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Capitolo 5
Conclusioni
Da quanto emerge dai risultati ottenuti nel nostro studio entrambi i sottotipi di canali al potassio hERG1 e hEag1 risultano espressi in cellule di melanoma cutaneo umano A375, mentre le cellule non tumorali HaCaT esprimono solo l’mRNA per hERG1.
Per quanto riguarda il canale hERG1 l’azione osservata con i composti E- 4031 e PD118057 non è ancora sufficiente per definire un ruolo chiaro di questo canale nella vitalità cellulare.
Riguardo al canale hEag1 i dati ottenuti con i due bloccanti Imipramina e Astemizolo, sembrano suggerire un ruolo dell’apertura del canale stesso nella stimolazione della proliferazione di cellule di melanoma cutaneo A375.
In conclusione, dai dati di espressione e da quelli funzionali, il canale
hEag1 sembra poter rappresentare un possibile miglior target rispetto a
hERG1 per quanto riguarda l’azione antitumorale nei confronti del
melanoma cutaneo.
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Abbreviazioni utilizzate nel testo
DMSO: dimetilsolfossido
E-4031:N-[4-[[1-[2-(6-Methyl-2-pyridinyl)ethyl]-4- piperidinyl]carbonyl]phenyl]methanesulfunamide EDTA: acido etilendiamminotetraacetico
FBS: siero fetale bovino
GAPDH: gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi hEag1: Ether à go-go
hERG1: Ether à go-go related RF: RNase Free
RT-PCR: reverse transcriptase-polymerase chain reaction
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Indice figure
Figura1. Struttura canali al potassio
Figura2. Tipi di subunità α nei canali al potassio
Figura3. Tipi di canali al potassio e loro classificazione in base al numero di segmenti transmembrana che costituiscono la subunità α e numero di strutture poro
Figura4. Struttura dei canali hERG1 e hEag1
Figura5. Struttura canali hERG1 e hEag1 vista lateralmente e dall’alto Figura6. Struttura del canale hEag1
Figura7. Struttura canale hERG1
Figura8. Esempi di tracciati elettrocardiografici relativi a sindrome del QT lungo, sindrome del QT corto e TdP.
Figura9. Struttura chimica dell’Imipramina
Figura10. Struttura chimica dell’Astemizolo Figura11. Struttura chimica del composto E-4031 Figura12. Struttura chimica del composto PD118057
Figura13. Strutture chimiche dei composti saggiati nello studio
Figura14. Fotomicrografica delle cellule A375 a bassa densità (sinistra) ed alta densità (destra) di crescita.
Figura15.Fotomicrografica cellule HaCaT
Figura16. A: Bioconversione del substato WST-1 in sale di formazano solubile. B: risultato di un esperimento visualizzato con WST-1. 1) indica i pozzetti che contengono solo cellule e mezzo, 2) indica pozzetti che contengono mezzo, cellule e WST-1: più scuro è il colore, più forte è l’attività metabolica delle cellule.
Figura 17. Elettroforesi su gel di agarosio per il prodotto di PCR con primer relativi alla GAPDH su cellule A375
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Figura18. Elettroforesi su gel di agarosio per il prodotto di PCR con primer relative al canale hERG1 su cellule A375
Figura19. Elettroforesi su gel di agarosio per il prodotto di PCR con primer relativi al canale hEag1 su cellule A375
Figura20. Elettroforesi su gel di agarosio per il prodotto di PCR con primer relativi ai canali hERG1 e hEag1 su cellule HaCaT.
Figura 21. Riduzione della vitalità cellulare della linea A375, dopo trattamento con CisPt (0,1-100 μM), dopo 48h di esposizione, 1% FBS.
Figura 22. Riduzione della vitalità cellulare della linea A375, dopo trattamento con Temozolomide (0,1-400 μM), dopo 48h di esposizione, 1% di FBS.
Figura23. Riduzione della vitalità cellulare della linea A375 dopo trattamento con E-4031 a concentrazioni comprese tra 0,1-100µM per 48 ore di esposizione, 1%FBS.
Figura24. Riduzione della vitalità delle cellule A375 in seguito a trattamento con PD118057 (0,01-100µM), 48 ore di esposizione, 1%FBS.
Figura25. Riduzione della vitalità cellulare di cellule di melanoma cutaneo A375 in seguito a trattamento con Imipramina (25-100 µM), dopo 48 ore di esposizione e 1%FBS.
Figura26. Riduzione della vitalità di cellule di melanoma cutaneo umano A375 in seguito a trattamento con Astemizolo (0,1-100 µM), 48 ore di esposizione e 1% FBS.
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Indice tabelle
Tabella1. Linee tumorali umane in cui sono espressi i due canali hEag1 e hERG1, e riferimenti alla letteratura
Tabella2. Profili sui canali hEag1 e hERG1 dei composti bloccanti e apritori saggiati.
Tabella3. Sequenze dei primer utilizzati. Tutti gli oligo sono stati forniti dalla ditta Sigma Genosys.
Tabella4. Per ciascuna coppia di oligo utilizzati sono indicati in tabella: -sequenza -Ta -n° di cicli di PCR -lunghezza dell’amplificato atteso.
Tabella5. Profilo di espressione ottenuto mediante RT-PCR qualitativa con primer relativi ai canali al potassio hERG1 e hEag1 sulle linee cellulari umane di melanoma cutaneo A375 e cheratinociti HaCaT. Simboli: + : espresso - : non espresso ± : debolmente espresso
