEA 10

È stato osservato anche che SR141716 (8) da solo ha poco effetto

sull’attività motoria, ma potenzia l’iperattività motoria quando viene

somministrato in associazione ad agonisti D

. Gli agonisti CB

e D

producono

una risposta comportamentale contrastante, dopo iniezione nei gangli basali [38].

Evidenze sperimentali, come i disturbi nel controllo motorio che si manifestano in mancanza del gene CB

[39], supportano questa ipotesi.

Tecniche d’immunoreattività hanno dimostrato la presenza dei recettori anche nel globus pallido, nei nuclei entero-peduncolari e nella substantia nigra, ma in misura decisamente maggiore nel putamen caudato [17,20]. La modulazione da parte dell’AEA (10) della neurotrasmissione dopaminergica- GABAergica a livello extrapiramidale, può portare all’inibizione del consolidamento della memoria [40] e può essere spiegata con meccanismi diversi:

1. diretta inibizione del rilascio striatale di dopamina [41];

2. inibizione dell’attività D

- o D

- mediata tramite l’attivazione o l’inibizione (rispettivamente) dell’adenilato-ciclasi [42];

3. aumento indiretto della neurotrasmissione striatale dopamina-mediata, in seguito all’intervento dell’AEA (10);

4. inibizione della tiroxina idrossilasi nigrostriatale;

5. inibizione indiretta dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra tramite un potenziamento delle fibre afferenti GABAergiche.

6. Con tecniche autoradiografiche e d’immunoreattività sono state ritrovate discrete quantità del recettore CB

nell’amigdala e nell’ipotalamo, in accordo con gli effetti ipotermici prodotti con l’iniezione intraventricolare di ∆

-THC (1).

Nel cervelletto il recettore CB

è maggiormente concentrato negli strati

molecolari che contengono le fibre e i processi del Purkinje [13,17,20], presenza

cerebellari, zone che fungono da stazioni di collegamento tra la corteccia cerebellare e quella cerebrale, tra il talamo e il midollo spinale, e che sono associate con la postura e l’equilibrio [20]. I neuroni che in questa regione contengono i recettori CB

sono di tipo glutamatergico.

È nota la regolazione della risposta nocicettiva da parte dei cannabinoidi, infatti i recettori CB

sono stati ritrovati nell’amigdala, nel talamo, nel midollo rostrale ventro-mediale (RVM) e nel collicolo superiore, oltre che sulle corna dorsali e nelle lamine X del midollo spinale [43,44]. Sebbene sia bassa, la presenza dei recettori CB

sui neuroni contenenti CGRP sembra funzionalmente molto importante, inquanto l’attivazione dei CB

riduce il rilascio di CGRP dalle corna dorsali, e quindi il dolore [45,46]. Recentemente si è osservato che l’RVM è richiesto per la soppressione del dolore, analogamente alla morfina, ma secondo principi farmacologici diversi; quindi è stato anche ipotizzato che i cannabinoidi siano capaci di regolare la soglia del dolore agendo sulle attivita neuronali dell’RVM [47].

La densità dei recettori CB

a livello periferico è minore rispetto al sistema centrale [48]: è certa la presenza dei recettori CB

nella vescica di topo e di cavia, nell’intestino tenue di topo e di cavia, nel vas deferens di topo e ratto e nell’utero di topo [48-54], nei testicoli, negli spermatozoi e nelle cellule endoteliali, come dimostrato nella vena ombelicale umana [55]. Recettori CB

pregiunzionali sono stati identificati nella muscolatura liscia longitudinale dell’ileo umano e di cavia [54,56]. L’evidenza che a livello del plesso mienterico longitudinale dell’intestino tenue di cavia (MPLM) sono presenti recettori CB deriva da alcune osservazioni sperimentali:

1. gli agonisti cannabinoidi inibiscono le contrazioni elettricamente indotte nel MPLM (abolite da 100-200nM di TTX, il che indica che la muscolatura liscia del MPLM non è stimolata direttamente [Fernando e Pertwee, in press] e il rilascio di acetilcolina (Ach) evocato elettricamente, ma non riducono la risposta contrattile all’Ach esogena;

2. gli agonisti cannabinoidi si legano in modo stereoselettivo, con alta

potenza e affinità specifica per il recettore CB

[56];

3. l’azione degli agonisti cannabinoidi sul MPLM può essere bloccata con l’antagonista SR141716 (8) alla concentrazione 1µM;

4. anche gli agonisti cannabinoidi di sintesi, quali (+)-WIN 55,212 (6) e CP 55-940 (5), riducono la risposta contrattile elettricamente indotta nel MPLM, azione antagonizzata da SR141716A (1µM);

5. in esperimenti di binding con omogenati di membrane di MPLM, sono stati evidenziati valori di affinità del [H

]-CP 55,940 del tutto analoghi a quelli ritrovati in omogenati di membrane di cervello. Inoltre [H

]- CP 55,940 viene spiazzato da SR141716 (8) [48];

6. sequenze di mRNA capaci di codificare per i CB

sono state isolate con la PCR [50];

7. i recettori CB

nelle MPLM sono risultati accoppiati negativamente all’adenilato-ciclasi e ai canali al Ca

, infatti l’effetto evocato da (+)- WIN 55,212 (6) viene migliorato se si abbassano i livelli di Ca

extracellulari, viceversa viene attenuato da un aumento dei livelli di Ca

extracellulare o da esposizione del tessuto alla forskolina [59];

8. antagonisti oppioidi e α

-adrenergici non bloccano l’azione svolta dagli agonisti cannabinoidi

[49,56,57];

9. infine la presenza dei recettori CB

è confermata dall’osservazione che

un pretrattamento della cavia con ∆

-THC (1) rende il preparato

MPLM tollerante all’effetto inibitorio prodotto dagli agonisti

cannabinoidi. È stato studiato anche un possibile coinvolgimento dei

canali del K

nell’azione di WIN 55,212 (6) sulla contrazione

elettricamente indotta nel MPLM (ossia in preparati di muscolatura

circolare dell’intestino di cavia) e si è osservato, sulla contrazione

colinergica (elettricamente indotta) il coinvolgimento di canali del K

apamina sensibili, mentre sulla contrazione NANC (non adrenergica-

non colinergica), l’azione di WIN 55,212 (6) non sembra coinvolgere

È nota da tempo l’azione dei cannabinoidi naturali sulla motilità gastro- intestinale: il ∆

-THC (1) è capace di inibire lo svuotamento gastrico e il transito nell’intestino tenue, riducendo la frequenza di contrazione. Solo successivamente si è ipotizzata una relazione tra l’attività del ∆

-THC (1) e i recettori cannabinoidi, poiché questo effetto viene abolito dal trattamento con gli antagonisti CB

[58,60].

L’interesse farmacologico deriva dall’azione anticolinergica del ∆

-THC (1), sia in studi in vivo sia in vitro, e da una sua possibile applicazione nella terapia dell’ulcera.

Al momento la maggior parte degli studi mirano a valutare se l’attività del

∆

-THC (1) è legata semplicemente alle sue proprietà chimico-fisiche o se è promossa dall’attivazione dei recettori cannabinoidi. Più di recente, in ratti anestetizzati, l’agonista WIN 55,212 (6), si è mostrato inattivo sulla secrezione acida basale, ma capace di inibire significativamente la secrezione acida stimolata con pentagastrina, effetto bloccato con gli antagonisti selettivi CB

. Il fatto che l’agonista selettivo per i CB

, JWH-015 (11), è inattivo, suggerisce che i recettori CB

sono quelli coinvolti in modo predominante nell’attività anti-secretoria

.

Simili risultati sono stati ottenuti con il più potente agonista CB

HU-210 (7) [62]. Test immunoistochimici sul fondo, corpo e antro gastrico hanno permesso di colocalizzare i recettori CB

con i neuroni colinergici, mentre i recettori CB

sembrano assenti.

Un altro organo sottoposto ad attento studio è stato il vas deferens di topo

(MVD), per il quale con elettrostimolazioni di campo sono stati evidenziati

recettori CB

e CB

-like.

Gli studi eseguiti sono di tipo funzionale e derivano dall’osservazione che la contrazione evocata elettricamente è inibita con ∆

-THC (1), CP 55-940 (5) e WIN55,212 (6) e che questa inibizione viene bloccata da SR141716 (8) [50].

La presenza di recettori CB

-like nel MVD è stata messa in evidenza con l’uso di JWH-015 (11) e 1-desossi-11-idrossi-∆

-THC-dimetileptil (agonisti selettivi CB

). Ognuno di questi agonisti è capace di inibire la contrazione elettricamente indotta sul MVD, senza essere antagonizzato da SR141716 (8) (se non a concentrazioni tali da agire anche sui CB

) bensì da SR144528 (12) [64].

Inoltre JWH-015 (11) non è capace di inibire la contrazione indotta dalla somministrazione esogena di noradrenalina o di un analogo stabile dell’ATP [50,65].

Gli studi condotti sul vas deferens di ratto sono ancora pochi. Isahc et al.

(1996) hanno valutato nel vas deferens intero il rilascio di noradrenalina in seguito a somministrazione di anandamide (10) o ∆

-THC (1) e la capacità dell’antagonista SR141716 (8) di bloccare la loro azione, arrivando alla conclusione che recettori cannabinoidi potrebbero essere presenti anche in questo distretto.

Risultati più controversi sono emersi recentemente [66] con esperimenti di

confronto tra il vas deferens di ratto e di topo. Se nel topo è evidente il

coinvolgimento dei recettori cannabinoidi, nel ratto sorgono molti dubbi, tanto che

gli autori si spingono ad ipotizzare la presenza di recettori CB

oppure non-CB

-

non-CB

.

Comunque si deve tenere presente che le condizioni di sperimentazione, come i parametri di stimolazione elettrica e i solventi utilizzati per dissolvere gli agonisti altamente liofili, possono essere la causa di risposte diverse [52].

2.2.2. Recettore CB2

La sequenza amminoacidica primaria del recettore è conforme con la struttura tipica dei recettori accoppiati alle proteine G. Il recettore CB

è per il 68%

identico al recettore CB

nella zona transmembranale, per il 44% in tutto il resto della proteina [67].

È stato osservato che i recettore CB

inibisce l’attività dell’adenilato-ciclasi attraverso una proteina G sensibile alla PTX, ma diversamente dai CB

, i CB

non modulano l’attività di altri canali al Ca

di tipo Q o del K

“inwardly rectifying”

[25] o comunque questa attività ancora non è nota.

La più alta quantità di mRNA codificante per i CB

è stata ritrovata nelle cellule B e nelle cellule natural killer, in moderata quantità nei monoliti e solo minimamente nei leucociti polimorfonucleati, nelle cellule T8 e T4 [68]. Altri studi dimostrano la presenza dei recettori CB

nella milza umana, nelle tonsille e in misura minore nel midollo osseo, nel timo e nel pancreas [68].

L’mRNA codificante per il recettore CB

è espresso a livello delle cellule HL60 (leukemia promyelocitic human), come ha dimostrato Munro, nei macrofagi splenici e nei monoliti, ma non nelle cellule T spleniche, nei neutrofili maturi del sangue, nel timo, nel fegato, nel cervello, nei polmoni e nei reni, indicando che la distribuzione è completamente diversa a quella dei CB

[67].

Le risposte del sistema nervoso centrale ai composti cannabinoidi sono

principalmente mediate dai CB

, comunque, sebbene Munro (1993) non abbia

trovato tracce di trascritti di CB

nel cervello, con le analisi Northern o con studi

di ibridizzazione in situ, Skaper (1996) ha rilevato la presenza di geni espressi nel

cervelletto che codificano sia per i recettori CB

sia per i CB

.

2.3. Ligandi dei recettori cannabinoidi

Il componente della Cannabis sativa ∆

-tetraidrocannabinolo, ∆

-THC (1), attivo a livello cerebrale, è stato isolato allo stato puro e la sua struttura è stata illustrata nel 1964 [68]. Da allora numerosi composti ad attività cannabinoide sono stati sintetizzati e caratterizzati.

L’individuazione di un recettore cannabinoide nel cervello (CB

) suggerì l’esistenza di un ligando endogeno. Ricerche volte in tal senso hanno portato all’identificazione di una famiglia di acidi grassi insaturi etanolammidici detti Anandamidi. Il più abbondante ligando di questa classe è l’arachidoniletanolammide (10) (anandamide o AEA) [69,70]. Essa viene prodotta a livello endogeno attraverso la rottura, catalizzata dalle fosfolipasi D, della N- arachidonil-fosfatidil-etanolamide [71,72].

L’esistenza di un secondo recettore cannabinoide (CB

), localizzato a livello periferico, portò a considerare la possibilità che fossero presenti anche ligandi endogeni diversi dalle anandamidi; fu quindi isolato un costituente liposolubile dall’intestino di cane: il 2-Arachidonoilglicerolo (2-AG) (9) [73]. Più tardi questo fu localizzato anche nel cervello da Sugiura ed altri [74] e si vide che in parte si legava anche ai recettori CB

.

Ci sono poi due gruppi principali di composti sintetici ad attività

cannabinoide, ma che differiscono dal punto di vista chimico dai cannabinoidi

triciclici tipo THC: i cannabinoidi biciclici, rappresentati dal composto CP55940

(5), e gli amminoalchilindoli, il cui prototipo è la pravadolina (13).

N

O OCH ₃

N

O

Pravadolina 13

È interessante notare che, mentre i cannabinoidi biciclici erano stati preparati in origine come cannabinoidi “semplificati”, l’attività simile ai cannabinoidi degli amminoalchilindoli è stata scoperta in maniera casuale. Questi composti sono stati sintetizzati nell’ambito di un progetto volto alla scoperta di nuovi agenti antinfiammatori non steroidei, presumibilmente basati sulla struttura dell’indometacina (14); ciò nonostante, mentre non mostravano alcuna proprietà antinfiammatoria, possedevano capacità analgesiche e inibivano le contrazioni provocate elettricamente in un preparato muscolare di vas deferens di topo.

N

O Cl

COOH CH ₃ O

Indometacina

14

2.3.1. Rapporti struttura-attività e interazioni recettoriali

Fino al momento in cui non si è arrivati ad una struttura recettoriale determinata per via sperimentale, sono stati impiegati modelli molecolari computazionali per ipotizzare rapporti struttura-attività.

Ci sono molte tecniche per creare modelli che possano essere usati per dedurre informazioni sul sito di legame al recettore. Essi sono basati su relazioni struttura-attività dei ligandi. La sovrapposizione strutturale, che utilizza un’ipotetica chiave farmacoforica come guida dell’allineamento molecolare, è alla base di tutte queste tecniche. La spinta all’utilizzo di questi metodi d’indagine, nella letteratura dei cannabinoidi, è nata dal fatto che le quattro classi strutturali dei ligandi agonisti (classici, non classici, amminoalchilindolici ed endogeni) ed antagonisti cannabinoidi, per un particolare sottotipo recettoriale, si spiazzano l’un l’altro negli esperimenti di binding con radioligandi.

2.3.2. Ligandi endogeni

Le relazioni struttura-attività delle anandamidi possono essere così riassunte:

• la N,N-dialchilazione, con o senza idrossilazione su uno degli alchili, fa perdere l’attività;

• il metiletere e il fosfato sono meno attivi del corrispondente alcool, mentre i derivati dell’acido carbossilico sono inattivi;

• l’alchilazione o la dialchilazione del carbonio in posizione α al gruppo carbonilico non altera la potenza del legame, l’α-monometilazione o l’α,α-dialchilazione di derivati N-propilici potenzia il legame e porta a composti altamente attivi;

• la presenza di un centro chirale sul sostituente N-alchilico porta a

enantiomeri con significativa differenza di legame: uno di questi

composti, la (R)-metanandamide (15) ha una K

quattro volte più bassa

dell’anandamide, inoltre è stabile all’idrolisi enzimatica [75];

• nell’anandamide, la sostituzione del gruppo ossidrilico con un atomo di fluoro incrementa di dieci volte l’affinità verso i recettori CB

ma non verso i recettori CB

[76];

• la coniugazione dei doppi legami riduce l’attività [77].

NHCH ₂ CHOH

O CH ₃

Metananadamide 15

L’anandamide ha una struttura molto flessibile ed è caratterizzata da una bassa energia conformazionale, questo fa sì che siano possibili per essa diversi arrangiamenti spaziali: a forma di J, a elica, distesa e a forma di U [78-81]. Al momento queste conformazioni sono ugualmente accettabili, poiché è possibile ipotizzare un ragionevole allineamento con la struttura di alcuni cannabinoidi classici [79,82,83]. Solo lo sviluppo di analoghi rigidi dell’anandamide, che mimino le suddette conformazioni, potrà definire quale di esse sia imputata nel legame al recettore.

Per quanto riguarda le relazioni struttura-attività del 2-AG e composti affini, risultati (non pubblicati) confermano l’ipotesi che l’1-AG è potente quanto il 2- AG nel legame verso entrambi i sottotipi recettoriali.

Il 2-Palmitoil- e il 2-Linoleil-Glicerolo, che si ritrovano insieme al 2-AG nell’intestino, nella milza e nel pancreas, non si legano al recettore; tuttavia, se somministrati insieme, si rivelano capaci di potenziare l’attività di 2-AG attraverso l’inibizione dell’idrolisi e dell’up-take di questo ligando [84].

2.3.3. Cannabinoidi classici e non classici

Il termine cannabinoidi classici si riferisce ai cannabinoidi triciclici correlati al

∆

-THC (1). I cannabinoidi non classici sono invece composti biciclici, preparati

in origine come cannabinoidi semplificati e rappresentati da CP-55,490 (5).

Molti studi convergono sull’esistenza di una tasca di legame per i cannabinoidi sul recettore. L’esame dell’interazione del cannabinolo (CBN) (3) (un cannabinoide naturale con bassa attività) con il recettore CB

porta ad affermare che “una ragione per la ridotta affinità di CBN (3) può essere che solo il 53,2% delle molecole di CBN (3) hanno conformazione appropriata per adattarsi nella tasca di legame per i cannabinoidi del recettore CB

” [85].

I cannabinoidi classici e non classici condividono molte caratteristiche strutturali, questo permette di individuare tre elementi di basilare importanza per la definizione dell’attività psicotropa dei cannabinoidi triciclici e biciclici:

• la parte superiore dell’anello terpenico: C9 e C11 per i cannabinoidi classici, C1 per quelli non classici;

• il gruppo fenolico libero;

• la porzione lipidica della catena laterale in C3 per i cannabinoidi classici, C4’ per quelli non classici. (Figura 1).

Figura 1: struttura rappresentativa per i cannabinoidi non classici (CP-55,940) e relativa numerazione.

Sostituzioni in posizione C

possono causare inattivazione, infatti mentre il

2-metil-∆

-THC (16) è un potente cannabimimetico, sia nei saggi di binding verso

CB

sia in vivo, l’isomero 4-metil-∆

-THC (17) è inattivo. È stato dimostrato che

il ∆

-THC (18) attivo e il 2-metil-∆

-THC (16) mostrano caratteristiche strutturali

comuni che non ci sono nel 4-metil-∆

-THC inattivo (17) [87] (Figura 2).

O H H

OH

2-metil-∆ ⁸ -THC 16

O H H

OH

4-metil-∆ ⁸ -THC 17

∆ ⁸ -THC O

H H

OH

18

Fig 2

Complessivamente, per quanto riguarda il sito recettoriale su CB

si ipotizza l’esistenza dei seguenti elementi:

1. una regione inaccessibile dietro C

dell’anello C (o C

per i cannabinoidi non classici) occupata da residui del recettore stesso;

2. un sito per il legame a idrogeno con l’ossidrile fenolico dell’anello A, o con gli ossidrili in C

e C

dell’anello C, per i cannabinoidi classici e con il gruppo SAH (Southern Aliphatic Hydroxyl ovvero catena n-propanolica in posizione 4) per CP-55940 (5) e altri cannabinoidi biciclici;

3. una tasca di legame idrofobica di profondità limitata in cui la catena alchilica in C

(o in C

’ per i cannabinoidi biciclici) si adatta come se fosse all’incirca perpendicolare all’anello aromatico;

4. una grande tasca idrofobica che accoglie gruppi analoghi di SAH idrofobici e una tasca idrofila più piccola che accoglie il gruppo SAH.

Mentre i rapporti struttura-attività dei cannabinoidi classici per il recettore

CB

sono ben conosciuti, quelli per il recettore CB

non sono stati ancora spiegati

in maniera approfondita. I pochi risultati pubblicati in passato indicano che i requisiti strutturali per il legame col recettore CB

differiscono in maniera sostanziale da quelli per il recettore CB

. Questa selettività di legame, se confermata dai test in vivo, potrebbe rappresentare una via di sviluppo per nuovi farmaci cannabinoidi che hanno attività solo periferica, senza effetti collaterali sul SNC.

2.3.4. Amminoalchilindoli e indeni

In seguito all’osservazione che la pravadolina (13) inibiva le contrazioni del vas deferens di topo stimolato elettricamente e l’attività della prostaglandina sintetasi [88], il gruppo Sterling Wintrop ha condotto un ampio studio circa il rapporto struttura attività di oltre 100 composti analoghi [89,90]. Inizialmente, in questi studi, è stato trovato che quattro analoghi della pravadolina (13), che non possedevano attività inibitrice sulla prostaglandina sintetasi, mostravano ancora attività antinocicettiva ed inibivano le contrazioni del vas deferens di topo stimolato elettricamente. Due di questi derivati amminoalchilindolici (19a, 19b) sono stati particolarmente efficaci nel protocollo di inibizione del vas deferens di topo. Questi risultati, sommati al fatto che gli amminoalchilindoli inibiscono l’adenilato ciclasi ed interagiscono con un recettore accoppiato a una proteina G nel cervello, potrebbero indurre a pensare che questi derivati interagiscono con il recettore cannabinoide cerebrale [88].

N R O

N

O

a: R= H

In studi successivi, è stata preparata una serie di amminoalchilindoli, obbligati dal punto di vista sterico, ed è stato trovato che strutture basate su uno scheletro 4-aroil-pirrolo[1,2,3-de]-1,4-benzossazinico (20), mostravano una attività superiore a quella di molti altri composti con nuclei ciclici diversi nel protocollo MVD [89]. È stata quindi preparata una serie di analoghi tra i quali il composto più efficace è risultato l’isomero R del WIN-55,212 (6).

Derivato 4-aroil-pirrolo[1,2,3-de]-1,4-benzossazinico N

R O Ar

O

N

O 20

Sono stati presentati rapporti struttura-attività per gli amminoalchilindoli in cui sono state dedotte alcune conclusioni generali [88,89]. Queste comprendono l’osservazione che sul C-2 del nucleo indolico gruppi più piccoli aumentano l’attività MVD, l’idrogeno è di un po’ superiore al metile, ed un gruppo etilico attenua in maniera evidente la potenza. Anche un anello biciclico aromatico, di solito naftoilico, come sostituente su C-3 dell’idolo aumenta la potenza in maniera evidente. È stato inoltre suggerito che un gruppo amminoetilico sostituito sull’azoto indolico fosse ottimale per l’attività MVD.

Diversi autori [90] hanno ampliato i rapporti struttura-attività descritti in precedenza fino a comprendere variazioni della natura del sostituente amminoalchilico, il sostituente del gruppo naftoilico ed il sostituente del nucleo indolico. In generale, spostando il gruppo amminico più lontano dall’azoto indolico diminuisce l’attività, e le ammine acicliche sono prive di attività. Delle ammine cicliche, le più attive sono la morfolina, la tiomorfolina e la piperidina.

Una sostituzione sulla posizione 5 del nucleo indolico diminuisce l’attività, ed in

un numero limitato di esempi è stato notato che un sostituente in 7 migliora il legame. È stato anche notato che formando un anello tra la posizione 1 e la posizione 7 dell’indolo, come in WIN-55,212 (6), si aumenta di molto la potenza di legame. Il 6-bromo derivato della pravadolina (21a), mostra qualche comportamento antagonista in vitro, ma non in vivo. Il gruppo Makriyannis in seguito ha preparato la 6-iodopravadolina (AM-630) (21b), che mostra anch’essa proprietà antagoniste, o agoniste inverse, in vitro [91,92].

N

O OCH ₃

N O R

a: R=Br 6-bromopravadolina

b: R=I 6-iodopravadolina (AM-630) 21a,b

Il gruppo Winthrop ha sviluppato un modello di farmacoforo per gli amminoalchilindoli che comprende i seguenti elementi chiave:

1. l’atomo di azoto della catena laterale amminoalchilica;

2. il sostituente aroilico in posizione 3.

Tutti gli agonisti amminoalchilindolici sono in accordo con questo modello, tuttavia alcune molecole che rispettano questa struttura sono risultate inattive.

È stata riportata una variazione della struttura amminoalchilindolica in cui i

due carboni che uniscono l’azoto indolico con il gruppo amminico eterociclico

sono stati sostituiti da una sola unità metilenica, attaccata all’atomo di carbonio

Alcuni di questi analoghi hanno elevata affinità per il recettore CB1 ed, in comune con gli amminoalchilindoli descritti prima, la presenza di un gruppo 3-(1- naftoile) e l’assenza di un sostituente in posizione 2 sul nucleo indolico aumentano l’affinità per il recettore.

Studi sui modelli molecolari hanno indicato che, almeno dal punto di vista spaziale, il gruppo naftoilico di WIN-55212 (6) potrebbe essere sovrapposto alla catena laterale di ∆

−ΤΗC (1), il gruppo morfolinico dell’amminoalchilindolo è sovrapposto con il sistema carbociclico di THC, ed il gruppo 2-metilico del composto 6 corrisponde all’ossidrile fenolico di ∆

−ΤΗC.

Un allineamento molto differente di WIN-55212 (6) e ∆

−ΤΗC è stato proposto da Huffman ed altri che hanno suggerito che il carbonile chetonico dell’aminoalchilindolo, il quale ha le proprietà di un’ammide vinilica, corrisponderebbe all’ossidrile fenolico dei cannabinoidi tradizionali e sarebbe un efficace accettore di legame a idrogeno [94]. In uno studio sul modello molecolare l’ossidrile fenolico di THC è stato sovrapposto al carbonile chetonico di WIN- 55212 (6), e l’anello naftalenico del composto 6 è stato allineato con l’anello carbociclico A del THC. In questo allineamento l’azoto indolico corrisponde al carbonio benzilico (C1’) del THC, ed il gruppo amminoalchilico di WIN 55212 (6) si sovrappone alla catena laterale alchilica di THC. Questa sovrapposizione suggerisce che il gruppo amminoalchilico non è essenziale per l’attività cannabinoide, e che potrebbe essere sostituito con un gruppo alchilico.

È stata sintetizzata una serie di dieci 1-alchil-2-metil-3-(1-naftoil)indoli (22a), ed è stata valutata la loro attività farmacologia [94].

a: R=alchile R 1 =CH ₃ b: R=alchile R ₁ =H

N R ₁ O

R

22a,b

È stato trovato che questi naftoilindoli, sostituiti sull’azoto in posizione 1 con gruppi che comprendono da quattro a sei atomi di carbonio, hanno un’affinità per i recettori cannabinoidi cerebrali paragonabile o superiore a quella di

∆

−ΤΗC.

Nel tentativo di capire i rapporti struttura-attività per gli indoli cannabimimetici, è stata preparata una nuova serie di 1-alchil-3-(1-naftoil)-indoli (22b) che non presentano sostituenti in posizione 2 ed è stata valutata la loro attività farmacologica. I dettagli di questo studio, combinato con i risultati ottenuti per i composti 22a e 22b, sono stati pubblicati recentemente. Sono stati descritti in totale 22 derivati indolici, ed è stato trovato che in entrambe le serie (22a e 22b) gli analoghi 1-metilici e 1-etilici non hanno affinità per il recettore, mentre i derivati 1-butilici, 1-pentilici e 1-esilici mostrano tutti la farmacologia tipica dei cannabinoidi con un ampio spettro di rapporti dose-effetto nel topo e alta affinità per il recettore CB

, ed è stato dimostrato che hanno attività agonista.

Nella serie 2-metil-sostituita 22a, l’affinità per il recettore aumenta passando dal derivato 1.-metilico al derivato 1-pentilico, per poi diminuire dall’1- esilico all’1-eptilico, che non ha alcuna affinità per il recettore a risulta inattivo in vivo. Nella serie 22b, l’affinità del derivato 1-propilico era decisamente minore di quella dell’omologo nella serie 22 [95]. Tuttavia, in contrasto con l’1-eptilindolo 22a, l’analogo eptilico della serie 22b ha modesta affinità per il recettore CB

, mostra la tipica farmacologia cannabinoide in vivo [95] e produce una inibizione dose-dipendente delle contrazioni indotte elettricamente nel vas deferens isolato di topo. Dal momento che un sostituente n-pentile sull’azoto ha portato ad un ligando molto potente in entrambe le serie (22a, 22b), fu valutato l’effetto della sostituzione di questo gruppo con uno più obbligato dal punto di vista conformazionale.

Gli analoghi 4-pentenilici delle serie 22a,b erano attivi, ma mostravano

un’affinità minore e una maggiore potenza in vivo rispetto i corrispondenti

composti n-pentilici. La variante (E)-2-pentenilica della serie 22a ha bassa affinità

affinità per il recettore e risulta piuttosto potente in vivo. L’analogo 1-allilico di 22a era inattivo.

In un tentativo iniziale di stabilire i rapporti struttura-attività per il recettore periferico (CB

), Showalter ed altri hanno determinato l’affinità per il recettore CB

di un certo numero di agonisti [76]. È stato trovato che per tre indoli cannabimimetici rappresentativi, WIN-55,212 (6), 1-propil-2-metil-3-(1- naftoil)indolo (22a, R=n-propil), e 1-pentil-3-(1-naftoil)indolo (22b, R= n-pentil), l’affinità per il recettore CB

era più grande di quella per il recettore cannabinoide cerebrale (CB

). Mentre il WIN 55212 e 22b, R=n-pentil, hanno alta affinità per il recettore CB

, l’analogo propilico di 22a invece ha alta affinità solo per il recettore CB

.

Nel tentativo di ottenere ulteriori ligandi selettivi per i recettori CB

, e per approfondire i rapporti struttura-attività per gli indoli cannabimimetici su entrambi i recettori, sono stati sintetizzati ancora un certo numero di 3-(1- naftoil)indoli ed è stata valutata la loro attività farmacologia [96]. Questi composti comprendono 1-alchil-2-metil-3-(7-metil-1-naftoil)indoli (23), 1-alchil-2-metil-3- (4-metossi-1-naftoil)indoli 24a e 1-alchil-3-(4-metossi-1-naftoil)indoli 24b.

L’affinità per il recettore CB

seguiva il modello che è stato osservato per gli indoli 24a e 24b [95], dunque gli analoghi 1-metilici e 1-etilici sono inattivi e l’affinità per il recettore CB

aumenta da R=n-propil a R=n-pentil, poi decresce fino a R=n-eptil.

Un sostituente 7-metilico sul gruppo naftalenico 23 ha un lieve effetto

sull’affinità per il recettore CB

, con eccezione del derivato 23 con R=n-eptile,

che ha un’affinità molto bassa, mentre l’analogo composto 24a, mancante del

gruppo metilico, è completamente inattivo [96]. In analogia con l’analogo 1-

propilico del composto 22a, anche il propil derivato del composto 23 è un ligando

selettivo del recettore CB

, con una piccola affinità per il recettore CB

. Per

determinare gli effetti di un gruppo 2-metilico sulla selettività per i recettori CB

,

sono state valutate l’affinità del composto 22b (R=n-propil) e di un analogo del

composto 23 (R=n-propil), non sostituito sulla posizione 2 dell’indolo, per

entrambi i recettori. In contrasto con il derivato della serie 22a (R=n-propile), il

derivato 1-n-propilico della serie 22b ha solo una leggera affinità per il recettore

CB

, e il derivato 1-n-propilico di 23, non sostituito in posizione 2, ha anch’esso una bassa affinità sia per il recettore periferico sia per quello cerebrale.

R=alchile N

CH ₃ O

R CH ₃

23

a: R=alchile R 1 =CH ₃ b: R=alchile R ₁ =H

N R ₁ O

R

OCH ₃

24a,b

Gli analoghi 4’-metossi-1-naftoilindolici 24a non sostituiti su C-2 hanno un’affinità per il recettore CB

più elevata di quella dei corrispondenti analoghi naftoilici non sostituiti 22a, ma mostrano solo una debole selettività per il recettore CB

[96]. L’analogo 1-n-pentilico del composto 24a ha un’affinità per il recettore CB

maggiore rispetto quella degli indoli cannabimimetici riportati nell’aggiornamento da parte del gruppo di Clemson e mostra un’attività parimenti elevata in vivo. La serie 2-metilica 24b in generale ha un’affinità per il recettore CB

leggermente inferiore rispetto quella degli indoli 24a non sostituiti sul C-2.

Studi sui modelli molecolari effettuati da Reggio ed altri hanno suggerito che il legame di indoli e pirroli cannabimimetici avviene in un sito recettoriale diverso da quello dei cannabinoidi tradizionali e dei ligandi endogeni, come ad esempio anandamide [97]. Queste indicazioni erano basate su studi ligando- recettore che utilizzavano un modello tridimensionale del recettore CB

umano [98], un cannabinoide tradizionale e WIN-55,212 (6). È stato suggerito che una lisina sull’elica 3 del recettore poteva formare un legame idrogeno con l’atomo di ossigeno dell’ossidrile fenolico del cannabinoide tradizionale, e che una valina e una isoleucina sull’elica 6 potevano formare una tasca di legame idrofobica per la catena laterale di questi composti [99].

WIN-55,212 (6) e i composti correlati hanno tutti uno o più anelli aromatici

porzione transmembrana, mostrava due regioni che contenevano raggruppamenti di amminoacidi aromatici, una delle quali era un possibile sito di legame per l’indolo 6. Questo sito contiene sull’elica 5 un triptofano, che interagisce con il nucleo indolico di WIN 55212, una fenilalanina sull’elica 5 e una tirosina sull’elica 3, ognuno dei quali interagisce con uno degli anelli del sistema naftalenico presente nel composto 6. Inoltre sull’elica 5 è presente una tirosina che è comune ad entrambi i siti recettoriali, ma si ipotizza che interagisca in maniera diversa con ciascun gruppo di ligandi [97].

Evidenze sperimentali, in supporto alle ipotesi che gli indoli cannabimimetici si legano ad un sito differente sul recettore CB

rispetto ai cannabinoidi tradizionali, sono state fornite dal lavoro di Song e Bonner che hanno preparato un recettore CB

mutante in cui la lisina sull’elica 3 è stata sostituita con un’alanina [100]. Sebbene le affinità dei cannabinoidi classici, 11- idrossi-∆

-THC-dimetiletile (HU-210) (7) e CP-55,940 (5) per il recettore mutante fossero molto attenuate, l’affinità di WIN-55,212 (6) era solo debolmente intaccata. Si è concluso che il punto di interazione dell’indolo cannabimimetico con il recettore potrebbe essere differente da quello dei cannabinoidi tradizionali.

Uno studio simile effettuato da Chin ed altri ha fornito dati compatibili con quelli di Song e Bonner, ed ha anche suggerito che gli indoli ed i cannabinoidi tradizionali si legano a siti diversi, anche se sovrapponibili, del recettore [101].

I derivati indenici 25a,b e 26a,b sono stati preparati da Reggio ed altri, per mimare le conformazioni S-trans e S-cis degli indoli cannabimimetici [102,103].

La conformazione S-trans degli indoli, in cui il sostituente arilico in posizione 3 è prossimo al C-2 del nucleo indolico, è predominante quando in posizione 2 non sono presenti sostituenti, ed è mimata dagli indeni (E)- naftilidenici 25. Viceversa quando la posizione 2 del nucleo è sostituita, la forma s-cis è quella predominante, che trova il suo corrispettivo rigido negli indeni (Z)- naftilidenici 26 [102].

Studi di farmacologia indicano che gli isomeri E hanno alta affinità per

entrambi i recettori, ma non mostrano alcuna selettività. Gli isomeri Z hanno una

bassa affinità verso entrambi i recettori.

Dal momento che gli isomeri E mimano la conformazione S-trans degli indoli cannabimimetici è stato dedotto che quest’ultima può essere la conformazione ottimale per l’interazione con entrambi i sottotipi di recettori.

a: R=H R Ar H

N

O

b: R=CH3 25a,b

a: R=H R H Ar

N

O

b: R=CH3 26a,b

Al momento mancano sufficienti dati sperimentali per commentare in dettaglio le interazioni degli indoli e indeni cannabimimetici con il recettore CB

, tuttavia dal momento che questi composti hanno alta affinità per questo recettore periferico, si potrebbe supporre che le interazioni idrofobiche aromatiche giochino un ruolo importante anche a livello periferico.

2.3.5. Derivati diarilpirazolici

Tra i composti appartenenti a questa classe strutturale si trova il più potente e selettivo degli antagonisti cannabinoidi: SR 141716 (8), introdotto nel 1994 dal gruppo di ricerca della Sanofi

. Esso antagonizza la maggior parte degli effetti degli agonisti cannabinoidi come ∆

−ΤΗC (1), CP-55940 (5) e WIN 55212 (6) sia in vivo sia in vitro [5,104,105].

Due gruppi hanno recentemente pubblicato dati riguardanti i rapporti

struttura-attività dei composti con struttura 1,5-difenilpirazolica (27).

Thomas ed altri hanno riportato studi di binding per alcuni analoghi alogenati di SR 141716 (8) [106]. Sostituendo il p-cloro sul fenile in posizione 5 con iodio o bromo l’affinità non varia in maniera significativa, ma la sostituzione con idrogeno produce un composto con una perdita di potenza significativa.

D’altro canto, quando il fenile in 1 viene modificato dall’introduzione di atomi di iodio in posizione 3 o 6, si ottiene un composto con una affinità più bassa.

Il gruppo di A.Makriyannis ha anche preparato una serie di derivati del

pirazolo per studiare i requisiti strutturali necessari per l’attività di potenti

antagonisti per il recettore CB

[107]. In posizione 5, l’analogo p-bromofenilico è

appena meno potente del ligando SR 141716 (8), mentre il p-iodio AM 251 è il

più potente di questa serie. Inoltre, spostando il sostituente dalla posizione para

alla posizione orto o sostituendo il gruppo p-cloro- con un gruppo p-nitro- o p-

ammino-, il binding diminuisce. La sostituzione del diminuisce in maniera

significativa l’affinità. Anche la sostituzione del gruppo fenilico con un gruppo

alifatico etile è dannosa per il legame. In posizione 1, il composto p-clorofenilico

è circa sei volte meno potente del o,p-diclorofenilico. Sono stati preparati derivati

con diversi gruppi carbossammidici in posizione 3 ed eterocicli variamente

sostituiti legati all’azoto in posizione 1. Tra questi derivati alcuni hanno mostrato

buona affinità verso il recettore CB

e l’analogo piperidinico ha dato la selettività

ottimale CB

/CB

.

2.4. PARTE SPERIMENTALE

Nel Dipartimento dove ho svolto il mio internato di tesi di dottorato, un gruppo di ricerca da diversi anni studia ligandi a struttura eterociclica attivi verso i recettori dei cannabinoidi e molti di questi, di tipo naftiridinonico o chinolinonico variamente sostituito (Figura 1), hanno mostrato una buona attività e selettività verso il recettore CB

N N

O

R

(CH

)

O

NHR

R N

O

R

(CH

)

O

NHR

R

Figura 1.

Recentemente, nell’ambito un progetto di ricerca sviluppato all’interno del lavoro di tesi di dottorato della Dottoressa Veronica Benetti, dal titolo “Design and Synthesis of azotate heterocyclic compounds as selective CB

agonists” sono stati sintetizzati derivati 2-naftiridinonici portanti in posizione 3 un sostituente 4- metilcarbossiammidico che, attraverso sperimentazione in vitro, hanno mostrato una spiccata affinità e selettività per i recettori CB

.

Poiché l’interazione recettoriale dipende da molteplici fattori tra cui: la lipofilicità

dei sostituenti in determinate posizioni del nucleo di base, la possibilità di legame

ad idrogeno con determinati residui amminoacidici, la disposizione spaziale dei

gruppi farmacoforici; gli stessi ricercatori, al fine di chiarire meglio la relazione

struttura-attività dei tali derivati naftiridinonici verso il suddetto sottotipo

recettoriale, hanno ritenuto interessante valutare l’influenza sui parametri

I composti presi in esame sono una miscela cis/trans di bicicli a struttura 1,8- naftiridin-2-onica e precisamente l’1-benzil-2-oxo-1,8-naftiridin-3-carbossi (4’- metil)-cicloesilammide (1) e l’1-[4-fluoro-benzil]-2-oxo-1,8-naftiridin-3-carbossi (4’-metil)-cicloesilammide (2) (Figure 2,3).

N N O O

N H

Me

N N O O

N H

Me

F

1 2

Figura 2. Struttura dei composti 1 e 2.

H

CH

N

N H N

O

O

R

CIS

H

CH

N

N H N

O

O

R

TRANS

Figura 3. Struttura degli isomeri cis e trans.

Date le caratteristiche chimico-fisiche delle singole coppie isomeriche l’approccio

classico di separazione attraverso una flash cromatografia su gel di silice non

aveva dato i risultati sperati. Infatti analizzando le frazioni ottenute per eluizione

solo poche di queste presentavano i singoli isomeri con un’apprezzabile percentuale di purezza.

Da tali evidenze sperimentali, è stato ipotizzata la possibilità di effettuare una separazione degli isomeri attraverso un HPLC di tipo preparativo utilizzando una colonna C18 in fase inversa. Per verificare questa ipotesi inizialmente il mio studio si è rivolto a determinare le condizioni ottimali per una separazione con l’ausilio di un HPLC di tipo analitico dotato di rivelatore UV/Visibile e dato che, tali composti sono il frutto di ricerca di base di tipo accademico, mi sono dedicato alla determinazione dei parametri principali quali: lunghezza d’onda di lettura UV, solvente di solubilizzazione di tali composti e fase mobile per l’eluizione cromatografica.

Il primo step è stato quindi quello di trovare un solvente adeguato con caratteristiche tali da rendere minima la presenza dei sottoprodotti presenti nel grezzo di reazione, e che contemporaneamente fosse massima la solubilità di tali composti. Tale ricerca, avendo escluso sia l’esano e l’acetato di etile (solventi di cristallizzazione rispettivamente di 1 e 2) e molti tra i liquidi che presentano una bassa polarità, è stata focalizzata su solventi con un’alta polarità come alcooli, eteri, derivati nitrilici a basso peso molecolare.

Dopo diverse prove è stato scelto il metanolo che presentava un miglior compromesso tra effetto solvatante, selettività verso i composti da analizzare e

“compatibilità con la procedura analitica” (es. cut off basso, scarsa interferenza tempo dipendente con il tracciato analitico). Inoltre, data la presenza di impurezze insolubili in metanolo, le soluzioni sono state filtrate utilizzando delle siringhe dotate di filtri con porosità di 0.22 µm.

La seconda fase è stata quella di determinare, attraverso uno spettrofotometro UV, un massimo di assorbimento UV. Tale studio è stato effettuato analizzando soluzioni di tali composti a diverse concentrazioni (10, 50 e 100 ppm) effettuando scansioni nel range di lunghezza d’onda compresa tra 200 nm e 390 nm.

Dall’analisi degli spettri ottenuti (Figura 4), sono stati individuati due massimi a

280 nm e 345 nm quali possibili utilizzabili per analisi qualitative.

Figura 4. Scansione UV del composto 1 alla concentrazione di 50ppm.

Attraverso tali informazioni sono passato ad analizzare ogni coppia isomerica con una strumentazione HPLC di tipo analitico. Inizialmente è stata utilizzata, come fase eluente, una miscela composta da ACN e tampone ammonio acetato 10mM pH 5,5 già descritta in letteratura per composti di strutture di caratteristiche analoghe (In un litro di acqua MilliQ vengono disciolti 0,77 g di ammonio acetato e il pH viene portato a 5,5 tramite l’aggiunta goccia a goccia di acido acetico (CH

COOH, 2M) utilizzando un pHmetro con elettrodo a vetro). In tali condizioni si aveva una bassa risoluzione e separazione dei picchi (Figura 5).

Questo risultato, anche se deludente ci ha dato utili informazioni in quanto faceva

intravedere la possibilità di una separazione degli isomeri dato che questi, come

precedentemente detto, differiscono strutturalmente solo in una piccola regione

dell’intera molecola.

In seguito sono state modificate, sempre utilizzando tale miscela, sia il flusso che il rapporto fra i due componenti della fase mobile. Tali modifiche, comunque, non hanno apportato positivi contributi a risultati cromatografici se confrontati con quelli ottenuti con esperimenti iniziali.

Quindi sono state saggiate altre fasi organiche, con diversa polarità e miscele compatibili, sempre in associazione con la fase acquosa descritta prima. Dal confronto dei dati di separazione e risoluzione dei picchi, tempi totali di analisi e viscosità della miscela eluente il miglior compromesso è risultato una fase mobile composta da: il metanolo : tampone ammonio acetato a pH 5,5 (75 : 25) (Figura 6).

Minutes

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5 45.0 47.5

AU

0.000 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009 0.010 0.011

AU

0.000 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009 0.010 0.011

Figura 5. Cromatogramma ottenuto dall’analisi di una soluzione del composto 1 (1 ppm)

con fase mobile composta da acetonitrile:tampone ammonio acetato (75:25) flusso 1ml/min.

Partendo da questo risultato, prima di verificare l’applicabilità di tale metodo per la separazione attraverso la strumentazione preparativa, il mio studio è proseguito nel determinare il rapporto migliore tra fase organica e fase acquosa utilizzando acqua a pH 7 in assenza di tampone in previsione del fatto che gli isomeri separati, una volta portati a secco dal solvente di eluizione non presentassero interferenti salini che avrebbero potuto inficiare la successiva sperimentazione farmacologica.

Per cui attraverso piccole variazioni di rapporto percentuale tra la fase organica ed acquosa, anche se la risoluzione dei picchi non risultava ottimale, la separazione rimaneva analoga a quella ottenuta con la miscela tamponata (Figura 7).

Quindi le condizioni cromatografiche finali sono state:

• Colonna ChromSep C18 5µm (150 x 4,6mm) e una precolonna ChromSep Inertsil ODS-3 della Varian;

• Fase mobile composta da acqua e metanolo in rapporto (33 : 67)

• Flusso 0,8 ml/min;

• Lunghezza d’onda di lettura 280 nm.

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80

AU

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10

AU

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10

78.

880

88

Figura 6. Cromatogramma ottenuto dall’analisi di una soluzione del composto 1 (10 ppm) con

fase mobile composta da metanolo:tampone ammonio acetato (25:75) flusso 1ml/min.

Attraverso questi parametri prima di passare alla fase preparativa è stato determinato il valore di “scale-up” da applicare allo strumento in relazione al flusso e alla quantità di composto da separare. Tale parametro è definito come il valore da aumentare di flusso e la quantità di campione attraverso il rapporto elevato al quadrato tra il diametro della colonna preparativa e il diametro della colonna analitica.

Pertanto le condizioni cromatografiche utilizzate nella separazione preparativa sono risultate essere:

• Colonna semi-preparativa Polaris C18 5µm (150 x 10,0mm) della Varian;

• Fase mobile composta da acqua e metanolo in rapporto (33 : 67);

• Flusso 4 ml/min;

• Lunghezza d’onda di lettura 280 nm.

I primi esperimenti sono stati condotti con basse concentrazioni (500 ppm) di composto e i risultati ottenuti sono stati efficienti sia in termini di separazione che in tempi di eluizione (Figure 8A e 8B).

Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85

AU

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09

AU

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09

Figura 7. Cromatogramma ottenuto dall’analisi di una soluzione del composto 1 (10 ppm)

con fase mobile composta da metanolo:acqua (33:67) flusso 0.8ml/min.

10 20 30 40 50 60 Min 0

25

Come precedentemente detto, la colonna a nostra disposizione essendo di tipo semi-preparativa, quando sono state iniettate soluzioni di concentrazioni maggiori (maggiore di 500 ppm) è stata verificata una drastica diminuzione dell’efficienza (Figura 9) separativa ma, poiché il nostro scopo era quello di ottenere i prodotti

50 100

mAU

A

75

10 20 30 40 50 60 Min

0 100

mAU

B

75

50

25

Figura 8. Cromatogrammi ottenuti dall’analisi di soluzioni dei composti 1 (A) e 2 (B) (500

ppm) con fase mobile composta da metanolo:acqua (33:67) flusso 4ml/min.

separati, ho continuato tali esperimenti aumentando in maniera empirica il numero di frazioni raccolte in relazione al volume di ritenzione.

Figura 9. Cromatogramma ottenuto dall’analisi di una soluzione del composto 1 alla concentrazione di 1000 ppm con fase mobile composta da metanolo:acqua (33:67) flusso 4ml/min.

In ultimo, al fine di verificare quali fossero le frazioni ottenute in cui gli isomeri

fossero con grado di purezza massimo, le frazioni ottenute sono state nuovamente

analizzate allo strumento analitico (Figure 10A e 10B).